Summary
Denne protokol beskriver en arbejdsgang med høj kapacitet til kunstig intelligens-drevet segmentering af patologibekræftede regioner af interesse fra farvede, tynde vævssektionsbilleder til berigelse af histologiopløste cellepopulationer ved hjælp af lasermikrodissektion. Denne strategi omfatter en ny algoritme, der muliggør overførsel af afgrænsninger, der angiver cellepopulationer af interesse direkte til lasermikroskoper.
Abstract
Tumormikromiljøet (TME) repræsenterer et komplekst økosystem bestående af snesevis af forskellige celletyper, herunder tumor-, stroma- og immuncellepopulationer. For at karakterisere variation på proteomniveau og tumor heterogenitet i skala er der behov for metoder med høj kapacitet til selektivt at isolere diskrete cellulære populationer i solide tumor maligniteter. Denne protokol beskriver en arbejdsgang med høj kapacitet, aktiveret af kunstig intelligens (AI), der segmenterer billeder af hæmatoxylin og eosin (H&E)-farvede, tynde vævssektioner i patologibekræftede regioner af interesse for selektiv høst af histologi-opløste cellepopulationer ved hjælp af lasermikrodissektion (LMD). Denne strategi omfatter en ny algoritme, der muliggør overførsel af regioner, der angiver cellepopulationer af interesse, kommenteret ved hjælp af digital billedsoftware, direkte til lasermikroskoper, hvilket muliggør mere letkøbte samlinger. En vellykket implementering af denne arbejdsgang blev udført, hvilket demonstrerede nytten af denne harmoniserede metode til selektivt at høste tumorcellepopulationer fra TME til kvantitativ, multiplekset proteomisk analyse ved højopløsnings massespektrometri. Denne strategi integreres fuldt ud med rutinemæssig histopatologisk gennemgang, udnytter digital billedanalyse til at understøtte berigelse af cellulære populationer af interesse og er fuldt generaliserbar, hvilket muliggør harmoniseret høst af cellepopulationer fra TME til multiomiske analyser.
Introduction
TME repræsenterer et komplekst økosystem befolket af et meget forskelligt udvalg af celletyper, såsom tumorceller, stromale celler, immunceller, endotelceller, andre mesenkymale celletyper og adipocytter sammen med en kompleks ekstracellulær matrix1. Dette cellulære økosystem varierer inden for og på tværs af forskellige sygdomsorgansteder, hvilket resulterer i kompleks tumor heterogenitet 2,3. Nylige undersøgelser har vist, at heterogene tumorer og tumorer med lav tumorcellulæritet (lav renhed) ofte korrelerer med dårlig sygdomsprognose 2,3.
For at forstå det molekylære samspil mellem tumor- og ikke-tumorcellepopulationer inden for TME i skala er standardiserede og high-throughput-strategier nødvendige for selektivt at høste forskellige cellulære populationer af interesse for downstream multiomisk analyse. Kvantitativ proteomics repræsenterer en hurtigt udviklende og stadig vigtigere teknik til at fremme forståelsen af kræftbiologi. Hidtil har overvægten af undersøgelser, der anvender proteomik, gjort det med proteiner ekstraheret fra hele tumorvævspræparater (f.eks. Kryopulveriseret), hvilket fører til en mangel i forståelsen af heterogenitet på proteomniveau i TME 4,5,6.
Udviklingen af prøveindsamlingsstrategier, der problemfrit integreres med og udnytter information fra klinisk patologiske arbejdsgange, vil muliggøre en ny generation af histologi-løst proteomik, der er meget komplementære til guldstandard, diagnostiske patologi arbejdsgange. LMD muliggør direkte og selektiv indsamling af cellulære subpopulationer eller regioner af interesse (RIE'er) gennem mikroskopisk inspektion af histologisk farvede vævstynde sektioner7. Nylige store fremskridt inden for digital patologi og AI-aktiveret analyse har vist evnen til at identificere unikke sammensætningsfunktioner og RIE'er inden for TME på en automatiseret måde, hvoraf mange korrelerer med molekylære ændringer og kliniske sygdomsfunktioner, såsom resistens over for terapi og sygdomsprognose8.
Arbejdsgangen beskrevet i protokollen, der præsenteres her, udnytter kommercielle softwareløsninger til selektivt at kommentere tumor-ROI'er inden for digitale histopatologiske billeder og bruger softwareværktøjer udviklet internt til at overføre disse tumor-ROI'er til lasermikroskoper til automatiseret indsamling af diskrete cellulære populationer af interesse, der problemfrit integreres med downstream multiomiske analysearbejdsgange. Denne integrerede strategi reducerer LMD-operatørens tid betydeligt og minimerer den varighed, hvor væv skal være ved omgivelsestemperatur. Integrationen af automatiseret funktionsudvælgelse og LMD-høst med kvantitativ proteomik med høj kapacitet demonstreres gennem en differentiel analyse af TME fra to repræsentative epitelial ovariecancer histologiske undertyper, højkvalitets serøs ovariecancer (HGSOC) og ovarieklarcellecarcinom (OCCC).
Protocol
Alle undersøgelsesprotokoller blev godkendt til brug under en vestlig IRB-godkendt protokol "En integreret molekylær analyse af endometrie- og ovariecancer for at identificere og validere klinisk informative biomarkører", der anses for undtaget i henhold til us Federal Regulation 45 CFR 46.102 (f). Alle forsøgsprotokoller, der omfattede humane data i denne undersøgelse, var i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. Informeret samtykke blev indhentet fra alle forsøgspersoner, der var involveret i undersøgelsen.
FORSIGTIG: Følgende reagenser, der anvendes i hele protokollen, er kendte eller mistænkte kræftfremkaldende stoffer og / eller indeholder farlige materialer: ethanol, DEPC-vand, Mayers hæmatoxylinopløsning, Eosin Y-opløsning, methanol, acetonitril og myresyre. Korrekt håndtering som beskrevet i de respektive sikkerhedsdatablade (SDS) og brug af passende personlige værnemidler (PPE) er obligatorisk.
