Componenti essenziali di Borreliella (Borrelia) burgdorferi Saggi di trascrizione in vitro

Summary

I saggi di trascrizione in vitro possono decifrare i meccanismi di regolazione trascrizionale in Borreliella burgdorferi. Questo protocollo descrive i passaggi per purificare la RNA polimerasi di B. burgdorferi ed eseguire reazioni di trascrizione in vitro . Gli approcci sperimentali che utilizzano saggi di trascrizione in vitro richiedono una purificazione e una conservazione affidabili della RNA polimerasi attiva.

Abstract

La Borreliella burgdorferi è un patogeno batterico con repertori metabolici e genomici limitati. B. burgdorferi transita extracellulare tra vertebrati e zecche e rimodella drammaticamente il suo profilo trascrizionale per sopravvivere in ambienti disparati durante l’infezione. Un obiettivo degli studi di B. burgdorferi è capire chiaramente come i batteri rispondono al suo ambiente attraverso cambiamenti trascrizionali. I saggi di trascrizione in vitro consentono di sezionare biochimicamente i meccanismi di base della regolazione trascrizionale. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive la purificazione e lo stoccaggio della RNA polimerasi di B. burgdorferi , la purificazione del fattore sigma, la generazione di modelli di DNA e saggi di trascrizione in vitro . Il protocollo descrive l’uso della RNA polimerasi purificata da B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC è un ceppo precedentemente pubblicato che ospita un tag 10XHis sul gene rpoC che codifica per la più grande subunità della RNA polimerasi. I saggi di trascrizione in vitro consistono nella RNA polimerasi purificata dal ceppo 5A4-RpoC, una versione ricombinante del fattore sigma RpoD e un modello di DNA a doppio filamento generato dalla PCR. Mentre le tecniche di purificazione delle proteine e gli approcci all’assemblaggio di saggi di trascrizione in vitro sono concettualmente ben compresi e relativamente comuni, le considerazioni sulla gestione delle RNA polimerasi spesso differiscono da organismo a organismo. Il protocollo qui presentato è progettato per studi enzimatici sulla polimerasi RNA di B. burgdorferi. Il metodo può essere adattato per testare il ruolo dei fattori di trascrizione, dei promotori e delle modificazioni post-traduzionali sull’attività della RNA polimerasi.

Introduction

La malattia di Lyme e la febbre recidivante sono causate da patogeni della spirocheta nei generi Borrelia e Borreliella ^1,2,3. La malattia di Lyme è una malattia trasmessa da vettori in Nord America e, di conseguenza, Borreliella burgdorferi è un organismo modello di spicco per studiare la biologia della spirocheta ^4,5. Le indagini sui meccanismi di regolazione trascrizionale di B. burgdorferi mirano a comprendere meglio i suoi adattamenti ai cambiamenti nell’ambiente mentre ciclicamente tra il suo vettore zecca e gli ospiti dei mammiferi ^6,7. Le variazioni di pH, temperatura, osmolarità, disponibilità di nutrienti, acidi grassi a catena corta, acidi organici e livelli di ossigeno disciolto e anidride carbonica modulano l’espressione di geni che sono importanti per B. burgdorferi per sopravvivere nel suo vettore artropode e infettare gli animali 8,9,10,11,12,13,14,15^,16,17,18. Collegare queste risposte agli stimoli con i meccanismi regolatori è stato un aspetto importante della ricerca di B. burgdorferi ¹⁹.

I fattori di trascrizione e i fattori sigma controllano la trascrizione dei geni che svolgono processi cellulari. Le spirochete di Lyme e della febbre recidivante ospitano un insieme relativamente scarso di fattori di trascrizione e fattori sigma alternativi. Nonostante ciò, ci sono complessi cambiamenti trascrizionali che dirigono le risposte di B. burgdorferi all’ambiente^20,21,22. I meccanismi specifici che guidano i cambiamenti trascrizionali in B. burgdorferi in risposta ai cambiamenti ambientali rimangono poco chiari. I saggi di trascrizione in vitro sono potenti strumenti per impiegare un approccio biochimico per analizzare la funzione e i meccanismi di regolazione dei fattori di trascrizione e dei fattori sigma^23,24,25,26.

