Summary
중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 대유행에 대응하여 천 안면 가리개, 면 스크럽 및 데님 바지의 온수 세탁의 바이러스 소독 효능을 테스트하기 위한 실험실 프로토콜이 개발되었습니다. Phi6 바이러스(박테리오파지)를 소독 효능을 시험하기 위한 유기체로 사용하였다.
Abstract
이 프로토콜은 바이러스 소독에 대한 데이터를 생성하는 세탁 연구를 수행하기 위한 실험실 프로세스의 예를 제공합니다. 이 프로토콜은 코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19) 대유행 기간 동안 연구를 위해 개발되었지만 다른 바이러스 소독 연구에 적용 할 수있는 프레임 워크로 의도되었습니다. 테스트 바이러스를 준비하고, 테스트 물질을 접종하고, 세탁 공정으로 인해 세척 된 품목의 시각적 및 무결성 변화를 평가하고, 바이러스 부하 감소를 정량화하는 단계를 보여줍니다. 또한 프로토콜은 여러 세탁 주기 후에 개인 보호 장비(PPE) 품목의 물질적 무결성을 추적하기 위해 기록해야 하는 오염 및 측정/관찰에 의해 실험이 편향되지 않도록 하는 데 필요한 품질 관리 샘플을 설명합니다. 프로토콜과 함께 제시된 대표적인 결과는 면 스크럽, 데님 및 면 얼굴 가리개 재료에 접종된 Phi6 박테리오파지를 사용했으며 온수 세탁 및 건조 공정이 모든 샘플에 대해 바이러스 부하를 3로그(99.9%) 감소시켰음을 나타냅니다(3로그 감소는 미국 환경 보호국의 제품 성능 테스트 지침 810.2200의 소독제 성능 메트릭). 바이러스 부하의 감소는 PPE 품목의 여러 위치에서 균일했습니다. 이 바이러스 소독 효능 테스트 프로토콜의 결과는 과학계가 다른 유형의 테스트 바이러스 및 세탁 절차에 대한 가정 세탁의 효과를 탐색하는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
코로나바이러스 감염증 2019(COVID-19) 팬데믹은 전례 없는 글로벌 공급망 중단을 초래했으며 필수 개인 보호 장비(PPE)1,2,3를 포함한 많은 품목의 심각한 부족을 초래했습니다. 고위험 직업에 종사하는 사람들은 권장 위기 수용 능력 전략을 사용하여 적응해야 했으며 대중은 주로 소스 제어를 위해 천 재료 안면 가리개와 같은 비특수 품목의 사용을 채택했지만 착용자에게 일부 호흡기 보호 기능을 제공했습니다. 미국에서는 공급 부족 동안 이러한 고위험 직업(예: 의료) 중 일부를 위해 특수 호흡기 보호구(즉, N95와 같은 여과 안면 호흡기(FFR))가예약되었습니다4. 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-Cov-2) 전파에 대해 알려진 바가 거의 없었을 때, 팬데믹 초기에 다양한 다른 유형의 의류 재료도 장벽 보호로 고려되었습니다5. 착용자 보호를 위해 사용되는 직물의 다양성으로 인해 이러한 품목의 사용, 재사용 및 소독/오염 제거에 대한 질문이 제기되었습니다. 미국에서는 얼굴 가리개 및 기타 의류 품목의 일상적인 가정용 기계 세탁이 해당 표면의 바이러스를 전염성이 없게 만든다는 것이 일반적으로 받아 들여졌지만이 주장을 입증 할 데이터가 거의 없었으며 테스트를위한 발표 된 실험실 프로토콜이 부족했습니다. 여기에 제시된 연구 프로토콜의 목적은 바이러스 소독에 대한 데이터를 생성하는 세탁 연구를 수행하기 위한 실험실 프로세스의 예를 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 COVID-19 대유행 기간 동안 연구를 위해 개발되었지만 다른 바이러스 소독 연구에 적용할 수 있는 프레임워크로 의도되었습니다.