1. Generering af standardformularlistedatafilen (.sld), der indeholder kalibratorfiducialer
BEMÆRK: De protokoltrin, der er beskrevet i dette afsnit, er specifikke for brug med et omvendt lasermikroskop og den tilhørende software (se materialetabellen). Oprettelse af en standard .sld-fil er kun nødvendig én gang pr. lasermikroskop. Den resulterende fil kan bruges til at skære fiducials i alle PEN-dias, der bruges derefter. Omtrentlig tid: 5 min (kun én gang).
- Åbn LMD-softwaren, og læg polyethylennaphthalat (PEN) membranen på LMD-stadiet med forsiden nedad med etiketten nærmest brugeren. Fjern markeringen i feltet Luk linje(r) i højre side af programvinduet.
- Brug PtoP-funktionen (punkt til punkt) under høj forstørrelse (63x) til at tegne tre "V"-pile for at fungere som kalibreringsfiducialer. Start ved et eksternt punkt på V'et, tegn en linje til midten af V'et og et enkelt klik. Tegn derefter en anden linje fra V'ets centrale punkt til slutningen af det andet eksterne V-punkt, og dobbeltklik for at oprette en enkelt, ikke-lukket V-form fra de to linjer.
BEMÆRK: Disse kalibreringsfiducialer skal placeres i tre hjørner af diaset: forreste højre, bageste højre, bageste venstre. - Vælg INDSTILLINGEN AF (autofokus) før klipning . Skær diaset i position 1, flyt det til hver af de resterende diaspositioner, og spor nøjagtigt over kalibreringsskæringerne.
- Gem .sld-filen, og vælg indstillingen Gem uden kalibrering i pop op-dialogboksen for at undgå at skære kalibreringsfiducialerne i membranen.
BEMÆRK: En repræsentativ .sld-fil, der indeholder standardkalibratorfiducialer til fire diaspositioner, findes i supplerende fil 1.
2. Forberedelse af LMD-dias
BEMÆRK: De protokoltrin, der er beskrevet i dette afsnit, er specifikke for brug med et omvendt lasermikroskop og den tilhørende software (se materialetabellen). Omtrentlig tid: 5 min.
- Sørg for, at diaset er helt tørt, før du skærer referencekalibreringsfiducialerne. Åbn LMD-softwaren, og åbn standard kalibrerings.sld-filen under indstillingen Importer figurer .
- Vælg INDSTILLINGEN AF (autofokus) før klipning . Læg gliderne med vævet nedad, og etiketten glider tættere på operatøren ind i glideholderen på LMD-scenen.
- Ved hjælp af lasermikroskopet og standardkalibrerings .sld-filen skæres kalibreringsfiducialer ind i PEN-membranen.
- VALGFRIT: Skær kalibreringsfiducialerne i PEN-membranen enten før eller efter, at vævssektionen/-sektionerne er placeret på diaset. Hvis kalibreringsfiducialerne skæres inden vævsplaceringen, skal det sikres, at vævet og/eller fikseringsmidlet ikke overlapper kalibratorerne, når vævet anbringes på diaset i trin 2.5. Hvis kalibreringsfiducialerne skæres efter vævsplacering, skal du stoppe efter afslutningen af trin 2.4 og fortsætte til punkt 3.
- Gennemgå alle kalibratorer individuelt for at sikre, at hvert snit er komplet og synligt.
BEMÆRK: Brug funktionen Flyt og klip til manuelt at dirigere laseren over alle kalibreringsfiducialer, der ikke skar helt gennem PEN-membranen. - Anbring den frosne eller formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) vævssektion på diaset indeholdende kalibreringsfiducialerne.
3. Vævsfarvning
BEMÆRK: Omtrentlig tid: 30 min.
- Fastgør de frosne LMD-vævsglas i 70% ethanol (EtOH) indeholdende fosfatasehæmmercocktailreagenser i 5 minutter.
- Vask diasene i diethylpyrocarbomat (DEPC) vand indeholdende fosfatasehæmmer cocktailreagenser i 1 min.
- Vask rutsjebanerne i DEPC-vand i 1 min.
- Inkuber diasene i Mayers hæmatoxylinopløsning i 3 minutter.
- Skyl rutsjebanerne i DEPC-vand i 3 min.
- Skyl rutsjebanerne i en frisk udveksling af DEPC-vand i 1 min.
- Inkuber diasene i vandig Eosin Y-opløsning i 1 s.
- Skyl gliderne 2 x 5 s i 95% EtOH.
- Skyl gliderne 3 x 10 s i 100% EtOH.
- Tør den overskydende EtOH af bagsiden af diasene, og lad gliderne lufttørre.
- Opbevar diasene ved -80 °C, hvis LMD ikke skal udføres med det samme.
4. Billedbehandling
BEMÆRK: De protokoltrin, der er beskrevet i dette afsnit, er specifikke for scannede dias (se materialetabellen) og de resulterende billeder, der er gemt som .svs-filer. Brug en hvilken som helst scanner og dens tilhørende software, der genererer billedfiler i et format, som billedanalysesoftwaren (se materialetabellen) kan åbne. Filtyper, der bruger pyramideformede tiffs, der understøttes, omfatter JPG, TIF, MRXS, QPTIFF, komponent TIFF, SVS, AFI, SCN, LIF, DCM, OME. TIFF, ND2, VSI, NDPI, NDPIS, CZI, BIF, KFB og ISYNTAX. Omtrentlig tid: 5 min.
- Tænd scanneren, og åbn diasscannersoftwaren. Læg diaset med vævet opad på det enkelte diastrin i scanneren. Sørg for, at diaset er helt tørt, og placer forsigtigt en dækslip over vævet. Brug ikke ethanol eller nedsænkningsolie under dækslippen.
