Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri
Summary
Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.
Abstract
İç kulak sesi algılar ve koklea ve antreyi kullanarak dengeyi korur. Bunu, saç hücresi olarak bilinen özel bir mekanosensoriyel hücre tipi kullanarak yapar. İç kulaktaki temel araştırmalar, saç hücresinin nasıl çalıştığının ve düzensizliğin işitme kaybına ve vertigoya nasıl yol açabileceğinin derinlemesine anlaşılmasını sağlamıştır. Bu araştırma için, fare önde gelen model sistemi olmuştur. Bununla birlikte, fareler, tüm memeliler gibi, saç hücrelerini değiştirme yeteneğini kaybetmişlerdir. Bu nedenle, iç kulak fonksiyonunu geri kazanmak için hücresel tedavileri anlamaya çalışırken, diğer omurgalı türlerinde tamamlayıcı çalışmalar daha fazla bilgi sağlayabilir. Kuşların işitsel epiteli olan baziler papilla (BP), destekleyici hücreler (SC’ler) tarafından interkalize edilmiş mekanosensoriyel saç hücrelerinden (HC’ler) oluşan bir epitel tabakasıdır. Baziller papilla ve memeli kokleanın anatomik mimarisi farklı olsa da, iç kulak gelişimi ve işitmenin moleküler mekanizmaları benzerdir. Bu, baziler papillayı sadece karşılaştırmalı çalışmalar için değil, aynı zamanda rejenerasyonu anlamak için de yararlı bir sistem haline getirir. Burada, tavuk iç kulağı için diseksiyon ve manipülasyon tekniklerini açıklıyoruz. Teknik, iç kulak gelişiminin moleküler mekanizmalarını incelemek için güçlü bir araç sunan genetik ve küçük molekül inhibisyon yöntemlerini gösterir. Bu yazıda, CRIPSR-Cas9 delesyonları kullanılarak baziler papillayı genetik olarak bozmak için ovo elektroporasyon tekniklerini, ardından baziler papillanın diseksiyonunu tartıştık. Ayrıca epitel ve saç hücrelerinin gelişimini gözlemlemek için BP organ kültürünü ve kültür matrislerinin optimal kullanımını da gösteriyoruz.
Introduction
Tüm omurgalıların iç kulağı, otik plakod 1,2 olarak bilinen basit bir epitelden türetilmiştir. Bu, işitme ve denge algısı ile ilişkili mekanosensoriyel bilgiyi dönüştürmek için gerekli tüm yapısal elemanlara ve hücre tiplerine yol açacaktır. İç kulağın siliyer sensörü olan saç hücreleri (HC’ler), destekleyici hücrelerle (SC’ler) çevrilidir. HC’ler, sekizinci kranial sinirin nöronları aracılığıyla işitsel arka beyne bilgi iletir. Bunlar ayrıca otik placode3’ten de üretilir. Sesin birincil iletimi, işitsel HC’nin apikal yüzeyinde, mekanik olarak hassas bir saç demeti4 aracılığıyla elde edilir. Buna, stereocilia adı verilen modifiye aktin bazlı çıkıntılar aracılık eder ve bunlar derecelendirilmiş, merdiven deseni5’te düzenlenir. Ek olarak, kinocilium adı verilen modifiye edilmiş bir birincil siliyum, saç demeti oluşumunu düzenler ve en uzun stereosilia 6,7,8 sırasına bitişiktir. Stereosilia mimarisi, akustik enerjiden türetilen mekanik uyaranların elektriksel nöral sinyallere dönüştürülmesindeki bu rol için kritik öneme sahiptir9. Yaşlanma, enfeksiyon, otoakustik travma veya ototoksik şok yoluyla işitsel HC’nin hasar görmesi, memelilerde geri dönüşü olmayan kısmi veya tam işitme kaybına neden olabilir10.
Bu tür hasarları onarabilecek hücresel replasman tedavileri önerilmiştir11,12. Bu araştırmanın yaklaşımı, memeli kıl hücresinin normal gelişimini anlamak ve iç kulakta bulunabilecek progenitör benzeri hücrelerde gelişim programlarının yeniden başlatılıp başlatılamayacağını sormak olmuştur13. İkinci bir yaklaşım, memelilerin dışına, kuşlar gibi işitsel saç hücrelerinin sağlam bir şekilde yenilenmesinin gerçekleştiği memeli olmayan omurgalılara bakmak olmuştur14,15. Kuşlarda, saç hücresi rejenerasyonu ağırlıklı olarak destekleyici bir hücrenin progenitör benzeri bir duruma farklılaşması yoluyla gerçekleşir, bunu bir saç hücresi ve destekleyici hücre16 oluşturmak için asimetrik mitotik bölünme izler. Ek olarak, bir saç hücresi oluşturmak için bir destekleyici hücrenin doğrudan farklılaşması da gözlenmiştir17.
