Essentiële componenten van Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcriptie Assays
Summary
In vitro transcriptie assays kunnen de mechanismen van transcriptionele regulatie in Borreliella burgdorferi ontcijferen. Dit protocol beschrijft de stappen om B. burgdorferi RNA polymerase te zuiveren en in vitro transcriptiereacties uit te voeren. Experimentele benaderingen met behulp van in vitro transcriptietests vereisen betrouwbare zuivering en opslag van actief RNA-polymerase.
Abstract
Borreliella burgdorferi is een bacteriële ziekteverwekker met beperkte metabole en genomische repertoires. B. burgdorferi transiteert extracellulair tussen gewervelde dieren en teken en hermodelleert zijn transcriptionele profiel drastisch om te overleven in ongelijksoortige omgevingen tijdens infectie. Een focus van B. burgdorferi-studies is om duidelijk te begrijpen hoe de bacterie reageert op zijn omgeving door transcriptieveranderingen. In vitro transcriptietesten maken het mogelijk om de basismechanismen van transcriptionele regulatie biochemisch te ontleden. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat B. burgdorferi RNA-polymerasezuivering en -opslag, sigmafactorzuivering, DNA-sjabloongeneratie en in vitro transcriptietests beschrijft. Het protocol beschrijft het gebruik van RNA-polymerase gezuiverd uit B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC is een eerder gepubliceerde stam met een 10XHis-tag op het rpoC-gen dat codeert voor de grootste subeenheid van het RNA-polymerase. In vitro transcriptie assays bestaan uit het RNA polymerase gezuiverd uit stam 5A4-RpoC, een recombinante versie van de huishouding sigma factor RpoD, en een PCR-gegenereerde dubbelstrengs DNA sjabloon. Hoewel de eiwitzuiveringstechnieken en benaderingen voor het samenstellen van in vitro transcriptietests conceptueel goed worden begrepen en relatief vaak voorkomen, verschillen de behandelingsoverwegingen voor RNA-polymerasen vaak van organisme tot organisme. Het hier gepresenteerde protocol is ontworpen voor enzymatische studies op het B. burgdorferi RNA-polymerase. De methode kan worden aangepast om de rol van transcriptiefactoren, promotors en posttranslationele modificaties op de activiteit van het RNA-polymerase te testen.
Introduction
De ziekte van Lyme en relapsing fever worden veroorzaakt door spirocheetpathogenen in de geslachten Borrelia en Borreliella 1,2,3. De ziekte van Lyme is een prominente door vectoren overgedragen ziekte in Noord-Amerika en daarom is Borreliella burgdorferi een prominent modelorganisme om spirocheetbiologie te bestuderen 4,5. Onderzoek naar de B. burgdorferi-mechanismen van transcriptionele regulatie heeft tot doel de aanpassingen aan veranderingen in de omgeving beter te begrijpen terwijl het fietst tussen zijn tekenvector en zoogdiergastheren 6,7. Veranderingen in pH, temperatuur, osmolariteit, beschikbaarheid van voedingsstoffen, vetzuren met een korte keten, organische zuren en opgeloste zuurstof- en koolstofdioxideniveaus moduleren de expressie van genen die belangrijk zijn voor B. burgdorferi om te overleven in zijn geleedpotige vector en om dieren te infecteren 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Het koppelen van deze reacties aan stimuli met regulerende mechanismen is een belangrijk aspect geweest van het onderzoek van B. burgdorferi 19.
Transcriptiefactoren en sigmafactoren regelen de transcriptie van genen die cellulaire processen uitvoeren. Lyme en relapsing fever spirocheten herbergen een relatief schaarse set transcriptiefactoren en alternatieve sigmafactoren. Desondanks zijn er complexe transcriptionele veranderingen die B. burgdorferi-reacties op de omgeving sturen20,21,22. De specifieke mechanismen die transcriptionele veranderingen in B. burgdorferi veroorzaken als reactie op veranderingen in de omgeving, blijven onduidelijk. In vitro transcriptie assays zijn krachtige hulpmiddelen voor het gebruik van een biochemische benadering om de functie en regulerende mechanismen van transcriptiefactoren en sigmafactoren te testen23,24,25,26.
