רכש ופרפוזיה-דה-סלוליזציה של דשים וסקולריים חזיריים בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית
Summary
הפרוטוקול מתאר את הרכש הכירורגי ולאחר מכן דה-סלוליזציה של דשי חזיר וסקולריים על ידי זלוף של דטרגנט נתרן דודציל סולפט דרך כלי הדם של הדש בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית.
Abstract
פגמים ברקמות הרכות בנפח גדול מובילים לליקויים תפקודיים ויכולים להשפיע מאוד על איכות החיים של המטופל. למרות שחזור כירורגי יכול להתבצע באמצעות העברת דש חופשית אוטולוגית או allotransplantation מרוכב כלי דם (VCA), שיטות כאלה יש גם חסרונות. בעיות כגון תחלואה באתר התורם וזמינות רקמות מגבילות את העברת הדשים החופשית האוטולוגית, בעוד שדיכוי חיסוני הוא מגבלה משמעותית של VCA. רקמות מהונדסות בניתוחים משחזרים בשיטות דה-סלולריזציה/רצלולריזציה מייצגות פתרון אפשרי. רקמות שעברו דה-תאי נוצרות בשיטות המסירות חומר תאי מקומי תוך שמירה על המיקרו-ארכיטקטורה של המטריצה החוץ-תאית הבסיסית (ECM). פיגומים תאיים אלה יכולים לאחר מכן להיות recellularized עם תאים ספציפיים לנמען.
פרוטוקול זה מפרט את שיטות הרכש והדה-סלוליזציה המשמשות להשגת פיגומים תאיים במודל חזיר. בנוסף, הוא מספק גם תיאור של תכנון והגדרת ביוריאקטור זליפה. הדשים כוללים את האומנטום החזירי, הטנזור fascia lata והאמה הרדיאלית. דה-סלוליזציה מתבצעת באמצעות פרפוזיה ex vivo של דטרגנט נתרן דודציל סולפט (SDS) בריכוז נמוך ולאחר מכן טיפול באנזים DNase ועיקור חומצה פראצטית בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית.
דה-סלוליזציה מוצלחת של רקמות מאופיינת במראה לבן-אטום של דשים באופן מקרוסקופי. דשים תאיים מראים היעדר גרעינים על כתמים היסטולוגיים והפחתה משמעותית בתכולת הדנ”א. פרוטוקול זה יכול לשמש ביעילות ליצירת פיגומי רקמות רכות שעברו דה-תאי עם ECM משומר ומיקרו-ארכיטקטורה של כלי הדם. פיגומים כאלה יכולים לשמש במחקרי recellularization הבאים ויש להם פוטנציאל לתרגום קליני בניתוחים משחזרים.
Introduction
פציעה טראומטית והסרת גידולים עלולים להוביל לפגמים גדולים ומורכבים ברקמות הרכות. פגמים אלה עלולים לפגוע באיכות החיים של המטופל, לגרום לאובדן תפקוד ולגרום לנכות קבועה. בעוד טכניקות כגון העברת דש רקמה אוטולוגית היו נהוגות בדרך כלל, בעיות עם זמינות דש ותחלואה באתר התורם הן מגבלות עיקריות 1,2,3. אלוטרנספלנטציה מרוכבת וסקולרית (VCA) היא חלופה מבטיחה המעבירה רקמות מרוכבות, למשל, שרירים, עור, כלי דם, כיחידה אחת למושתלים. עם זאת, VCA דורש דיכוי חיסוני ארוך טווח, מה שמוביל לרעילות תרופות, זיהומים אופורטוניסטיים וממאירויות 4,5,6.
פיגומים תאיים מהונדסים רקמות הם פתרון אפשרי למגבלות אלה7. ניתן להשיג פיגומים של רקמות תאיות באמצעות שיטות דה-סלולריזציה, המסירות חומר תאי מרקמות מקומיות תוך שמירה על המיקרו-ארכיטקטורה של המטריצה החוץ-תאית הבסיסית (ECM). בניגוד לשימוש בחומרים סינתטיים בהנדסת רקמות, השימוש בפיגומים שמקורם ביולוגי מציע מצע ECM ביומימטי המאפשר תאימות ביולוגית ופוטנציאל לתרגום קליני8. לאחר הדה-סלולריזציה, ה-recellularization הבא של פיגומים עם תאים ספציפיים לנמען יכול ליצור רקמות מתפקדות של כלי דם עם מעטמאוד אימונוגניות 9,10,11. על ידי פיתוח פרוטוקול יעיל להשגת רקמות תאיות באמצעות טכניקות דה-סלוליזציה של פרפוזיה, ניתן להנדס מגוון רחב של סוגי רקמות. בתורו, בנייה על טכניקה זו מאפשרת את היישום לרקמות מורכבות יותר. עד כה, דה-סלוליזציה של פרפוזיה של רקמות רכות וסקולריות נחקרה באמצעות רקמות וסקולריות פשוטות כגון דש פאסיו-עורי בעובי מלא במכרסם 12, חזיר13, ומודלים אנושיים 14, כמו גם שריר השלד של רקטוס אבדומיניס חזירי15. בנוסף, רקמות וסקולריות מורכבות עברו גם זלוף דה-תאי כפי שהוכח במודלים שלאוזן חזיר ואוזן אנושית 16,17 ובמודלים של השתלת פנים מלאות אנושיות 18.
כאן, הפרוטוקול מתאר את הדה-סלוליזציה של דשים חופשיים של כלי דם באמצעות פיגומי ECM שמקורם ביולוגית. אנו מציגים את הדה-סלוליזציה של שלושה דשים רלוונטיים מבחינה קלינית: 1) האומנטום, 2) הטנזור fascia lata, ו-3) האמה הרדיאלית, שכולם מייצגים את דשי סוסי העבודה המשמשים באופן שגרתי בניתוחי שחזור ולא נבדקו בעבר במחקרים בבעלי חיים בהקשר של דה-סלוליזציה של רקמות. דשים מהונדסים ביולוגית אלה מציעים פלטפורמה רב-תכליתית וזמינה בעלת פוטנציאל ליישומים קליניים לשימוש בתחום של תיקון ושחזור פגמים ברקמות רכות גדולות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצע משתמש בזילוף של SDS בריכוז נמוך כדי לבצע דה-סלולריזציה של מגוון דשים שמקורם בחזירים. עם הליך זה, omentum acellular, tensor fascia lata, ואת דשי האמה רדיאלי ניתן decellularized בהצלחה באמצעות פרוטוקול המעדיף SDS ריכוז נמוך. ניסויי אופטימיזציה ראשוניים קבעו כי SDS בריכוז נמוך (0.05%) בין יומיים לחמישה ימים …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא
Materials
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
Referências
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
- Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).
- Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
- Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
- Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering – Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
- Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).
- Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
- Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
- Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
- Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).
- Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
- Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).
- Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
- Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).
