In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen
Summary
Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.
Abstract
Het binnenoor neemt geluid waar en houdt het evenwicht met behulp van het slakkenhuis en de vestibule. Het doet dit door gebruik te maken van een speciaal mechanosensorisch celtype dat bekend staat als de haarcel. Fundamenteel onderzoek in het binnenoor heeft geleid tot een diep begrip van hoe de haarcel functioneert en hoe ontregeling kan leiden tot gehoorverlies en duizeligheid. Voor dit onderzoek is de muis het modelsysteem bij uitstek geweest. Muizen hebben echter, net als alle zoogdieren, het vermogen verloren om haarcellen te vervangen. Dus, bij het proberen te begrijpen van cellulaire therapieën voor het herstellen van de binnenoorfunctie, kunnen complementaire studies bij andere gewervelde soorten verdere inzichten bieden. Het auditieve epitheel van vogels, de basilaire papilla (BP), is een vel epitheel dat bestaat uit mechanosensorische haarcellen (HC’s) geïncaleerd door ondersteunende cellen (SC’s). Hoewel de anatomische architectuur van de basilaire papilla en het zoogdier slakkenhuis verschillen, zijn de moleculaire mechanismen van de ontwikkeling en het gehoor van het binnenoor vergelijkbaar. Dit maakt de basilaire papilla een nuttig systeem voor niet alleen vergelijkende studies, maar ook om regeneratie te begrijpen. Hier beschrijven we dissectie- en manipulatietechnieken voor het binnenoor van de kip. De techniek toont genetische en kleine molecuul remmingsmethoden, die een krachtig hulpmiddel bieden voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van de ontwikkeling van het binnenoor. In dit artikel bespreken we in ovo elektroporatietechnieken om de basilaire papilla genetisch te verstoren met behulp van CRIPSR-Cas9-deleties, gevolgd door dissectie van de basilaire papilla. We demonstreren ook de BP-orgaancultuur en optimaal gebruik van kweekmatrices, om de ontwikkeling van het epitheel en de haarcellen te observeren.
Introduction
Het binnenoor van alle gewervelde dieren is afgeleid van een eenvoudig epitheel dat bekend staat als de otic placode 1,2. Dit zal aanleiding geven tot alle structurele elementen en de celtypen die nodig zijn om de mechanosensorische informatie in verband met gehoor- en evenwichtsperceptie te transduceren. Haarcellen (HCs), de trilhaarsensor van het binnenoor, zijn omgeven door ondersteunende cellen (SC’s). HC’s geven informatie door aan de auditieve achterhersenen via de neuronen van de achtste hersenzenuw. Deze worden ook gegenereerd uit de otic placode3. De primaire transductie van geluid wordt bereikt aan het apicale oppervlak van de auditieve HC, door een mechanisch gevoelige haarbundel4. Dit wordt gemedieerd door gemodificeerde op actine gebaseerde uitsteeksels genaamd stereocilia, die zijn gerangschikt in een gradueel trappatroon5. Bovendien organiseert een gemodificeerd primair cilium, het kinocilium genaamd, de vorming van haarbundels en grenst het aan de hoogste rij stereocilia 6,7,8. De architectuur van stereocilia is van cruciaal belang voor deze rol bij het omzetten van mechanische stimuli afgeleid van akoestische energie naar elektrische neurale signalen9. Schade aan de auditieve HC door veroudering, infectie, otoakoestisch trauma of ototoxische shock kan leiden tot gedeeltelijk of volledig gehoorverlies dat bij zoogdieren onomkeerbaar is10.
Cellulaire vervangingstherapieën zijn voorgesteld die dergelijke schade kunnen herstellen11,12. De benadering van dit onderzoek is geweest om de normale ontwikkeling van de haarcel van zoogdieren te begrijpen en te vragen of ontwikkelingsprogramma’s opnieuw kunnen worden geïnitieerd in voorloperachtige cellen die mogelijk in het binnenoor bestaan13. Een tweede benadering is geweest om buiten zoogdieren te kijken, naar niet-zoogdier gewervelde dieren waarbij robuuste regeneratie van auditieve haarcellen plaatsvindt, zoals vogels14,15. Bij vogels vindt haarcelregeneratie voornamelijk plaats door de dedifferentiatie van een ondersteunende cel naar een voorloperachtige toestand, gevolgd door asymmetrische mitotische deling om een haarcel en ondersteunende cel16 te genereren. Daarnaast is ook directe differentiatie van een ondersteunende cel waargenomen om een haarcel te genereren17.