- Optag mikrografbilledet ved hjælp af indstillinger, der er kalibreret til at justere for PEN-membranen i stedet for glasbaggrund og ignorere baggrundsmembranfarvning i henhold til producentens anvisninger.
- Juster billedområdet ved at trække og ændre størrelsen på den indre grønne omkreds for at fange hele PEN-membranområdet efter behov. Tilføj fire fokuspunkter på vævet ved at dobbeltklikke på snapshotoversigtsbilledet og tre fokuspunkter på membranen nær kalibreringsfiducialerne (et fokuspunkt pr. Hver af de tre kalibreringsfiducialer).
BEMÆRK: De fire fokuspunkter kan placeres næsten hvor som helst på vævssektionen, selvom placering på væv, der er for mørkt farvet og ser sort ud, kan få scanningen til at mislykkes. - Under menuen Vis skal du vælge Videoovervågning. Juster fokus manuelt ved hjælp af fin- og /eller makrofokusskyderen efter behov for hvert punkt omkring LMD-vævet. Optag billedscanningen under høj forstørrelse (20x). Bekræft, at alle kalibreringsfiducialer er synlige og klare i det gemte billede.
5. Automatiseret funktionsvalg ved hjælp af billedanalysesoftware
- For hele tumorsamlinger (omtrentlig tid: 5 min; sagsafhængig):
- Åbn billedanalysesoftwaren (se materialetabellen). Vælg Åbn billeder , og vælg den .svs-billedfil, der genereres ved scanning af diasen på AT2-scanneren, i pop op-vinduet.
BEMÆRK: En repræsentativ .svs-billedfil findes i supplerende fil 2. - Gå til fanen Anmærkninger . Vælg penværktøjet på værktøjslinjen Anmærkning, og tegn en figur rundt om vævet.
- Vælg formen, og højreklik på billedet. Fra rullemenuen Avanceret skal du vælge Partitionering (flisebelagt). Angiv feltstørrelse og mellemrum mellem til henholdsvis 500 og 40, og vælg OK for at generere felterne. Markér og slet den perimeterfigur, der blev brugt til at generere fliserne i trin 5.1.2.
- Vælg rullemenuen Laghandlinger | Eksportér for at gemme de flisebelagte anmærkninger som en .annotationsfil.
BEMÆRK: En repræsentativ .annotationsfil til en hel tumorvævssamling findes i supplerende fil 3. - Opret en mappe til sessionen eller projektet, og gem .annotationsfilen i en undermappe, der er mærket med det entydige id for sliden.
- Gå til fanen Anmærkninger . Vælg rullemenuen Laghandlinger | Slet alle lag for at fjerne alle anmærkninger fra billedet. Vælg penværktøjet , og tegn en kort linje fra den indre spids af pilespidsen for hver kalibreringsfiducial. Tegn linjerne fra mærkerne i følgende rækkefølge: øverst til venstre, øverst til højre, nederst til højre.
- Vælg rullemenuen Laghandlinger | Eksportér for at gemme linjeanmærkningerne som en .annotationsfil. Føj _calib til filnavnet, og placer filen i den undermappe, der indeholder koordinaterne for de flisebelagte figurer.
BEMÆRK: En repræsentativ _calib.annotationsfil findes i supplerende fil 4. - Kopier adressen til hovedprojektet eller sessionsmappen. Åbn XML-importgenererende script, "Malleator" (tilgængelig via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), ved hjælp af det integrerede UDVIKLINGSMILJØ IDLE, og indsæt projektmappeadressen mellem citaterne nederst i scriptet.
- Vælg rullemenuen Kør | Kør modul for at udføre scriptet.
BEMÆRK: Den .xml LMD-importfil genereres i den undermappe, der er oprettet til billedet / diaset. En repræsentativ .xml fil findes i supplerende fil 5.
- Åbn billedanalysesoftwaren (se materialetabellen). Vælg Åbn billeder , og vælg den .svs-billedfil, der genereres ved scanning af diasen på AT2-scanneren, i pop op-vinduet.
- Kun for LMD-berigede samlinger (omtrentlig tid: 15 min; case-afhængig):
- Åbn billedanalysesoftwaren (se materialetabellen). Vælg Åbn billeder , og vælg den .svs-billedfil, der genereres ved scanning af sliden, i pop op-vinduet.
- Gå til fanen Anmærkninger . Markér og brug anmærkningsværktøjet til rektangel til at tegne en boks rundt om vævet.
- Vælg boksannoteringen, og højreklik på billedet. Vælg rullemenuen Avanceret | Partitionering (flisebelagt) mulighed. Angiv feltstørrelse og mellemrum mellem til henholdsvis 500 og 40, og vælg OK for at generere felterne. Markér og slet den anmærkning til perimeterboksen, der blev brugt til at generere fliserne i trin 5.2.2.
- Vælg rullemenuen Laghandlinger | Eksportér for at gemme de flisebelagte anmærkninger som en .annotationsfil.
- Placer en gemt kopi af Python "Dapọ" (tilgængelig via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022) algoritme, der er udviklet til at flette de AI-klassificerede annotationslag, i samme mappe som den flisebelagte annotationsfil.
- Kopiér navnet på den flisebelagte anmærkningsfil. Åbn Python-programmet ved hjælp af IDLE integreret udviklingsmiljø, og indsæt navnet på den flisebelagte annotationsfil mellem citaterne nederst i programmet.
- Vælg rullemenuen Kør | Kør modul. Vent på, at der genereres en ny fil, hvor alle de flisebelagte anmærkninger flettes under et enkelt lag.
- Åbn billedanalysesoftwaren, og naviger til fanen Anmærkninger . Vælg rullemenuen Laghandlinger | Slet alle lag for at fjerne alle anmærkninger fra billedet.
- Vælg rullemenuen Laghandlinger | Importer lokal annotationsfil. I pop op-vinduet skal du vælge den flettede .annotationsfil, der blev genereret af scriptet. Sørg for, at alle importerede felter er under det samme anmærkningslag.
