Imagem por Tomografia por Emissão de Pósitrons do Tráfico Celular: Um Método de Radiomarcação Celular
Summary
Apresentamos aqui um protocolo para radiomarcar células com um radioisótopo de tomografia por emissão de pósitrons (PET), 89 Zr (t1/2 78,4 h), usando um sintetizador de radiomarcação pronto para uso, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). A radiomarcação de células com [89Zr]Zr-DBN permite rastreamento não invasivo e imagens de células radiomarcadas administradas no corpo com PET por até 7 dias após a administração.
Abstract
Terapias com células-tronco e receptores de antígenos quiméricos (CAR) estão emergindo como terapêuticas promissoras para regeneração de órgãos e como imunoterapia para vários tipos de câncer. Apesar de avanços significativos nessas áreas, ainda há muito a ser aprendido para melhor compreender a farmacocinética e farmacodinâmica das células terapêuticas administradas no sistema vivo. Para rastreamento in vivo não invasivo de células com tomografia por emissão de pósitrons (PET), um novo método de radiomarcação celular mediado por [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89 Zr]Zr-DBN) foi desenvolvido utilizando 89Zr (t1/2 78,4 h). O presente protocolo descreve um sintetizador radiomarcador mediado por [89Zr]Zr-DBN, pronto para uso, para marcação direta de uma variedade de células, incluindo células-tronco mesenquimais, células-tronco cardiopoéticas guiadas por linhagem, hepatócitos em regeneração hepática, glóbulos brancos, células de melanoma e células dendríticas. A metodologia desenvolvida permite imagens PET não invasivas do tráfego celular por até 7 dias após a administração sem afetar a natureza ou a função das células radiomarcadas. Além disso, este protocolo descreve um método passo a passo para a radiossíntese de [89 Zr]Zr-DBN, formulação biocompatível de [89 Zr]Zr-DBN, preparação de células para radiomarcação e, finalmente, a radiomarcação de células com [89Zr]Zr-DBN, incluindo todos os detalhes intrincados necessários para o sucesso da radiomarcação de células.
Introduction
As terapias com células-tronco e receptores de antígenos quiméricos (CAR) estão ganhando popularidade e estão sob investigação ativa para o tratamento de várias doenças, como insuficiência miocárdica1,2, degeneração retiniana 2, degeneração macular 2, diabetes 2, infarto do miocárdio 3,4,5 e cânceres 6,7,8,9,10. Entre as duas abordagens plausíveis das terapias com células-tronco, as células-tronco podem ser diretamente enxertadas no local da doença para causar uma resposta terapêutica ou causar alterações no microambiente do sítio da doença sem aderir ao local da doença para iniciar uma resposta terapêutica indireta. Uma resposta terapêutica indireta poderia causar alterações no microambiente do sítio da doença, liberando fatores que reparariam ou tratariam a doença5. Essas abordagens de terapias com células-tronco poderiam ser avaliadas por imagens não invasivas de células-tronco radiomarcadas. Imagens não invasivas poderiam correlacionar a captação das células radiomarcadas no local da doença com uma resposta terapêutica para decifrar a resposta terapêutica direta versus indireta.
Além disso, terapias baseadas em células imunes estão sendo desenvolvidas para tratar vários cânceres usando imunoterapia com células T CAR 6,7,8,9,10 e células dendríticas 11,12. Mecanisticamente, na imunoterapia com células T CAR 6,7,8,9,10, as células T são projetadas para expressar um epítopo que se liga a um antígeno específico em tumores que precisam ser tratados. Estas células T CAR modificadas, após a administração, ligam-se ao antígeno específico presente nas células tumorais através de uma interação epítopo-antígeno. Após a ligação, as células T CAR ligadas sofrem ativação e, em seguida, proliferam e liberam citocinas, que sinalizam o sistema imunológico do hospedeiro para atacar o tumor que expressa o antígeno específico. Em contraste, no caso das terapias com células dendríticas11,12, as células dendríticas são projetadas para apresentar um antígeno específico do câncer em sua superfície. Essas células dendríticas projetadas, quando administradas, abrigam os gânglios linfáticos e se ligam às células T nos gânglios linfáticos. As células T, ao se ligarem aos antígenos específicos do câncer nas células dendríticas administradas, sofrem ativação/proliferação e iniciam uma resposta imune do hospedeiro contra o tumor que expressa esse antígeno específico. Assim, a avaliação do tráfego de células T CAR administradas para um sítio tumoral9,10 e o homing de células dendríticas para os linfonodos11,12 é possível por meio de imagens de células T CAR radiomarcadas e células dendríticas para determinar a eficácia da imunoterapia. Além disso, o tráfico de células não invasivas pode ajudar a compreender melhor o potencial terapêutico, esclarecer a resposta terapêutica direta versus indireta e prever e monitorar a resposta terapêutica de terapias baseadas em células-tronco e células imunes.