Kuş işitsel gelişim mekanizmaları memelilerinkiyle önemli benzerlikler gösterirken, farklılıklar vardır18. Civciv BP’deki HC ve SC farklılaşması, embriyonik gün (E) 7’den belirgindir ve zamanla daha belirgin hale gelir. E12 ile iyi desenli ve iyi polarize olmuş bir baziler papilla (BP) görselleştirilebilir ve E17 ile iyi gelişmiş saç hücreleri görülebilir19. Bu zaman noktaları, saç hücresi olgunlaşmasının yanı sıra farklılaşma, modelleme ve polarite mekanizmalarına pencereler sağlar. Bu tür mekanizmaların korunmuş mu yoksa farklı mı olduğunu anlamak, mekanosensoriyel saç hücrelerinin kökenlerinin derin homolojisine dair içgörüler sağladıkları için önemlidir.
Burada, iç kulak organının gelişimi boyunca proliferasyon, kader spesifikasyonu, farklılaşma, modelleme ve bakım gibi hücresel süreçleri incelemek için erken ve geç embriyonik aşamalarda gerçekleştirilen bir dizi tekniği gösteriyoruz. Bu, eksplant kültüründe iç kulak gelişimini anlamaya yönelik diğer protokolleri tamamlar20,21,22. İlk olarak, ovo elektroporasyonunda kullanılan E3.5 otokist içindeki BP öncüllerine eksojen DNA veya RNA’nın sokulması tartışılmıştır. Genetik manipülasyonlar değerli bilgiler sağlayabilse de, bu şekilde üretilen fenotipler pleiotropik ve sonuç olarak kafa karıştırıcı olabilir. Bu, özellikle hücre iskeleti yeniden şekillenmesi gibi temel süreçlerin hücre bölünmesi, doku morfogenezi ve hücresel uzmanlaşmada çoklu rol oynadığı daha sonraki iç kulak gelişimi sırasında geçerlidir. Kültürlü eksplantlarda farmakolojik inhibisyon için protokoller sunuyoruz, bu da dozaj ve tedavi zamanlamasını ve süresini kontrol etmede avantajlar sunuyor ve gelişimsel mekanizmaların hassas mekansal zamansal manipülasyonunu sunuyor.
Küçük inhibitörlerin tedavi süresine bağlı olarak farklı organ kültürü yöntemleri kullanılabilir. Burada, epitelyal morfogenez ve hücresel uzmanlaşma hakkında fikir sahibi olmayı sağlayan iki organ kültürü yöntemi gösterilmektedir. Koklear kanalı kültürlemek için bir matris olarak kollajen kullanan 3D kültür için bir yöntem, gelişmekte olan BP’nin sağlam kültürlenmesini ve canlı görselleştirilmesini sağlar. Stereosilia oluşumunu anlamak için, epitel dokusunun aktin çıkıntılarının serbestçe büyümesini sağlayan sert bir matris üzerinde kültürlendiği bir membran kültürü yöntemi sunuyoruz. Her iki yöntem de canlı hücre görüntüleme, immünohistokimya, taramalı elektron mikroskobu (SEM), hücre kaydı vb. gibi aşağı akış işlemlerine izin verir. Bu teknikler, kuş işitsel epitelinin gelişimini, olgunlaşmasını ve yenilenmesini anlamak ve manipüle etmek için civcivin model bir sistem olarak etkili kullanımı için bir yol haritası sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Civciv, bir laboratuvarın iç kulağı araştırmak için kullanabileceği model organizmalara uygun maliyetli ve kullanışlı bir ektir. Burada açıklanan yöntemler laboratuvarımızda rutin olarak kullanılmaktadır ve memeli iç kulağında devam eden araştırmaları tamamlamaktadır. Ovo’da elektroporasyon, civciv genomuna genetik manipülasyonlar sokmak için kullanılır. Elektroporasyon, belirli organellere veya hücre altı yapılara hedeflenen floresan proteinleri kodlayan yapıları tanıtmak içi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB ve Royal National Institute for the Deaf’ın desteğini minnetle kabul ediyoruz. Merkezi Kanatlı Geliştirme Organizasyonu ve Eğitim Enstitüsü, Hesaraghatta, Bengaluru’ya teşekkür ederiz. NCBS’deki CIFF ve EM tesisine ve laboratuvar desteğine minnettarız. Tol2-eGFP ve T2TP yapıları için Yoshiko Takahashi ve Koichi Kawakami’ye, HCA ve G19 Pcdh15 antikoru için Guy Richardson’a teşekkür ederiz. Earlab üyelerine protokol hakkındaki sürekli destekleri ve değerli geri bildirimleri için minnettarız.
Materials
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
References
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
- Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
- Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
- Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
- Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
- Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
- May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
- Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
- Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
- Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
- Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
- Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
- Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
- Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
- Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
- Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O’Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
- Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
- Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
- Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
- Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
- Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
- Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).