질병 전파에서 의복의 역할은 정량화하기 어려운 개념입니다. 가정 위생에 관한 국제 과학 포럼은 가정 위생 관행의 위험 평가와 함께 전염병 확산에서 의복의 역할에 대한 검토를 수행함으로써이 도전적인 작업을 시도했습니다6. 이 연구에는 양모 및면 7,8,9,10,11과 같은 다양한 유형의 직물에서 다양한 바이러스 균주의 생존을 조사한 여러 과학적 연구에 대한 검토가 포함되었습니다. 각 연구는 백시니아, 소아마비 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 인플루엔자 바이러스를 포함한 다양한 유형의 바이러스에 초점을 맞추 었습니다. 직물에 있는 다른 바이러스의 생존 시간은 바이러스-재료 조합에 따라 30분에서 5개월 사이였습니다. 몇몇 연구는 또한 물질에서 손으로 바이러스 오염이 전달되는 것을 보여주었습니다. 간행물의 일환으로 효과적인 세탁은 전염을 줄이는 중요한 관리 기술로 논의되었지만 질병 부담 감소에 대한 세탁의 영향의 크기는 특정 바이러스 오염 물질에 달려 있으며 정량화하기 어렵다는 것을 인식했습니다 7,8,9,10,11.
세탁 공정은 화학적, 물리적 및 열처리 공정을 사용하여 미생물을 파괴합니다. 예를 들어, 비누와 세제는 토양을 분리 할 수 있으며 화학적으로 매개 된 항균 작용을 부여 할 수 있습니다. 물리적으로, 희석 및 교반은 바이러스 부하의 감소에 도움이 될 수 있습니다. 온도와 세제가 있거나 없는 산업 및 가정용 세탁 주기를 사용하여 면 견본에서 인간 코로나바이러스 HCoV-OC43의 지속성을 조사한 연구에서는 세제 없이 가열되지 않은 물로 세척할 때 검출 가능한 바이러스가 발견되지 않았지만 토양 부하(인공 타액)가 있는 경우 가정용 세척 주기에는 샘플에 검출되지 않은 바이러스 적재가 있는 세제가 필요했습니다12. 뜨거운 물 자체는 또한 일부 미생물을 파괴하는 효과적인 수단을 제공할 수 있다(13, 14).
현재 세탁 관행의 상태를 요약 한 최근 간행물에서 직물 구성, 보관 조건, 먼지 하중, 세탁 온도 및 시간, 건조 온도와 같은 많은 요소가 세탁의 글로벌 관행에서 다양한 것으로 확인되었습니다15. 세탁은 인구의 많은 사람들에게 일반적인 청소 방법이지만, 기존 관행의 이러한 큰 차이로 인해 품목이 바이러스에 의해 오염될 수 있고 어렵고 희박할 때 이를 안전하고 효과적으로 수행하는 방법에 대한 자세한 지침을 발행합니다. COVID-19 대유행 기간 동안 미국 질병 통제 예방 센터 (CDC)는 주택 소유자16,17을위한 물품 세탁 방법에 대한 지침을 발표했습니다. 이 세탁 지침의 대부분은 박테리아 소독18,19에 대한 여러 오래된 연구를 기반으로 했으며 세제20,21로 물에서 비활성화된 외피 바이러스를 발견한 여러 벤치탑 연구에 의해 뒷받침되었습니다. 지침은 1) 세제에 대한 제조업체의 지침을 따르고, 2) 가장 따뜻한 적절한 물 설정을 사용하고, 3) 품목을 완전히 건조시키는 것으로 요약할 수 있습니다. 이러한 권장 사항의 근거는 세제로 가능한 가장 따뜻한 주기로 세척하고 완전히 건조(가능한 경우 열로)하면 SARS-CoV-2 바이러스가 죽는다는 것입니다.
세탁 공정에서 가능한 변형의 수는 변수를 분리하고 특정 공정의 바이러스 소독 효능을 테스트할 수 있도록 여기에 제시된 것과 같은 균일한 프로토콜을 필요로 합니다. 교육용 비디오와 결합 된이 프로토콜의 목적은 다른 연구 연구에서 복제를위한 실험실 기반 온수 세탁 프로세스를 시연하는 것입니다. 또한 이 바이러스 소독 효능 테스트의 결과는 바이러스 기반 전염병 동안 가정 세탁의 효과에 대한 소비자 신뢰를 구축해야 합니다.