Un sistema di saggio di trascrizione in vitro utilizzando la B. burgdorferi RNA polimerasi è stato recentemente stabilito²⁴. Poiché i batteri hanno spesso fisiologie cellulari uniche, le RNA polimerasi di diverse specie e generi rispondono in modo diverso alla purificazione enzimatica, allo stoccaggio enzimatico e alle condizioni del tampone di reazione²⁷. B. burgdorferi è anche geneticamente distante dalle molte specie batteriche in cui sono state studiate le RNA polimerasi²⁰. Aspetti della preparazione enzimatica come la lisi, le condizioni del tampone di lavaggio ed eluizione, il tampone di stoccaggio, il tampone di reazione di trascrizione in vitro e il metodo di costruzione del saggio possono alterare l’attività della RNA polimerasi. Qui, forniamo un protocollo per la purificazione della RNA polimerasi e del fattore sigma RpoD, la produzione di modelli lineari di DNA a doppio filamento e la costruzione di saggi di trascrizione in vitro per facilitare la riproducibilità tra laboratori che utilizzano questo sistema. Descriviamo in dettaglio una reazione di esempio per dimostrare l’intervallo lineare per la trascrizione dipendente da RpoD e discutiamo i limiti e le alternative a questo approccio.

Protocol

1. Purificazione della RNA polimerasi e preparazione dello stock di RNA polimerasi Raccogliere il pellet cellulare da 2-4 L di B. burgdorferi RpoC-His10X coltivato in mezzo BSKII in ambiente microaerofilo (34 °C, 5% CO 2, 3% O 2) ad una densità di2-4 x 107 cellule/ml utilizzando i protocolli di raccolta cellulare precedentemente descritti28,29. Eseguire la centrifugazione a 10.000 x g…

Representative Results

In una reazione di trascrizione in vitro in cui la fase limitante della reazione è l’inizio della trascrizione mediata dal fattore sigma, l’attività di trascrizione dovrebbe aumentare linearmente con la quantità di fattore sigma. Presentiamo la preparazione di esperimenti di trascrizione in vitro testando una gamma di concentrazioni di RpoD insieme a due concentrazioni di RNA polimerasi per osservare il segnale variabile risultante dall’incorporazione di nucleotidi radiomarcati nei prodotti di RNA. V…

Discussion

I saggi di trascrizione in vitro costruiti utilizzando il protocollo presentato sono stati recentemente utilizzati per studiare il ruolo di un fattore di trascrizione in B. burgdorferi e possono essere applicati per costruire esperimenti simili utilizzando altri fattori di trascrizione, fattori sigma e molecole²³. Una volta ottenuta la RNA polimerasi attiva da B. burgdorferi e rilevata la sua attività, i componenti e le condizioni all’interno dei saggi di trascrizione <…

Materials

0.45 micron syringe filter	Thermo Scientific	726-2545	Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes	MidSci	C50B	Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes	Thermo Scientific	3119-0050PK	Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles	Thermo Scientific	3120-9500PK	Step 1.1
B-PER and instruction manual	Thermo Scientific	78248	Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride	Fisher Scientific	10035-04-8	Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff	Millipore Sigma	UFC8010	Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual	Thermo Scientific	89969	Step 1.9
Dithiothreitol	Acros Organics	426380500	Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)	Millipore Sigma	70746	Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease	Haematologic Technologies	HCXA-0060	Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager	GE lifesciences	Multiple	Step 4.15
Gel Imager	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription	Fisher Scientific	7732-18-5	Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit	New England Biolabs	M0530S	Step 3.1
High-speed centrifuge	Eppendorf		Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva Life Sciences	17040601	Step 2.8
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750-100G	Step 1.9
Lysozyme	Thermo Scientific	90082	Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride	Fisher Scientific	S25401	Step 4.1
Manganese chloride	Fisher Scientific	S25418	Step 4.1
Mini protean tetra cell	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40	Thermo Scientific	85124	Step 4.1
NTP mixture	Thermo Scientific	R0481	Step 4.1
PCR purification kit	Qiagen	28506	Step 3.2
PCR tubes	MidSci	PR-PCR28ACF	Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual	Cytiva	17085101	Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual	New England Biolabs	E8200S	Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD	Bio-Rad	456-8125	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Step 4.1
Protease inhibitor	Thermo Scientific	78425	Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP	Perkin Elmer	BLU503H	Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x)	New England Biolabs	B0363S	Step 4.13
Rnase inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	Step 4.1
Spectrophotometer	Biotek	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent	Bio-Rad	4566033	Step 4.14