细胞运输的正电子发射断层扫描成像：一种细胞放射性标记方法

Summary

这里介绍的是使用即用型放射性标记合成子[⁸⁹Zr]Zr-p-异硫氰酸基苄基-去铁胺（[⁸⁹Zr]Zr-DBN）用正电子发射断层扫描（PET）放射性同位素⁸⁹Zr（t_1/2 78.4 h）对细胞进行放射性标记的方案。用 [⁸⁹Zr]Zr-DBN 放射性标记细胞允许在给药后长达 7 天内对体内 PET 中施用的放射性标记细胞进行无创跟踪和成像。

Abstract

干细胞和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法正在成为器官再生的有前途的疗法和各种癌症的免疫疗法。尽管在这些领域取得了重大进展，但仍需学习更多知识，以更好地了解生命系统中施用治疗细胞的药代动力学和药效学。对于使用正电子发射断层扫描 （PET） 对细胞进行非侵入性体内追踪，已经开发了一种利用 89 Zr （t_1/2 78.4 h） 的新型 [⁸⁹Zr]Zr-p-异硫氰酸基苄基-去铁胺 （[⁸⁹Zr]Zr-DBN） 介导的细胞放射性标记方法。本方案描述了一种[^89Zr]Zr-DBN介导的即用型放射性标记合成子，用于直接放射性标记各种细胞，包括间充质干细胞、谱系引导的造心干细胞、肝脏再生肝细胞、白细胞、黑色素瘤细胞和树突状细胞。所开发的方法能够在给药后长达 7 天内对细胞运输进行无创 PET 成像，而不会影响放射性标记细胞的性质或功能。此外，该协议描述了[89Zr]Zr-DBN的放射合成，[89Zr]Zr-DBN的生物相容性制剂，用于放射性标记的细胞的制备，以及最后用[^89Zr]Zr-DBN对细胞进行放射性标记的逐步方法，包括成功放射性标记细胞所需的所有复杂细节。

Introduction

干细胞和嵌合抗原受体 （CAR） T 细胞疗法越来越受欢迎，并正在积极研究用于治疗各种疾病，例如心肌衰竭^1,2、视网膜变性 2、黄斑变性 2、糖尿病 ²、心肌梗塞³、⁴、⁵ 和癌症⁶、⁷、^8、9，10.在干细胞疗法的两种合理方法中，干细胞可以直接移植到疾病部位引起治疗反应，也可以引起疾病部位微环境的变化而不粘附在疾病部位以启动间接治疗反应。间接治疗反应可以通过释放修复或治疗疾病的因子来引起疾病部位微环境的变化⁵.这些干细胞治疗方法可以通过放射性标记干细胞的无创成像来评估。无创成像可以将疾病部位放射性标记细胞的摄取与治疗反应相关联，以破译直接与间接治疗反应。

此外，基于免疫细胞的疗法正在开发中，以使用 CAR T 细胞⁶、⁷、⁸、^9、10 和树突状细胞免疫疗法^11,12 治疗各种癌症。从机制上讲，在CAR T细胞免疫疗法6,7,8,9,10中^，T细胞被设计为表达与需要治疗的肿瘤上的特定抗原结合的表位。这些工程化的CAR T细胞在给药时，通过表位-抗原相互作用与肿瘤细胞上存在的特异性抗原结合。结合后，结合的CAR T细胞发生激活，然后增殖并释放细胞因子，细胞因子向宿主的免疫系统发出信号，攻击表达特异性抗原的肿瘤。相反，在树突状细胞疗法^11,12的情况下^，树突状细胞被设计成在其表面呈递特定的癌症抗原。这些经过工程改造的树突状细胞在给药时是淋巴结的家园，并与淋巴结中的T细胞结合。T细胞在与施用的树突状细胞上的特定癌症抗原结合后，发生激活/增殖，并启动宿主对表达该特定抗原的肿瘤的免疫反应。因此，通过对放射性标记的CAR T细胞和树突状细胞进行成像来评估给药的CAR T细胞向^{肿瘤部位的}运输9,10以及树突状细胞归巢到淋巴结^11,12以确定免疫疗法的疗效。此外，非侵入性细胞运输可以帮助更好地了解治疗潜力，阐明直接与间接治疗反应，并预测和监测干细胞和基于免疫细胞的疗法的治疗反应。

已经探索了细胞运输的不同成像方式 3,4,9,10,12^，包括光学成像、磁共振成像 （MRI）、单光子发射计算机断层扫描 （SPECT） 和正电子发射断层扫描 （PET）。这些技术中的每一种都有自己的优点和缺点。其中，PET因其定量性和高灵敏度而成为最有前途的方法，这对于基于成像的细胞运输中的细胞可靠定量至关重要3,4,9,10。