Protocol
Phi6는 ~1mL 냉동 분취량으로 협력자 실험실에서 받았고 사용 전까지 -80°C에서 보관했습니다. 처음에는 더 많은 바이러스 스톡을 전파하는 데 사용되었으며 이후 사용 될 때까지 -80 ° C에서 보관되었습니다. Phi6는 모델 외피 바이러스로서 통상적으로 사용되고, 높은 역가로 전파될 수 있고, 시험22,23,24를 수행하기 위해 낮은 생물안전성 수준의 실험실을 필요로 하기 때문에 시범 바이러스로서 선택되었다.
1. 바이러스 저장액 준비
- 박테리오파지 Phi6를 박테리아 숙주 슈도모나스 척수린에 전파하여 하기와 같이 변형된 트립신 대두 한천 배지 제제 및 연질 한천 오버레이 방법을 사용한다.
- 변형된 트립신성 대두 한천을 표 1 의 성분을 계량하고 탈이온수에서 혼합하여 준비합니다.
- 광학 밀도(OD 600)가 0.9 - 1.5인 P. syringae 1mL 분취량을 변형된 트립신 대두 브로스 100mL(표 1)에 첨가하고 실온(20-26°C)에서 ~260rpm의 진탕 인큐베이터에서 배양하여 P. syringae의 야간 배양물을 준비합니다.
- 변형된 트립신성 대두 한천(~6mL)을 시험관에 넣고 오토클레이브 가능한 캡으로 덮어 연질 한천 튜브를 준비합니다. 사용할 때까지 4 ° C에서 보관하십시오. 연질 한천 튜브를 121°C에서 15분 동안 오토클레이브하여 한천을 녹입니다. 도금될 때까지 48°C에서 유지합니다. 48°C에서의 평형은 그렇지 않으면 바이러스가 분석에서 불활성화될 수 있는 것이 중요합니다.
- 희석되지 않은 농축 바이러스 분취량 1mL를 연질 한천에 첨가하고 100μL의 로그 상 (OD600 0.9 내지 1.5) P. syringae 배양물을 첨가한다. 응고된 100 mm 직경의 변형된 트립틱 소이 한천 플레이트의 표면 상에 부드러운 한천을 붓는다. 기포 및/또는 유출을 방지하려면 플레이트를 부드럽게 소용돌이치게 하여 부드러운 한천을 고체 한천 표면에 고르게 분산시키고 실온에서 밤새 배양합니다.
- 멸균 세포 스프레더로 3개의 플레이트의 내용물25 개를 SM 버퍼 15mL가 포함된 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 부드럽게 긁어냅니다. 와류 튜브를 1-2분 동안 최대 설정으로 하여 한천을 분해한 다음 7,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
- 상청액을 제거하고 0.2μm 주사기 필터를 통해 여과합니다. 사용할 때까지 -80°C에서 냉동 바이알에 1mL 분취량을 보관하십시오.
2. PPE 항목에 대한 사전 테스트 육안 평가 수행
- 각 PPE 품목을 깨끗하고 매끄러운 표면(예: 일회용 종이 라이너로 덮인 실험실 벤치)에 놓습니다. 각 PPE 항목을 세 배로 평가합니다.
- PPE 검사 중에 적절한 조명을 확인하십시오. 다양한 위치에서 씻지 않은 품목의 길이와 너비를 측정하고 기록합니다(그림 1).
그림 1. PPE 사전 테스트 평가 측정 위치. 데님, 스크럽 및 얼굴 가리개 위치(세탁 과정에서 재료 변경 사항을 추적하기 위해 길이를 기록한 위치). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 쿠폰 준비
- PPE를 절단하여 2cm x 4cm 테스트 쿠폰을 만들고, 얼굴 가리개당 2개의 쿠폰(얼굴 가리개 3개 테스트), 데님 바지당 5개의 쿠폰(데님 바지 3개 테스트), 스크럽 셔츠당 3개의 쿠폰(스크럽 3개 테스트)을 준비합니다.
- 접종되지 않고 세탁될 각 재료 유형에 대해 2cm x 4cm 절차상의 빈 쿠폰 세트(풀 사이즈 PPE 품목 1개당 세트)를 준비하십시오. 얼굴 가리개 실험의 매일 쿠폰 2 개, 데님 실험의 매일 5 개의 쿠폰, 매일 스크럽 실험을위한 3 개의 쿠폰을 준비하십시오.