- Naviger til fanen Klassifikator, og følg producentens instruktioner for at generere figurer til RI'erne. Før du kører klassifikatoren, skal du vælge det eller de ønskede annoteringslag (dvs. tumor- eller stromalaget) ved at markere ROI-feltet eller felterne under fanen Annotationer under Avancerede klassificeringsindstillinger. Brug indstillingen Anmærkningslag i menuen Klassifikatorhandlinger til at køre klassifikatoren.
- Når klassifikatoranalysen er fuldført, skal du gå til fanen Anmærkninger og vælge det anmærkningslag, der er genereret fra analysen. Vælg rullemenuen Laghandlinger | Slet alle lag, men aktuelle for at fjerne alle andre anmærkningslag fra billedet.
- Vælg rullemenuen Laghandlinger | Eksporter for at gemme anmærkningerne som en .annotationsfil. Opret en mappe til sessionen eller projektet, og gem .annotationsfilen i en undermappe, der er mærket med det entydige id for sliden.
BEMÆRK: En repræsentativ .annotationsfil til en klassificeret LMD-beriget vævssamling findes i supplerende fil 6. - Naviger til fanen Anmærkninger, vælg rullemenuen Laghandlinger | Slet alle lag for at fjerne alle anmærkninger fra billedet. Vælg penværktøjet, og tegn en kort linje fra hver kalibreringsfiducial. Tegn linjer fra mærkerne i følgende rækkefølge: øverst til venstre, øverst til højre, nederst til højre.
- Vælg rullemenuen Laghandlinger | Eksportér for at gemme linjeanmærkningerne som en .annotationsfil. Føj _calib til filnavnet, og placer filen i den undermappe, der indeholder koordinaterne for de flisebelagte figurer.
- Kopier adressen til hovedprojektet eller sessionsmappen. Åbn XML-importgenererende script, "Malleator" (tilgængelig via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), ved hjælp af det integrerede UDVIKLINGSMILJØ IDLE, og indsæt derefter projektmappeadressen mellem citaterne nederst i scriptet.
- Vælg rullemenuen Kør | Kør modul for at udføre scriptet.
BEMÆRK: Den .xml LMD-importfil genereres inde i den undermappe, der er oprettet til billedet / diaset.
6. Laser mikrodissektion
BEMÆRK: De protokoltrin, der er beskrevet i dette afsnit, er specifikke for brug med et omvendt lasermikroskop og den tilhørende software (se materialetabellen). Omtrentlig tid: 2 timer; sag afhængig.
- Læg det markerede membranglas (indeholdende kalibreringsfiducialer) med vævet nedad og etiketsiden tættere på operatøren i diasholderen på lasermikroskopstadiet.
- Vælg Importer figurer i rullemenuen Filer . Vælg den .xml LMD-importfil , der er genereret til sliden. Vælg Nej i pop op-vinduet for at undgå at indlæse referencepunkter fra filen og Nej i det andet pop op-vindue for at undgå at bruge tidligere gemte referencepunkter til kalibrering.
- Følg vejledningen fra LMD-applikationen, og juster kalibreringskorset til hver af de tre kalibreringsfiducialer på diaset. Se efter kalibreringsfiducialer, der vises øverst til venstre, øverst til højre og nederst til højre på diasbilledet i billedanalysesoftwaren, der svarer til referencepunkter i henholdsvis forreste højre, bageste højre og bageste venstre hjørne af det inverterede LMD-dias på mikroskopstadiet. Skift mellem at bruge 5x objektivobjektivet til at lokalisere og 63x målet til at justere hver kalibreringsfiducial. Vælg Nej i pop op-vinduet for at undgå at gemme referencepunkterne i filen og OK i det andet pop op-vindue for at bekræfte, at sliden er indsat.
- Flyt 5x objektivobjektivet på plads, og vælg Ja i pop op-vinduet for at bruge den faktiske forstørrelse. Når de importerede figurer vises, skal du fokusere kameraet på vævet.
- Fremhæv og markér alle figurerne i vinduet Figurliste , træk dem på plads ved hjælp af en eller to anmærkninger i synsfeltet som referencer, og juster den lodrette z-akse til klipning med laseren.
- Gennemse de importerede figurer, og tildel dem til den relevante placering i røret til samling. Tryk på Start Klip for at starte laseren.
BEMÆRK: Importerede figurer i .xml-filen tildeles automatisk til positionen "ingen hætte" i vinduet Figurliste . For at høste væv skal de importerede former omfordeles til en position, der indeholder et belastet rør.
7. Proteinfordøjelse ved trykcyklusteknologi (PCT)
BEMÆRK: Omtrentlig tid: 4 timer (3 timer uden vakuumcentrifuge tørretid).
- 0,5 ml rør indeholdende PCT MicroTubes med låg indeholdende LMD høstet væv i 20 μL 100 mM TEAB/10% acetonitril anbringes i en thermocycler og opvarmes ved 99 °C i 30 minutter, hvorefter der afkøles til 50 °C i 10 min.
- Drej rørene i 30 s ved 4.000 × g , og fjern derefter MicroTubes fra 0,5 ml rørene. Brug MicroCap-værktøjet til at fjerne og kassere MicroCaps fra PCT MicroTubes. Tilsæt trypsin (se materialetabellen) i et forhold på 1 μg pr. 30 mm2 væv og indsæt en MicroPestle i MicroTube ved hjælp af MicroCap-værktøjet.
- Overfør MicroTubes til en barocyclerpatron, og saml hele patronen. Anbring patronen i barocyclerens trykkammer, og fastgør låget. Barocycle ved 45.000 psi i 50 s og atmosfærisk tryk i 10 s ved 50 °C i 60 cyklusser.
- Når barocykling er afsluttet, overføres mikrorørene til et 0,5 ml mikrocentrifugerør og centrifugeres i 2 minutter ved 4.000 × g.