Een in vitro transcriptietestsysteem met behulp van het B. burgdorferi RNA-polymerase werd onlangs vastgesteld24. Omdat bacteriën vaak unieke cellulaire fysiologieën hebben, reageren RNA-polymerasen van verschillende soorten en geslachten verschillend op enzymzuivering, enzymopslag en reactiebufferomstandigheden27. B. burgdorferi is ook genetisch ver verwijderd van de vele bacteriesoorten waarin RNA-polymerasen zijn bestudeerd20. Aspecten van enzympreparatie zoals lysis, wassen en elutiebuffercondities, opslagbuffer, in vitro transcriptiereactiebuffer en de methode van testconstructie kunnen allemaal de RNA-polymeraseactiviteit veranderen. Hierin bieden we een protocol voor de zuivering van RNA-polymerase en sigmafactor RpoD, de productie van lineaire dubbelstrengs DNA-sjabloon en de constructie van in vitro transcriptietests om reproduceerbaarheid tussen laboratoria met behulp van dit systeem te vergemakkelijken. We beschrijven een voorbeeldreactie om het lineaire bereik voor RpoD-afhankelijke transcriptie aan te tonen en bespreken beperkingen en alternatieven voor deze aanpak.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro transcriptietests geconstrueerd met behulp van het gepresenteerde protocol werden onlangs gebruikt om de rol van een transcriptiefactor in B. burgdorferi te bestuderen en kunnen worden toegepast om vergelijkbare experimenten te bouwen met behulp van andere transcriptiefactoren, sigmafactoren en moleculen23. Zodra actief RNA-polymerase uit B. burgdorferi is verkregen en de activiteit ervan is gedetecteerd, kunnen componenten en omstandigheden binnen de in vit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Health Sciences Strategic Investment Fund Faculty Development Grant van Creighton University. De B. burgdorferi RpoC-His10X stam werd vriendelijk verstrekt door Dr. D. Scott Samuels van de Universiteit van Montana. De E. coli-stam met het pMAL-C5X-plasmide dat codeert voor een maltose-bindend eiwit-gelabeld rpoD-allel werd vriendelijk verstrekt door Dr. Frank Gherardini van Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.
Materials
| 0.45 micron syringe filter | Thermo Scientific | 726-2545 | Step 1.7 and 2.3 |
| 50 mL conical tubes | MidSci | C50B | Step 1.3, and subsequent steps |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Thermo Scientific | 3119-0050PK | Step 1.2 |
| 500 mL Centrifuge bottles | Thermo Scientific | 3120-9500PK | Step 1.1 |
| B-PER and instruction manual | Thermo Scientific | 78248 | Step 1.4 and 2.2 |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Step 2.6 |
| Centrifugal filters 10 Kd cutoff | Millipore Sigma | UFC8010 | Step 1.11 and 2.11 |
| Cobalt resin and instruction manual | Thermo Scientific | 89969 | Step 1.9 |
| Dithiothreitol | Acros Organics | 426380500 | Step 1.4 and subsequent steps |
| Dnase (Nuclease) | Millipore Sigma | 70746 | Step 1.4 and 2.2 |
| Factor Xa Protease | Haematologic Technologies | HCXA-0060 | Step 2.6 |
| GE Typhoon 5 Phosphoimager | GE lifesciences | Multiple | Step 4.15 |
| Gel Imager | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| H2O for in vitro transcription | Fisher Scientific | 7732-18-5 | Step 3.2 and 3.3 |
| high fidelity PCR kit | New England Biolabs | M0530S | Step 3.1 |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | Step 1.1, and subsequent steps | |
| HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva Life Sciences | 17040601 | Step 2.8 |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-100G | Step 1.9 |
| Lysozyme | Thermo Scientific | 90082 | Step 1.4 and 2.2 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | S25401 | Step 4.1 |
| Manganese chloride | Fisher Scientific | S25418 | Step 4.1 |
| Mini protean tetra cell | Bio-Rad | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | Step 4.1 |
| NTP mixture | Thermo Scientific | R0481 | Step 4.1 |
| PCR purification kit | Qiagen | 28506 | Step 3.2 |
| PCR tubes | MidSci | PR-PCR28ACF | Step 1.12 |
| PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual | Cytiva | 17085101 | Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column) |
| pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual |
New England Biolabs | E8200S | Step 2.1 |
| Polyacrylamide gels AnyKD | Bio-Rad | 456-8125 | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Step 4.1 |
| Protease inhibitor | Thermo Scientific | 78425 | Step 1.4 and 2.2 |
| Radiolabeled ATP | Perkin Elmer | BLU503H | Step 4.2 |
| RNA Loading Dye, (2x) | New England Biolabs | B0363S | Step 4.13 |
| Rnase inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | Step 4.1 |
| Spectrophotometer | Biotek | Mutiple | Step 1.13 and subsequent protien quality check steps |
| TBE-Urea gels 10 percent | Bio-Rad | 4566033 | Step 4.14 |
Referências
- Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
- Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
- Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
- Barbour, A. G., Hayes, S. F. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).
- Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
- Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
- Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
- Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
- Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
- Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
- Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
- Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
- Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
- Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
- Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
- Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
- Samuels, D. S., et al. Gene regulation and transcriptomics. Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).
- Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
- Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
- Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
- Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
- Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
- Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
- Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
- Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. Genetic transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).
- Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
- Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
- Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
- Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
- Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
- Borbley, G., Schneider, G. Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).
- Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
- Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
- Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
- Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. Real-time measurement of in vitro transcription. Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).
- Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).