- 접종 할 2cm x 4cm 포지티브 컨트롤 쿠폰 세트를 준비하지만 세탁하지 마십시오. 얼굴 가리개 실험의 매일 2 개의 쿠폰 (3 개의 얼굴 가리개 테스트), 데님 실험의 매일 5 개의 쿠폰 (3 개의 데님 바지 테스트), 스크럽 실험의 매일 3 개의 쿠폰 (3 개의 스크럽 테스트), 3 개의 스테인레스 스틸 쿠폰을 준비하십시오.
참고: 항목의 크기에 따라 다른 반복실험 횟수가 선택되었습니다. 예를 들어, 얼굴 가리개에 5 개의 쿠폰을 부착하는 것은 물리적으로 어렵고 2 개의 쿠폰은 데님 바지의 제한된 영역을 나타냅니다. 위치는 적용 범위를 최대화하고 세탁 중에 접힐 수 있고 청소하기 더 어려운 구역에서 선택되었습니다.
4. 접종 실시
- 총 부피의 10mL의 1x 인산염 완충 식염수에 쇠고기 추출물 1g을 용해시켜 10% 쇠고기 추출물 용액을 제조한다. 필터는 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 전체 부피를 살균합니다.
- 섹션 1에서 제조한 바이러스 원액을 실온에서 해동한다. 사용 당일, 해동된 Phi6 스톡 100μL를 10% 쇠고기 추출물 용액 900μL에 추가합니다.
- 10μL 용액 방울을 PPE 항목에 피펫팅하고 피펫 끝을 사용하여 액적을 펴서 ~107 PFU/샘플로 테스트 쿠폰 및 양성 대조군 쿠폰을 접종합니다. PPE 재질에 따라 액적이 다르게 분리되고 재응집됩니다.
- 접종 된 쿠폰을 생물 안전 캐비닛에서 건조시킵니다. 특정 재료에 대한 관찰을 통해 건조 시간을 결정했습니다. 여기에 제시된 결과의 경우 다음 시간이 사용되었습니다 : 스크럽 = 30 분 건조 시간; 얼굴 가리개 = 60분 건조 시간; 데님 = 건조 시간 30분; 스테인리스 스틸 = 건조 시간 120분.
- 안전 핀과 무균 기술을 사용하여 그림 2 에 따라 전체 크기 PPE 품목에 접종 쿠폰을 부착합니다.
그림 2. 데님, 스크럽 및 얼굴 가리개에 쿠폰 위치를 테스트하십시오. 문자 A-D는 모든 세탁 실험에 대한 고유 쿠폰 식별자에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 세탁 수행
- 세탁 세제는 다음과 같이 준비하십시오.
- 세탁기에 사용될 수돗물을 소독하고 멸균 검사를 위해 10mL의 고압 멸균 물을 수집합니다. 이 프로토콜의 경우 60분 액체 사이클에서 7L의 수돗물을 오토클레이브합니다.
- 제조업체의 희석 지침에 따라 세탁 용액을 준비하십시오. 이 프로토콜의 경우 1.54mL의 세제를 3.5L의 멸균 수돗물에 녹입니다. 핫플레이트와 교반 막대를 사용하여 세탁 용액을 50°C로 가온합니다. 세탁 용액의 pH와 온도를 측정하고 기록합니다. 멸균 검사를 위해 10mL의 용액을 수집합니다.
- 세탁 용액을 멸균 된 와셔 (3.25 L)에 붓습니다. 테스트 사이에 250ppm-4시간 주기의 증기 과산화수소를 사용하여 세척기를 사전 멸균합니다.
- PPE 품목을 멸균된 세탁기에 넣습니다. 세탁기당 데님 팬츠 1개와 스크럽 셔츠 1개를 추가합니다. 와셔당 접종된 안면 가리개 1개와 오염되지 않은 충전 마스크 4개를 추가합니다. 채우기 마스크에는 쿠폰이 부착되어 있지 않습니다.
- PPE 품목을 18분 동안 세척합니다(정상적인 교반으로 9분 세척 주기 2회). 세탁기의 물기를 빼고 실온의 수돗물(매번 5L)로 삼중 헹구어 거품을 제거합니다. 실온 멸균 수돗물을 세탁기(3.25L)에 넣고 9분 동안 긴 헹굼 과정을 수행합니다.
- PPE 품목을 세탁기의 회전 쪽으로 옮기고 5분 동안 돌립니다. PPE 품목을 건조기로 옮기고 고열 설정(80°C)에서 93분 동안 건조시킵니다.