- Fjern MicroTube fra 0,5 ml mikrocentrifugerøret ved hjælp af hætteværktøjet. Fjern forsigtigt pistlen ved hjælp af hætteværktøjet, og skyl den nederste halvdel af pistlen med 20 μL væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS)-vand og saml vasken i et rent 0,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tryk forsigtigt på MicroTube på bordpladen for at flytte væsken til bunden og overfør al opløsningen fra MicroTube til 0,5 ml mikrocentrifugerøret.
- Tilsæt 20 μL vand af LC-MS-kvalitet til MicroTube, og bank det forsigtigt på bordpladen. Overfør vaskeopløsningen til 0,5 ml røret, og gentag dette vasketrin igen.
- Vakuumcentrifuge for at tørre prøverne ned til ~2 μL og tilsættes 100 μL 100 mM TEAB, pH 8,0.
- Bestem peptidkoncentrationen ved hjælp af et kolorimetrisk assay (bicinchonininsyre (BCA) assay; se materialetabellen) i henhold til producentens protokol.
8. Tandem-mass tag (TMT) mærkning og EasyPep oprydning
BEMÆRK: Omtrentlig tid: 7 timer og 20 minutter (2 timer og 20 minutter uden tørretid for vakuumcentrifuge).
- Bring de isobariske TMT-mærkningsreagenser til omgivelsestemperatur inden åbning. Der tilsættes 500 μL 100 % acetonitril til hvert HÆTTEGLAS med TMT (5 mg). Inkuber i 10 minutter med lejlighedsvis hvirveldannelse.
- Peptidprøven opløses 5 μg i 100 μL 100 mM TEAB, pH 8,0, og der tilsættes 10 μL af et givet TMT-reagens. Konstruer og inkluder referencepuljer, der repræsenterer hver enkelt prøve i eksperimentet i hvert TMT-multiplexsæt af prøver for at lette kvantificering af prøver på tværs af flere TMT-multiplexer9. Inkuber reaktioner i 1 time ved omgivelsestemperatur med lejlighedsvis omrystning/tapning.
- Sluk TMT-mærkningsreaktionen ved at tilsætte 10 μL 5% hydroxylamin og inkuberes i 30 minutter ved omgivelsestemperatur ved lejlighedsvis tapning. Efter slukning kombineres de TMT-mærkede prøver i et rør og tørres til ca. 200 μL.
- Der tilsættes 1.800 μL 0,1% myresyre. Kontroller pH med pH-papir: hvis pH ~ 3, tilsættes 1 ml 0,1% myresyre; hvis pH >3, tilsættes 10-20 μL 5% myresyre indtil pH ~3. Tilsæt 0,1% myresyre for at bringe til et endeligt volumen på 3 ml.
- Fjern fanen i bunden af peptidoprydningskolonnen, fjern hætten, og læg den i et 15 ml konisk rør. Overfør den TMT-mærkede prøve til kolonnen, og fortsæt med oprydning i henhold til producentens protokol.
- Vakuumcentrifuge for at tørre de eluterede peptider ned til ~ 20 μL, overføres til et LC-hætteglas ved hjælp af 25 mM ammoniumbicarbonat til et endeligt volumen på 80 μL og fortsættes til offline fraktionering.
9. TMT multiplex prøve fraktionering og pooling
BEMÆRK: Omtrentlig tid: 3 timer og 30 minutter (1 time og 30 minutter uden tørretid for vakuumcentrifuge).
- Fraktioner de TMT-mærkede peptidmultiplexer ved basisk omvendt fasekromatografi i 96 fraktioner ved at udvikle en stigende lineær gradient (0,69% min-1) af mobilfase B (acetonitril) til mobil fase A (10 mMNH4HCO3, pH 8,0).
- Generer 36 sammenkædede fraktioner ved at samle prøvebrønde. Vakuumcentrifuge til tørre fraktioner til ~ 2 μL og resuspend i 25 mM ammoniumbicarbonat (slutkoncentration 1,5 μg / 10 μL), centrifuge ved 15.000 × g i 10-15 minutter og overføre til LC hætteglas til MS-analyse.
10. Væskekromatografi tandem massespektrometri (LC-MS / MS)
BEMÆRK: Omtrentlig tid: Instrumentmetode og eksperimentelt designafhængigt.
- Massespektrometeret kalibreres i henhold til producentens anvisninger/protokoller.
- Forbered friske mobile faser og standarder, og udfør passende LC-forberedelser til forkørsel (herunder, men ikke begrænset til, rensning af opløsningsmidler, skylleluft og lækagetestscripts for det refererede instrument [se materialetabellen]). Ligevægt mellem præ- og analysekolonner og prøvesløjfe inden påbegyndelse af analyser.
- Før og mellem serielle TMT-multiplexanalyser skal du validere, at LC-MS-systemet opfylder tidligere benchmarkede præstationsmålinger ved hjælp af kvalitetssikring / kvalitetskontrol (QA / QC) TMT-mærkede peptidfordøjelser og (f.eks. MSPE (se materialetabellen), HeLa).
- Ilæg autosampler hætteglas i de relevante positioner i LC autosampler. Analyser individuelle fraktioner med en passende gradient / MS-metode. Intersperse en "vask" -kørsel med peptidstandard (f.eks. Kalibrering af peptidretentionstid [PRTC]) cirka en gang dagligt for at evaluere kromatografisk og massespektral ydeevne. Efter analysen af hver TMT multiplex-prøvefraktionsserie skal du køre QA /QC TMT-benchmarkstandarder for at evaluere systemets ydeevne.
- Kør massespektrometerevalueringsrutiner efter QA/QC TMT-benchmarkstandarder for at vurdere ydeevnen efter prøven, og kalibrer derefter systemet som i trin 10.1 for næste prøvesæt.
11. Analyse af bioinformatiske data
BEMÆRK: Omtrentlig tid: Eksperimentelt designafhængigt.
- Overfør alle eksempeldata (f.eks. .raw filer) til et passende netværkslager/computerdrev.