正电子发射放射性同位素⁸⁹Zr，半衰期为78.4 h，适用于细胞标记。它允许对细胞运输进行 PET 成像超过 1 周，并且很容易由广泛使用的低能量医用回旋加速器¹³、^14、15、^16、17 产生。此外，市售的对异硫氰酸基苄基去铁胺 （DFO-Bn-NCS） 螯合剂可用于合成 89 Zr 标记的即用型细胞标记合成子 [89 Zr]Zr-p-异硫氰酸基苄基去铁胺，也称为 [⁸⁹Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24^，25.[⁸⁹Zr]Zr-DBN 介导的细胞标记原理基于细胞膜蛋白的伯胺与 [⁸⁹Zr]Zr-DBN 的异硫氰酸酯 （NCS） 部分之间的反应，以产生稳定的共价硫脲键。

[⁸⁹锆]基于 Zr-DBN 的细胞标记和成像已发表，用于追踪各种不同的细胞，包括干细胞 18、23、25、树突状细胞¹⁸、造心干细胞¹⁹、蜕膜基质细胞 20、骨髓来源的巨噬细胞 20、外周血单核细胞 20、Jurkat/CAR T 细胞 21、肝细胞^22、24 和白细胞 ²⁵.以下方案提供了使用[^89Zr]Zr-DBN制备和细胞放射性标记的分步方法，并描述了特定细胞类型的放射性标记方案中可能需要的变化。为了更清楚起见，这里介绍的细胞放射性标记方法分为四个部分。第一部分涉及通过将 ⁸⁹Zr 与 DFO-Bn-NCS 螯合来制备 [⁸⁹Zr]Zr-DBN。第二部分描述了[⁸⁹Zr]Zr-DBN的生物相容性制剂的制备，该制剂可以很容易地用于细胞放射性标记。第三部分介绍了用于放射性标记的细胞预处理所需的步骤。细胞的预处理包括用无蛋白磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和 HEPES 缓冲的 Hanks 平衡盐溶液 （H-HBSS） 洗涤细胞，以去除外部蛋白质，这些蛋白质可能会干扰或竞争 [⁸⁹Zr]Zr-DBN 与细胞表面蛋白质上存在的伯胺的反应在放射性标记过程中。最后一部分提供了细胞实际放射性标记和质量控制分析所涉及的步骤。

Protocol

树突状细胞和黑色素瘤细胞在商业上获得18.腹腔镜肝部分切除术后从猪肝脏中分离肝细胞22,24。从骨髓抽吸物中分离干细胞18,19,26。脂肪组织来源的干细胞购自梅奥诊所罗切斯特院区的人类细胞治疗实验室23。从妙佑医疗国际罗切斯特输血医学科采?…

Representative Results

本手稿中提出的代表性结果来自先前的 [89Zr]Zr-DBN 合成和细胞放射性标记研究 18,19,22,23,24,25。简而言之，使用7.5-15μgDFO-Bn-NCS，在25-37°C下，89Zr可以在~30-60分钟内与DFO-Bn-NCS成功络合（表2）。细胞放射性标记效率在洗涤后?…

Discussion

以下是方案中需要优化以实现有效细胞放射性标记的关键步骤。在方案步骤1.2和1.3中，_{根据所采用}的[^89Zr]Zr（HPO₄）₂或[^89Zr]ZrCl4的体积，必须使用适当体积（微升）的碱;1.0 M K 2CO 3 溶液必须用于中和 [89 Zr]Zr（HPO 4）2,1.0 M Na₂CO ₃ 溶液用于中和 [⁸⁹Zr]ZrCl₄，以达到 7.5-8.0 的 pH 范围。在步骤2…

Materials

Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A996-4
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	12571063
Anion exchange column	Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany	731876	Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc., Glendale, AZ, USA	352096	Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-11904
DFO-Bn-NCS	Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA	B-705	p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	276855
Dose calibrator	Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA	5130-3234	CRC -55tR Dose Calibrator
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS)	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	14025092	For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A508P212
Melanoma cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-6475
Methanol	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	34860
Microcentrifuge tube	Eppendorf, Hamburg, Germany	30108442	Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF	R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA	415-ML-010
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	10010023	For washing cells
Saline	Covidien LLC, Mansfield, MA, USA	1020	0.9% Sterile Saline Solution
Shaker	Eppendorf, Hamburg, Germany	T1317	Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	SGI0001	iTLC-SG