- PPE를 건조기에서 멸균 작업 공간으로 옮기고 각 품목에서 쿠폰을 무균 적으로 제거하고 원추형 튜브에 넣습니다. 튜브에 10% Dey-Engley 배양액 추출 버퍼 10mL를 미리 채우고 알루미늄 호일로 덮습니다.
6. 쿠폰에 대한 바이러스 부하 추출 및 열거
- 10% Dey-Engley 중화 국물 10mL에 쿠폰을 추출하여 장비의 최대 설정에서 2분 동안 볼텍싱하여 추출합니다.
- 플레이트 추출물은 통상적인 소프트탑 한천 오버레이 방법을 사용하여26.
- 섹션 1에 설명된 대로 소프트 변형 트립신 대두 한천과 P. syringae 배양액의 튜브를 준비합니다. 시험 당일, 연질 한천 튜브를 121°C에서 15분 동안 오토클레이브하여 한천을 녹였습니다. 도금될 때까지 연질 한천을 48°C에서 유지한다. 48°C에서의 평형화는 중요하지 않으며 그렇지 않으면 분석에서 바이러스가 열적으로 불활성화될 수 있습니다.
- 세탁 연구에 사용된 각 테스트 샘플에 대해 1x 인산염 완충 식염수로 10배 희석 시리즈를 준비합니다. 도금에는 연속 희석(100μL) 및 비희석(1mL 및 100μL) 분취량을 모두 사용하십시오.
- 6mL의 연질 한천과 100μL의 로그 상 P. syringae 배양 (0.9-1.5 사이의 OD600 )을 포함하는 연질 한천 튜브에 시험 샘플 분취량을 추가합니다. 부드러운 한천을 응고된 변성 트립신 대두 한천 플레이트의 표면에 붓습니다. 플레이트를 소용돌이치게 하여 단단한 한천 표면에 부드러운 한천을 고르게 분배합니다.
- 플레이트를 실온에서 밤새 배양하고 다음 날 각 플레이트의 플라크 형성 단위를 계산하여 수동으로 열거합니다.
7. PPE 항목에 대한 테스트 후 육안 평가 수행
- 테스트에 사용되는 다양한 PPE 항목에 다음을 문서화하십시오 : 퇴색, 변색 및 / 또는 손상 징후 (예 : 찢어짐, 늘어남); 냄새; 작은 구멍, 상처 또는 찢어짐 (작은 손전등을 사용하여 손상 확인); 층의 분리, 누락 된 실, 바인딩이 손상된 영역; 솔기 또는 지퍼의 손상; 탄성의 스트레칭을 측정하고 기록합니다.
Representative Results
이 프로토콜이 완료된 후 여러 가지 유형의 품질 관리 데이터 및 결과가 생성됩니다. 플라크 형성 장치(PFU) 플레이트 수와 추출된 샘플 부피를 통해 테스트 쿠폰당 PFU 수를 계산할 수 있습니다. 표 2 는 연속 희석/도금 결과에 대한 데이터 기록 시트의 예입니다. 표 1의 희석 계수, 샘플 부피 및 플레이트 수를 사용하여 표 3 은 얼굴 가리개 테스트에 대한 대표적인 바이러스 회복 결과를 보여줍니다. 이러한 데이터에는 테스트 쿠폰과 접종물, 쿠폰 및 세척수(세제 포함 및 제외)에 대한 품질 관리 샘플이 포함됩니다. 절차적 블랭크 및 멸균 품질 관리 샘플은 수용액 및 PPE 재료가 Phi6로 오염되지 않았는지 확인하는 데 중요합니다. 오염 표시는 소독 효능의 잘못된 계산을 유발하고 테스트를 반복해야 합니다. 양성 대조군 샘플은 바이러스 저장 용액이 실험 중에 환경적/자연적으로 분해되지 않았음을 확인하여 바이러스 부하 감소에서 세탁 과정의 효과를 부풀리기 위한 것입니다. 이러한 샘플은 테스트 쿠폰 결과를 수락하기 위해 접종 대조군의 1 log PFU 내에 있어야 합니다. 양성 대조군 샘플의 PFU가 크게 감소한 것은 분석가가 적절한 피펫팅 및 확산 기술로 프로토콜을 실행하고 있는지 확인하기 위해 쿠폰 접종의 모든 단계를 주의 깊게 검토해야 함을 나타냅니다.