- Søg alle fraktioner sammen ved hjælp af den ønskede dataanalyseapplikation (f.eks. Proteome Discover, Mascot) ved hjælp af passende parametre9 mod en artsspecifik proteinreferencedatabase for at generere peptidspektralkampe (PSM'er) og udtrække TMT-reporterionsignalintensiteter. Filtrer PSM'er baseret på passende kvalitetskontrolmålinger og aggregerede normaliserede, median log2-transformerede TMT-reporter-ionforholdsmængder til globale proteinniveaumængder, som tidligere beskrevet 3,9.
- Sammenlign proteinændringer under forhold af interesse ved hjælp af ønsket differentiel analysesoftware.
Representative Results
Friskfrosne vævstynde sektioner fra to HGSOC- og to OCCC-patienter blev analyseret ved hjælp af denne integrerede AI-drevne vævs-ROI-identifikation, segmentering, LMD og kvantitativ proteomisk analysearbejdsgang (figur 1). Repræsentative H&E-farvede vævssektioner for hver tumor blev gennemgået af en bestyrelsescertificeret patolog; tumor cellularitet varierede fra 70% til 99%. Væv blev tyndskåret på PEN-membrandias (Supplemental File 2) og forskåret med kalibratorfiducials (Supplemental File 1), hvilket muliggjorde integration af positionelle orienteringsdata fra annotationer genereret i billedanalysesoftwaren (se materialetabellen) med kartesisk koordinatorientering i LMD-softwaren. Efter H&E-farvning blev der taget billeder i høj opløsning (20x) af PEN-diasene, der indeholdt vævet plus kalibratorer.
Tumor- og stromalcellepopulationer i mikrograferne blev segmenteret ved hjælp af billedanalysesoftware (se materialetabellen) til selektiv høst af LMD sammen med høst, der repræsenterer hele vævstyndsektionen (f.eks. Hele tumorvæv) (figur 1). Ikke-diskriminerende anmærkninger for hele tumorvævssamlinger blev genereret ved at opdele hele vævssektionen med fliser på 500 μm2, hvilket efterlod et mellemrum på 40 μm mellem fliser for at opretholde PEN-membranintegritet og forhindre membranen i at krølle under LMD. På dias til histologi-løst LMD-berigelse blev AI-klassifikatoren i billedanalysesoftwaren (se Materialetabellen) trænet til at skelne mellem tumor- og stromale celler sammen med den tomme glasglasbaggrund. Repræsentative tumor-, stroma- og blanke glasregioner blev manuelt fremhævet, og klassifikatorværktøjet blev brugt til at segmentere disse RIE'er gennem hele vævsafsnittet. De segmenterede lag, der repræsenterer hele væv, tumorepitelet og stroma, blev gemt separat som individuelle .annotationsfiler (supplerende fil 3 og supplerende fil 6). I en separat kopi af billedfilen (uden de partitionerede ROI-anmærkninger) blev en kort linje fra den midterste spids af hver af de tre fiducialkalibratorer kommenteret og gemt som en .annotationsfil ved hjælp af det samme filnavn som hver af LMD-annotationslagsfilerne, men tilføjet med suffikset "_calib" (Supplerende fil 4). Disse linjer blev brugt til at samregistrere placeringen af PEN-membrankalibratorerne med annotationsformlistedataene tegnet i billedanalysesoftwaren.
Denne undersøgelse giver to algoritmer, "Malleator" og "Dapọ" i Python til at understøtte denne AI-drevne LMD-arbejdsgang, som er tilgængelige på https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022. Malleator-algoritmen udtrækker de specifikke kartesiske koordinater for alle individuelle annotationer (vævs-ROI og kalibratorer) fra de parrede .annotation-filer og fletter disse til en enkelt XML-importfil (Extensible Markup Language) (Supplemental File 5). Specifikt bruger Malleator-algoritmen katalognavnet fra en overordnet mappe som input til at søge i alle undermappemapper og genererer .xml filer til eventuelle undermapper, der ikke allerede har en .xml flettet fil. Malleator-algoritmen fletter alle annoteringslag i billedanalysesoftwaren (se materialetabellen) til et enkelt lag og konverterer de AI-genererede formlistedata, der gemmes som proprietær .annotation-filtype, til .xml format, der er kompatibelt med LMD-softwaren. Efter fletning af annotations- og kalibratorfilerne gemmes og importeres den algoritmegenererede .xml fil til LMD-softwaren. Små justeringer er nødvendige for manuelt at justere justeringen af annotationer, som også tjener til at registrere den lodrette (z-plane) position af diastrinnet på lasermikroskopet. Dapọ-algoritmen bruges specifikt til LMD-berigede samlinger. Partitionerede felter tildeles automatisk til individuelle annoteringslag af billedanalysesoftwaren. Dapọ-algoritmen fletter alle partitionerede felter til et enkelt anmærkningslag før brug af klassifikatorværktøjet, hvorved klassifikatoranalysens kørselstid for LMD-berigede samlinger reduceres.
Hele tumor- og LMD-berigede vævsprøver blev fordøjet, mærket med TMT-reagenser, multiplekset, fraktioneret offline og analyseret via kvantitativ MS-baseret proteomik som tidligere beskrevet9. Det gennemsnitlige peptidudbytte (43-60 μg) og restitution (0,46-0,59 μg/mm2) for prøver høstet ved hjælp af denne AI-drevne arbejdsgang var sammenlignelige med tidligere rapporter 9,10. I alt 5.971 proteiner blev samkvantificeret på tværs af alle prøver (supplerende tabel S1). Uovervåget hierarkisk klyngedannelse ved hjælp af de 100 mest variable proteiner resulterede i adskillelse af HGSOC- og OCCC-histotyperne fra de LMD-berigede og hele tumorprøver (figur 2A), svarende til den tidligere beskrevne11. I modsætning hertil grupperede de LMD-berigede stromaprøver fra både HGSOC og OCCC sig sammen og uafhængigt af de LMD-berigede tumor- og hele tumorprøver. Blandt de 5.971 kvantificerede proteiner blev 215 signifikant ændret (LIMMA adj. p < 0,05) mellem hele tumorsamlinger fra HGSOC- og OCCC-prøver (supplerende tabel S2). Disse ændrede proteiner blev sammenlignet med dem, der blev identificeret for at differentiere HGSOC og OCCC tumorvæv af Hughes et al.11. Af de 76 signaturproteiner kvantificeret af Hughes et al. blev 57 co-kvantificeret i dette datasæt og var stærkt korrelerede (Spearman Rho = 0,644, p < 0,001) (figur 2B).