Diferentes modalidades de imagem para o tráfego celular têm sido exploradas3,4,9,10,12, incluindo imagens ópticas, ressonância magnética (RM), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT) e tomografia por emissão de pósitrons (PET). Cada uma dessas técnicas tem suas próprias vantagens e desvantagens. Dentre estas, a PET é a modalidade mais promissora devido à sua natureza quantitativa e alta sensibilidade, essenciais para a quantificação confiável de células no tráfico celular baseado em imagens 3,4,9,10.
O radioisótopo emissor de pósitrons 89Zr, com meia-vida de 78,4 h, é adequado para marcação celular. Permite imagens de PET do tráfego celular por mais de 1 semana e é prontamente produzido por cíclotrons médicos de baixa energia amplamente disponíveis 13,14,15,16,17. Além disso, um quelante p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine (DFO-Bn-NCS) adequadamente funcionalizado está comercialmente disponível para a síntese de um sintetizador de marcação celular marcado com 89 Zr, pronto para uso, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine, também conhecido como [89Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24,25. O princípio da marcação celular mediada por [89 Zr]Zr-DBN é baseado em uma reação entre aminas primárias de proteínas da membrana celular e a porção de isotiocianato (NCS) de [89Zr]Zr-DBN para produzir uma ligação covalente estável de tiouréia.
[89Zr] A marcação e a imagem de células baseadas em Zr-DBN foram publicadas para rastrear uma variedade de células diferentes, incluindo células-tronco 18,23,25, células dendríticas18, células-tronco cardiopoéticas19, células estromais deciduais 20, macrófagos derivados da medula óssea 20, células mononucleares do sangue periférico 20, células T Jurkat/CAR 21, hepatócitos 22,24 e leucócitos 25. O protocolo a seguir fornece métodos passo a passo de preparação e marcação radiocelular com [89Zr]Zr-DBN e descreve mudanças que podem ser necessárias no protocolo de radiomarcação para um tipo específico de célula. Para maior clareza, o método de radiomarcação celular aqui apresentado é dividido em quatro seções. A primeira seção trata da preparação de [89 Zr]Zr-DBN por quelação de 89Zr com DFO-Bn-NCS. A segunda seção descreve a preparação de uma formulação biocompatível de [89Zr]Zr-DBN que pode ser prontamente usada para marcação radiocelular celular. A terceira seção aborda as etapas necessárias para o pré-condicionamento das células para radiomarcação. O pré-condicionamento das células envolve a lavagem das células com solução salina tamponada com fosfato livre de proteínas (PBS) e solução salina balanceada de Hanks tamponada com HEPES (H-HBSS) para remover proteínas externas, que podem interferir ou competir com a reação de [89Zr]Zr-DBN com aminas primárias presentes nas proteínas de superfície celular durante a radiomarcação. A seção final fornece as etapas envolvidas na marcação radioativa real das células e na análise do controle de qualidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
A seguir estão etapas críticas no protocolo que precisam de otimização para uma marcação radiográfica celular eficaz. Nas etapas 1.2 e 1.3 do protocolo, dependendo do volume de [89 Zr]Zr(HPO 4)2 ou [89Zr]ZrCl4 empregado, um volume apropriado (microlitros) de base deve ser usado; A solução 1,0 M K2 CO 3 deve ser usada para a neutralização da solução de [89 Zr]Zr(HPO 4)2 e 1,0 M Na2 CO3 para a neutralização de …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 e DOE DE-SC0008947 grants, Agência Internacional de Energia Atômica, Viena, Mayo Clinic Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, e Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, Rochester, MN. Todas as figuras foram criadas usando BioRender.com.
Materials
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A996-4 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 12571063 | |
| Anion exchange column | Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany | 731876 | Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge |
| Conical centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc., Glendale, AZ, USA | 352096 | Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes |
| Dendritic cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-11904 | |
| DFO-Bn-NCS | Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA | B-705 | p-SCN-Bn-Deferoxamine |
| DMSO | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 276855 | |
| Dose calibrator | Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA | 5130-3234 | CRC -55tR Dose Calibrator |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2020 | |
| Hanks Balanced Salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 14025092 | For preparation of H-HBSS |
| Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A508P212 | |
| Melanoma cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-6475 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 34860 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30108442 | Protein LoBind microcentrifuge tube |
| Murine GM-CSF | R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA | 415-ML-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 10010023 | For washing cells |
| Saline | Covidien LLC, Mansfield, MA, USA | 1020 | 0.9% Sterile Saline Solution |
| Shaker | Eppendorf, Hamburg, Germany | T1317 | Thermomixer |
| Silica gel-rad-TLC paper sheet | Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA | SGI0001 | iTLC-SG |
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