이 프로토콜은 또한 세탁으로 인한 의류 품목의 재료 특성 변화를 평가하기위한 정보 및 프로토콜과 관련된 품질 관리 정보를 제공합니다 (표 4 및 그림 3). 이러한 데이터는 여러 가지 이유로 유용합니다. PPE 품목의 측정 추세를 기록하면 제조 결함이 있는 품목을 식별할 수 있습니다. 이 식별은 이상치 미생물 데이터를 설명하고 제품 행동의 변화를 맥락화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 냄새나 손상을 기록하면 실험 중에 세탁기 또는 건조기가 차선책으로 작동했는지, 테스트를 반복해야 하는지 또는 장비를 수리해야 하는지 여부를 알 수 있습니다. 또한 테스트 계획에서 동일한 PPE 품목의 여러 세탁 주기를 요구하는 경우 데이터는 PPE 품목이 세탁 시 사용하기 위해 무결성을 유지하는 기간을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세제 용액의 pH 기록을 유지하면 수원 또는 세제 제품의 변화에 대한 경고를 제공합니다. 세탁 단계의 시간 로그를 유지하면 세탁기와 건조기의 타이머가 실험 프로토콜에 변동을 일으키지 않습니다.
궁극적으로 이러한 데이터는 바이러스 병원체 대용물에 대한 온수 세탁 절차의 소독 효능을 보고하는 데 사용됩니다. 세탁 소독 효능(식 1)은 PPE 양성 대조군 결과의 평균 로그10 바이러스 회수에서 PPE 테스트 쿠폰의 평균 로그10 바이러스 회수율을 빼서 계산합니다(그림 4). 검출되지 않은 테스트 쿠폰 결과의 경우 검출 한계의 로그10이 소독 효율 계산에 사용됩니다. 소독 효능을 다른 바이러스 소독 기술 및 표준과 비교하기 위해 로그 값으로 보고하는 것이 일반적입니다.
소독 효능 = 평균 로그 10 (양성 대조군) - 평균 로그10 (테스트 쿠폰) (식 1)
그림 3. 위치별 PPE 치수 변경. Δ = 사전 테스트 측정 - 테스트 후 측정. 음수 Δ 값은 지정된 위치에서 항목의 스트레치에 해당하고 양수 값은 수축에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. Phi6의 얼굴 가리개, 데님 및 스크럽 PPE 재료를 소독할 때 온수 세탁의 효능. 별은 전체 소독이 발생했음을 나타냅니다(테스트 쿠폰에서 감지되지 않음). 오차 막대는 표준 편차(n = 3)를 나타냅니다. 위치 문자는 그림 2에 표시된 배치에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 솔루션 레시피. 트립신 콩 한천, 트립스 콩 국물 및 쇠고기 추출물 용액을 준비하는 데 필요한 성분 및 양. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2. 연속 희석/도금 결과 시트의 일부 예. 원시 미생물 데이터를 보고하기 위한 템플릿입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3. 얼굴 가리개 미생물 결과. 처리된 플라크 형성 단위(PFU) 데이터에 대한 예제 요약 시트. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4. 품질 관리 및 재료 평가 로그를 스크럽합니다. pH 프로브의 교정, 세제 용액의 pH, 세척 전후 측정, 세탁 주기 시간을 보고하기 위한 템플릿입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 풀 사이즈 PPE/의류 품목에서 바이러스 소독의 세탁 효과를 평가하기 위해 체계적인 실험실 테스트를 실행하기 위해 개발되었습니다. 이 절차는 바이러스 준비, 테스트 물질 접종, 세탁 프로세스로 인한 항목 변경 평가 및 세탁 (기계 세척 및 건조) 프로세스의 결과로 인한 바이러스 부하 감소를 정량화하기위한 중요한 단계를 간략하게 설명합니다. 또한 프로토콜은 여러 세탁 주기 후에 PPE 품목의 재료 무결성을 추적하기 위해 기록해야 하는 오염 및 측정/관찰에 의해 실험이 편향되지 않도록 하는 데 필요한 품질 관리 샘플을 설명합니다. Phi6를 사용한 결과는 이 프로토콜에 사용된 온수 세탁 공정이 모든 샘플(얼굴 가리개, 스크럽 및 데님 바지)에 대해 바이러스 부하를 3로그 이상 감소시켰음을 나타냅니다. 바이러스 부하 감소는 PPE/의류 품목의 여러 위치에서도 균일했습니다. 3-log 감소를 입증하기 위해 이 프로토콜은 모든 상황에서 토양 부하를 대표하지 않을 수 있는 높은 바이러스 부하와 안정화제(쇠고기 추출물)를 사용해야 합니다.