Figur 1: Resumé af den integrerede arbejdsgang for automatiseret vævsregion af interessevalg til lasermikrodissektion til downstream kvantitativ proteomics. Kalibreringsfiducialer skæres på PEN-membrandias for at co-registrere positionsorienteringsdata fra AI-afledte segmenter af vævsAFKAST i billedanalysesoftwaren HALO med vandret positionering på LMD-mikroskopet. Malleator-algoritmen bruges til at flette de kommenterede segmenteringsdata på tværs af alle annoteringslag for et dias med _calib-referencefilen og til at konvertere den til en .xml-fil, der er kompatibel med LMD-softwaren. LMD-høstet væv til proteomisk analyse fordøjes og analyseres ved kvantitativ proteomik med høj kapacitet som tidligere beskrevet9. Forkortelser: LMD = laser mikrodissektion; ROI = region af interesse; TMT = tandem masse tag; Kvantificering; Ident. = identifikation; LC-MS/MS = væskekromatografi-tandem massespektrometri. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Analyse af proteinerne i LMD-berigede og hele tumorprøver. (A) Uovervåget hierarkisk klyngeanalyse af de 100 mest varierende rigelige proteiner i HGSOC- og OCCC LMD-berigede og hele tumorprøver. (B) Korrelation af log2 fold-change protein overflod mellem HGSOC og OCCC hele tumorhøst i denne undersøgelse (Mitchell et al., x-akse) og en lignende undersøgelse af Hughes et al. (y-akse)11. Forkortelser: LMD = laser mikrodissektion; HGSOC = høj grad serøs kræft i æggestokkene; OCCC = ovarie klart celle karcinom; log2FC = log2-transformeret proteomisk overflod. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel S1: Forekomster af 5.971 proteiner kvantificeret på tværs af alle LMD-berigede og hele tumorprøver fra HGSOC- og OCCC-vævsprøver. Forkortelser: LMD = laser mikrodissektion; HGSOC = høj grad serøs kræft i æggestokkene; OCCC = ovarieklarcellecarcinom. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel S2: Differentielt udtrykte proteiner (215) i hele tumorsamlinger fra HGSOC vs OCCC (LIMMA adj. p < 0,05). Forkortelser: HGSOC = højkvalitets serøs ovariecancer; OCCC = ovarieklarcellecarcinom. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende fil 1: Repræsentativ figurlistedatafil (.sld), der indeholder standardkalibratorfiducialer til fire diaspositioner. Filen kan importeres til LMD-softwaren. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Repræsentativ .svs-billedfil af en H&E-farvet vævssektion med høj opløsning (20x). Filen kan åbnes og ses ved hjælp af billedanalysesoftware eller LMD-software. Forkortelse: H&E = hæmatoxylin og eosin; LMD = laser mikrodissektion. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Repræsentativ .annotationsfil af partitionerede hele tumorsegmenter. Filen kan importeres til billedanalysesoftware. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: Repræsentativ _calib.annotationsfil af kalibratorfiducialsegmenter. Koordinatoplysninger repræsenterer orientalsk placering af de korte kalibratorlinjer, der er tegnet fra hver pilespidsfiducial. Filen kan importeres til billedanalysesoftware. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 5: Repræsentativ extensible markup language (.xml) fil genereret af Malleator-algoritmen. Filen kan importeres til lasermikrodissektionssoftwaren. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 6: Repræsentativ .annotationsfil med partitionerede AI-klassificerede segmenter til LMD-berigede samlinger. Filen kan importeres til billedanalysesoftware. Forkortelser: AI = kunstig intelligens; LMD = laser mikrodissektion. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Mens der har været flere undersøgelsespræcedenser, der har til formål at udvikle og / eller forbedre arbejdsgange til berigelse af målcellulære subpopulationer fra FFPE og / eller friskfrosne væv og metoder til opretholdelse af prøvekvaliteten under behandling 9,12,13,14,15, er der et betydeligt behov for at udvikle automatiserede strategier til forberedelse af kliniske vævsprøver til molekylære analyser for at mindske variabilitet og øge reproducerbarheden. Denne arbejdsgang beskriver en standardiseret, semiautomatisk protokol, der integrerer eksisterende billedanalysesoftwareværktøjer (se materialetabellen) til histologiopløst høst af diskrete cellepopulationer af LMD fra kliniske vævsprøver.
Rumligt opløst LMD-berigelse af ROI'er, der fanger diskrete cellepopulationer, repræsenterer et næste generations vævsbehandlingstrin forud for multiomiske analyser for at forbedre molekylær karakterisering og identifikation og lette celleselektiv biomarkøropdagelse. Denne protokol forbedrer eksisterende metoder ved at reducere den ofte lange eksponering af vævssektioner til det omgivende miljø, der er forbundet med manuel segmentering af ROI af en histolog (hvilket kan tage >1-2 timer før LMD-samlingen). Denne arbejdsgang gør det i stedet muligt at forudidentificere ROI ved AI-styret klassificering og segmentering. Begrænsning af vævs opholdstid vil reducere falske variationer i vurderingerne af meget labile molekylære mål, såsom phosphopeptider og mRNA, eller for antistofbaserede analytiske teknikker, der er afhængige af, at et målprotein er i sin oprindelige konformation til påvisning.