Hoewel de mechanismen van de auditieve ontwikkeling van vogels significante overeenkomsten vertonen met die van zoogdieren, zijn er verschillen18. HC- en SC-differentiatie in het kuiken BP is duidelijk vanaf embryonale dag (E) 7 en wordt in de loop van de tijd duidelijker. Door E12 kan een goed gevormde en goed gepolariseerde basilaire papilla (BP) worden gevisualiseerd, en door E17 kunnen goed ontwikkelde haarcellen worden gezien19. Deze tijdspunten bieden vensters op de mechanismen van differentiatie, patronen en polariteit, evenals haarcelrijping. Begrijpen of dergelijke mechanismen geconserveerd of divergent zijn, is belangrijk, omdat ze inzicht geven in de diepe homologie van de oorsprong van mechanosensorische haarcellen.
Hier demonstreren we een reeks technieken die in vroege en late embryonale stadia worden uitgevoerd om cellulaire processen te bestuderen, zoals proliferatie, lotspecificatie, differentiatie, patronen en onderhoud tijdens de ontwikkeling van het binnenoororgaan. Dit is een aanvulling op andere protocollen voor het begrijpen van de ontwikkeling van het binnenoor in explantcultuur 20,21,22. We bespreken eerst de introductie van exogene DNA of RNA in BP-precursoren binnen de E3.5-otocyste met behulp van ovo-elektroporatie. Hoewel genetische manipulaties waardevolle inzichten kunnen opleveren, kunnen de aldus gegenereerde fenotypen pleiotroop en bijgevolg verwarrend zijn. Dit geldt met name tijdens de latere ontwikkeling van het binnenoor, waar fundamentele processen zoals cytoskeletale remodellering meerdere rollen spelen bij celdeling, weefselmorfogenese en cellulaire specialisatie. We presenteren protocollen voor farmacologische remming in gekweekte explantaten, die voordelen bieden bij het beheersen van de dosering en de timing en duur van de behandeling, en die nauwkeurige spatiotemporale manipulatie van ontwikkelingsmechanismen bieden.
Verschillende orgaankweekmethoden kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de behandelingsduur van kleine remmers. Hier demonstreren we twee methoden van orgaancultuur die inzicht geven in epitheliale morfogenese en cellulaire specialisatie. Een methode voor 3D-cultuur met collageen als matrix om het cochleaire kanaal te kweken, maakt robuuste kweek en live visualisatie van de zich ontwikkelende BP mogelijk. Om de vorming van stereocilia te begrijpen, presenteren we een membraankweekmethode, zodat epitheelweefsel wordt gekweekt op een stijve matrix waardoor actine-uitsteeksels vrij kunnen groeien. Beide methoden maken downstream-verwerking mogelijk, zoals live-cell imaging, immunohistochemie, scanning elektronenmicroscopie (SEM), celregistratie, enz. Deze technieken bieden een routekaart voor het effectieve gebruik van het kuiken als een modelsysteem om de ontwikkeling, rijping en regeneratie van het auditieve epitheel van de aviaire te begrijpen en te manipuleren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het kuiken is een kosteneffectieve en handige aanvulling op de modelorganismen die een laboratorium kan gebruiken om het binnenoor te onderzoeken. De hier beschreven methoden worden routinematig gebruikt in ons laboratorium en vormen een aanvulling op lopend onderzoek in het binnenoor van zoogdieren. In ovo wordt elektroporatie gebruikt om genetische manipulaties in het kuikengenoom te introduceren. Elektroporatie kan ook worden gebruikt om constructen te introduceren die coderen voor fluorescerende eiwitten ger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de steun van NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB en het Royal National Institute for the Deaf. We willen graag de Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru bedanken. We zijn CIFF en EM-faciliteit en laboratoriumondersteuning bij NCBS dankbaar. We bedanken Yoshiko Takahashi en Koichi Kawakami voor de Tol2-eGFP en T2TP constructies, en Guy Richardson voor HCA en G19 Pcdh15 antilichaam. We zijn Earlab-leden dankbaar voor hun constante steun en waardevolle feedback op het protocol.
Materials
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
References
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
- Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
- Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
- Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
- Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
- Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
- May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
- Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
- Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
- Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
- Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
- Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
- Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
- Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
- Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
- Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O’Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
- Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
- Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
- Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
- Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
- Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
- Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).