미니 세척기와 소형 건조기는 공간이 제한된 환경에서 수행할 수 있는 반복 실험 횟수를 최적화하고 실험 중에 사용되는 장비 및 물의 살균을 실험실 직원이 관리할 수 있도록 유지하기 위해 선택되었습니다. 미니 와셔를 사용한 결과, 헹굼 단계는 완전히 자동화 된 대부분의 가정 세탁 응용 프로그램과 비교하여 수동이었습니다. 기계 세척은 선진국에서 우세하지만 손씻기는 여전히 전 세계적으로 시행되고 있음을 기억하는 것도 중요합니다15. 또한 일부는 세탁을 위해 뜨거운 물을 이용할 수 없으며 다른 일부는 기계 건조가 아닌 수동으로 옷을 공기 건조할 수 있습니다. 세탁 관행의 이러한 차이점은이 현재 프로토콜에서 다루어지지 않았지만 버킷과 밀착 라인을 사용하여 세탁 및 건조 단계를 대체하는 것과 같은 사소한 수정으로 쉽게 조사 할 수 있습니다.
전체 규모의 과학 문헌에서 바이러스로 오염 된 얼굴 가리개와 거리 의류의 청소 / 소독에 대한 초점은 거의 없었습니다. 보다 일반적으로 연구는 반복적인 세척 및 건조 후 안면 가리개의 여과 성능을 평가하지만 바이러스 소독 효능은 평가하지 않습니다27,28. 예를 들어, Clapp et al.은 천 마스크와 수정 된 절차 마스크의 장착 여과 효율을 평가했으며 간단한 수정으로 향상된 적합성 및 여과 효율을 제공하는 성능의 큰 변화를 발견했습니다29. 또 다른 연구에서는 서로 다른 재료30의 천 마스크 4 개의 여과 효율을 조사하여 다시 소스 제어 또는 개인 보호에 중점을 두었습니다. 이는 동일한 실험실에서 미생물 부분과 기계적 테스트 모두에 대한 전문화가 부족하기 때문일 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 소독 효능과 재료 분해에 대한 평가를 제공합니다.
최근 과학 문헌31,32,33에 발표 된 일회용 호흡기 보호 (주로 N95)를위한 여러 오염 제거 / 소독 방법이 있습니다. FFR (예 : N95)에 대한 주요 초점은 의료 종사자 및 기타 일선 직업에 제공하는 중요한 호흡기 보호 때문입니다. 호흡기 오염 제거를 위한 주요 기술에는 기화된 과산화수소(VHP), 자외선 살균 방사선(UVGI) 및 바이러스 비활성화를 위한 습열(증기)이 포함되었습니다. Viscusi 외는 FFR 및 UVGI에 대한 5 가지 오염 제거 방법을 평가했습니다. 에틸렌 옥사이드와 VHP는 가장 유망한 오염 제거 방법31로 밝혀졌습니다. Fischer et al. SARS-CoV-2 오염을 줄이는 능력과 N95 호흡기 기능에 미치는 영향에 대해 자외선, 건열, 70% 에탄올 및 VHP의 네 가지 오염 제거 방법을 평가했습니다.32. 202033에 요약 및 발표 된 FFR에 대한 효과적인 오염 제거 기술에 대한 많은 추가 연구가 있습니다. 그러나 이러한 특수 방법은 일반 가정 또는 소규모 비즈니스 소유자가 안전하게 사용할 수 있도록 액세스하거나 설계되지 않았습니다.