Skæring af pæne kalibratorfiducialer på PEN-membranglasset, der er tydeligt synlige i det scannede diasbillede, er en af nøglekomponenterne, der muliggør integration af billedanalysesoftwaren (se materialetabellen) med LMD-arbejdsgangen. Hvis kalibratorerne har et præcist ("rent") punkt nederst i "V"-formen, kan der vælges et præcist punkt i billedanalysesoftwaren til de kalibratorlinjer, der skal trækkes fra, som beskrevet i trin 5.1.6 og 5.2.13. Justering af disse punkter under import til LMD-softwaren er afgørende for korrekt overlejring af annotationerne (lettet gennem generering af en kompatibel .xml-fil ved hjælp af algoritmerne "Malleator" og / eller "Dapọ") på det relevante vævsAFKAST på det fysiske LMD-dias. Det er nødvendigt at fremhæve alle former og kollektivt "trække og slippe" på plads, selv når justeringen er præcis ved import til LMD-softwaren for at registrere den lodrette (z-plane) position af diastrinnet på lasermikroskopet. Mindre justeringer af placeringen af annotationerne over vævets ROI kan også foretages under dette trin, hvis det er nødvendigt.
En begrænsning af den nuværende version af Malleator-algoritmen er, at den ikke er kompatibel med de foruddefinerede annotationsformværktøjer, der leveres af billedanalysesoftwaren (se materialetabellen), selvom fremtidige opdateringer /versioner af algoritmen vil sigte mod at forbedre denne kompatibilitet. .annotationsfilen for figurer, der er tegnet ved hjælp af disse værktøjer, indeholder kun to sæt parrede x- og y-koordinater for hver anmærkning uden den komplette rumlige retning omkring disse punkter. Aktuel brug af disse værktøjer resulterer i, at anmærkningerne konverteres til lige linjer, der kun er defineret af to punkter under importprocessen. Manuel definition af vævs ROI-segmenter er påkrævet for en vellykket konvertering til XML-format og LMD-import. Dette kan enten udføres ved manuelt at definere hvert investeringsafkast med individuelle polygonale anmærkninger med fri hånd, der er specifikke for målområdet, eller ved at anvende en omtrentlig cirkulær eller rektangulær annotation på tværs af alle vævs ROI-segmenter, hvis det ønskes, og vil være kompatibel med denne arbejdsgang.
Mens arbejdsgangen, der præsenteres her, blev demonstreret til proteomisk analyse af friskfrosne humane kræftvævsprøver, kan denne AI-drevne LMD-arbejdsgang tilsvarende anvendes med FFPE-væv, ikke-kræftvævstyper og dem fra ikke-menneskelige kilder. Det kan også understøtte andre downstream molekylære profileringsarbejdsgange, herunder transkriptomiske, genomiske eller phosphoproteomiske analyser. Denne arbejdsgang kan også udnytte andre anvendelser af billedanalysesoftwaren (se materialetabellen), herunder med funktioner forbundet med celletælling eller andre analytiske moduler, herunder "Multiplex IHC" -modulet eller "Tissue Microarray (TMA) Add-on". Fremtidige anvendelser af denne arbejdsgang kan også drage fordel af at foruddefinere antallet af celler pr. ROI-segment og derved sikre ækvivalente cellulære input på tværs af flere samlinger eller ved at bruge alternative metoder til at definere cellulære ROI'er af interesse, såsom ved immunhistokemi eller cellesociologi.
Disclosures
T.P.C. er medlem af ThermoFisher Scientific, Inc SAB og modtager forskningsmidler fra AbbVie.
Acknowledgments
Finansiering til dette projekt blev delvist ydet af Defense Health Program (HU0001-16-2-0006 og HU0001-16-2-00014) til Uniformed Services University for Gynecologic Cancer Center of Excellence. Sponsorerne havde ingen rolle i design, udførelse, fortolkning eller skrivning af undersøgelsen. Ansvarsfraskrivelse: De synspunkter, der udtrykkes heri, er forfatternes og afspejler ikke den officielle politik for Department of Army / Navy / Air Force, Department of Defense eller US Government.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
| 96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
| 96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
| 96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
| 9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
| Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
| Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
| Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
| BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
| EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
| EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
| Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
| Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
| ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
| HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
| IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
| iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
| iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
| limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
| LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
| LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
| Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
| Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
| Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
| PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
| Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
| PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
| Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
| Python | Python Software Foundation | ||
| Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
| R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
| RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
| Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
| TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
| Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
| ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
| ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |
References
- Motohara, T., et al. An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment. Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).
- Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nature Communications. 6, 8971 (2015).
- Hunt, A. L., et al. Extensive three-dimensional intratumor proteomic heterogeneity revealed by multiregion sampling in high-grade serous ovarian tumor specimens. iScience. 24 (7), 102757 (2021).
- Dou, Y., et al.
- Zhang, H., et al. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
- Gillette, M. A., et al. Proteogenomic characterization reveals therapeutic vulnerabilities in lung adenocarcinoma. Cell. 182 (1), 200-225 (2020).
- Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory Investigation. 90 (5), 787-796 (2010).
- Echle, A., et al. Deep learning in cancer pathology: a new generation of clinical biomarkers. British Journal of Cancer. 124 (4), 686-696 (2021).
- Lee, S., et al. Molecular analysis of clinically defined subsets of high-grade serous ovarian cancer. Cell Reports. 31 (2), 107502 (2020).
- Xuan, Y., et al. Standardization and harmonization of distributed multi-center proteotype analysis supporting precision medicine studies. Nature Communications. 11 (1), 5248 (2020).
- Hughes, C. S., et al. Quantitative profiling of single formalin fixed tumour sections: proteomics for translational research. Scientific Reports. 6 (1), 34949 (2016).
- Espina, V., et al. A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1998-2018 (2008).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A.
- Havnar, C. A., et al. Automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues. Journal of Visualized Experiments. (169), e62394 (2021).
- Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. PLoS One. 6 (8), (2011).