이 프로토콜은 모든 테스트에서 SARS-CoV-2와 유사하고 스파이크 단백질을 가지고 있으며 비슷한 크기(80-100nm)34인 외피 박테리오파지인 Phi6를 사용하여 개발되었습니다. Phi6는 알려진 병원체가 아니기 때문에 일반 미생물 생물 안전 레벨 1 (BSL-1) 실험실에서 조작 할 수 있습니다. Phi6에 대한 효능은 다른 외피 바이러스의 효능을 나타낼 수 있지만, 관심있는 각 바이러스에 대한 경험적 검증이 필요하다(35). 유사한 비병원성 바이러스 제제를 사용함으로써 이 프로토콜이 다른 곳에서 반복되고 미래의 바이러스 전염병/전염병을 연구하는 데 사용될 수 있기를 바랍니다. 향후 연구에는 세제 외에 소독제(예: 표백제)의 사용과 손 씻기 및 라인 건조를 위한 표준화된 프로토콜이 포함될 수 있습니다.
Disclosures
공개할 알려진 이해 상충은 없습니다.
Acknowledgments
미국 환경 보호국 (EPA)은 연구 개발국을 통해 Jacobs Technology Inc.와 함께 EP-C-15-008에 따라 여기에 설명 된 연구를 지시했습니다. 기구에 의해 검토되었지만 반드시 기관의 견해를 반영하지는 않습니다. 공식적인 보증을 유추해서는 안 됩니다. EPA는 상업용 제품 또는 서비스의 구매 또는 판매를 보증하지 않습니다. 저자는 EPA RTP 미생물학의 감독에 대해 EPA 계약자 Denise Aslett, EPA RTP 미생물학 실험실에서이 프로젝트에 대한 작업에 대해 Brian Ford, Rachael Baartmans 및 Lesley Mendez Sandoval, EPA 품질 보증 검토를 제공 한 Ramona Sherman, EPA 기술 검토를 제공 한 Worth Calfee와 Shannon Serre에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freezer (- 80 °C) | ThermoFisher Scientific | FDE30086FA | |
| Hot Plate | VWR | 97042-714 | |
| Safety Pins (steel) | Singer | 319921 | |
| Shaker | Lab-Line Instruments, Inc. | 3525 | |
| SM buffer | Teknova, Hollister, CA | S0249 | |
| Syringe filter (0.2 μm) | Corning, Corning, NY | PES syringe filters, 431229 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Teknova, Hollister, CA | P0196, 10X PBS solution | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Autoclavable caps | DWK Life Sciences, Millville, NJ | KIM-KAP Caps, 73663-18 | |
| Autoclave | Steris | AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS | |
| Beef Extract | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA | P/N B4888-100g | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| Cell spreaders | Busse Hospital Disposables | 23600894 | |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004271 | Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge |
| Certified Timer | https://nist.time.gov/ | Not Applicable | |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Life Sciences | 352098 | Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AY509X33 | |
| Denim | Wrangler | Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW | |
| Detergent | Proctor and Gamble | Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068 | |
| Dextrose | Fisher | BP350 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Becton Dickinson | DF0819172 | |
| Dryer | Magic Chef | MCSDRY15W | |
| Face Coverings | Felina | Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4 | |
| Incubator (top agar) | Symphony | 414004-596 | |
| Laboratory Notebook | Scientific Notebook Company | 2001 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Media sterilization and dispensing system | Integra | Media Clave/Media Jet | |
| Petri Dishes (100 mm) | VWR | 25384-342 | |
| pH Meter | Orion/Oakton | STARA1110/EW-35634-35 | |
| pH Probe | Orion | 8157BNUMD | |
| pH Standards | Oakton | 00654-(00/04/08) | |
| Phi 6 and Pseudomonas syringae | Battelle Memorial Institute, Columbus, OH | Not Applicable | |
| Pipette & Tips | Rainin | (Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382 | |
| Refrigerator | True Manufacturing Co., Inc. | GDM-33 | |
| Scrubs | Gogreen cool | PN: WS19100PT | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 57656 | |
| Stir Bar | Fisherbrand | 16-800-512 | |
| Tape Measure | Lufkin | PS3425 | |
| Test Tubes for Soft agar (14 mL) | Corning, Corning, NY | 352059 | |
| Thermometer | Fisherbrand | 14-983-19B | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T9410 | |
| Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags | STERIS | 62020TW | |
| Vortex (during the plating process) | Daigger Scientific, Inc | 3030A | Vortex Genie 2 |
| Vortex (for sample extraction) | Branson Ultrasonics | 58816-115 | Multi-Tube vortexer |
| Washer | Kuppet | KP1040600A | |
| Washer Sterilization | Steris | STERIS VHP ED1000 generator | |
| Yeast extract | Gibco | 212750 |
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