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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64172
Automatic Translation
*1,2, *1, *1, *1, 1
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2The University of Trans-Disciplinary Health Sciences and Technology
* These authors contributed equally

Summary

El pollito es un organismo modelo rentable, accesible y ampliamente disponible para una variedad de estudios. Aquí, se detalla una serie de protocolos para comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la regeneración del oído interno aviar.

Abstract

El oído interno percibe el sonido y mantiene el equilibrio utilizando la cóclea y el vestíbulo. Lo hace mediante el uso de un tipo de célula mecanosensorial dedicada conocida como la célula ciliada. La investigación básica en el oído interno ha llevado a una comprensión profunda de cómo funciona la célula ciliada y cómo la desregulación puede conducir a la pérdida de audición y vértigo. Para esta investigación, el ratón ha sido el sistema modelo preeminente. Sin embargo, los ratones, como todos los mamíferos, han perdido la capacidad de reemplazar las células ciliadas. Por lo tanto, al tratar de comprender las terapias celulares para restaurar la función del oído interno, los estudios complementarios en otras especies de vertebrados podrían proporcionar más información. El epitelio auditivo de las aves, la papila basilar (PA), es una lámina de epitelio compuesta de células ciliadas mecanosensoriales (HC) intercaladas por células de soporte (SC). Aunque la arquitectura anatómica de la papila basilar y la cóclea de mamíferos difieren, los mecanismos moleculares del desarrollo del oído interno y la audición son similares. Esto hace que la papila basilar sea un sistema útil no solo para estudios comparativos sino también para comprender la regeneración. Aquí, describimos técnicas de disección y manipulación para el oído interno del pollo. La técnica muestra métodos genéticos y de inhibición de moléculas pequeñas, que ofrecen una potente herramienta para estudiar los mecanismos moleculares del desarrollo del oído interno. En este artículo, discutimos técnicas de electroporación in ovo para perturbar genéticamente la papila basilar utilizando deleciones CRIPSR-Cas9, seguidas de la disección de la papila basilar. También demostramos el cultivo de órganos de PA y el uso óptimo de matrices de cultivo, para observar el desarrollo del epitelio y las células ciliadas.

Introduction

El oído interno de todos los vertebrados se deriva de un epitelio simple conocido como el placode ótico 1,2. Esto dará lugar a todos los elementos estructurales y los tipos de células necesarios para transducir la información mecanosensorial asociada con la audición y la percepción del equilibrio. Las células ciliadas (HC), el sensor ciliado del oído interno, están rodeadas por células de soporte (SC). Los HC transmiten información al cerebro posterior auditivo a través de las neuronas del octavo nervio craneal. Estos también se generan a partir del placa ótica3. La transducción primaria del sonido se logra en la superficie apical de la HC auditiva, a través de un haz de cabello mecánicamente sensible4. Esto está mediado a través de protuberancias modificadas basadas en actina llamadas estereocilios, que están dispuestas en un patrón de escalera gradual5. Además, un cilio primario modificado, llamado kinocilium, organiza la formación del haz capilar y es adyacente a la fila más alta de estereocilios 6,7,8. La arquitectura de los estereocilios es crítica para este papel en la conversión de estímulos mecánicos derivados de la energía acústica en señales neuronales eléctricas9. El daño a la HC auditiva por envejecimiento, infección, trauma otoacústico o shock ototóxico puede resultar en pérdida parcial o completa de la audición que, en los mamíferos, es irreversible10.

Se han propuesto terapias de reemplazo celular que podrían reparar ese daño11,12. El enfoque de esta investigación ha sido comprender el desarrollo normal de las células ciliadas de mamíferos y preguntar si los programas de desarrollo pueden reiniciarse en células progenitoras que pueden existir dentro del oído interno13. Un segundo enfoque ha sido mirar fuera de los mamíferos, a vertebrados no mamíferos en los que se produce una regeneración robusta de las células ciliadas auditivas, como las aves14,15. En las aves, la regeneración de las células ciliadas ocurre predominantemente a través de la desdiferenciación de una célula de soporte a un estado similar al progenitor, seguida de una división mitótica asimétrica para generar una célula ciliada y una célula de soporte16. Además, también se ha observado diferenciación directa de una célula de soporte para generar una célula ciliada17.

Si bien los mecanismos del desarrollo auditivo aviar muestran similitudes significativas con los de los mamíferos, existen diferencias18. La diferenciación de HC y SC en la PA del pollo es evidente desde el día embrionario (E) 7, volviéndose más clara con el tiempo. Para E12, se puede visualizar una papila basilar (PA) bien modelada y bien polarizada, y para E17 se pueden ver células ciliadas bien desarrolladas19. Estos puntos de tiempo proporcionan ventanas a los mecanismos de diferenciación, patrones y polaridad, así como a la maduración de las células ciliadas. Comprender si tales mecanismos se conservan o divergen es importante, ya que proporcionan información sobre la profunda homología de los orígenes de las células ciliadas mecanosensoriales.

Aquí, demostramos una serie de técnicas realizadas en etapas embrionarias tempranas y tardías para estudiar procesos celulares como la proliferación, la especificación del destino, la diferenciación, el patrón y el mantenimiento a lo largo del desarrollo del órgano del oído interno. Esto complementa otros protocolos para comprender el desarrollo del oído interno en el cultivo de explantes20,21,22. Primero discutimos la introducción de ADN o ARN exógeno en precursores de PA dentro del otocisto E3.5 utilizando electroporación in ovo. Aunque las manipulaciones genéticas pueden proporcionar información valiosa, los fenotipos así generados pueden ser pleiotrópicos y, en consecuencia, confusos. Esto es particularmente cierto durante el desarrollo posterior del oído interno, donde los procesos fundamentales como la remodelación citoesquelética desempeñan múltiples funciones en la división celular, la morfogénesis tisular y la especialización celular. Presentamos protocolos de inhibición farmacológica en explantes cultivados, que ofrecen ventajas en el control de la dosis y el tiempo y duración del tratamiento, ofreciendo una manipulación espaciotemporal precisa de los mecanismos de desarrollo.

Se pueden utilizar diferentes métodos de cultivo de órganos dependiendo de la duración del tratamiento de los inhibidores pequeños. Aquí demostramos dos métodos de cultivo de órganos que permiten comprender la morfogénesis epitelial y la especialización celular. Un método para el cultivo 3D utilizando colágeno como matriz para cultivar el conducto coclear permite un cultivo robusto y una visualización en vivo de la PA en desarrollo. Para comprender la formación de estereocilios, presentamos un método de cultivo de membrana tal que el tejido epitelial se cultiva en una matriz rígida que permite que las protuberancias de actina crezcan libremente. Ambos métodos permiten el procesamiento posterior, como imágenes de células vivas, inmunohistoquímica, microscopía electrónica de barrido (SEM), registro celular, etc. Estas técnicas proporcionan una hoja de ruta para el uso efectivo del pollito como un sistema modelo para comprender y manipular el desarrollo, la maduración y la regeneración del epitelio auditivo aviar.

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Protocol

Los protocolos relacionados con la obtención, el cultivo y el uso de huevos de gallina fertilizados y embriones no eclosionados fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal del Centro Nacional de Ciencias Biológicas, Bangalore, Karnataka.

1. Electroporación in ovo de precursores auditivos de pollitos

  1. Diseño y clonación de sgRNA para la eliminación del gen CRISPR/Cas9
    1. Para crear knockouts genéticos, diseñe ARN guía para interrumpir las regiones de exón del gen, preferiblemente más cerca del extremo 5' de la región codificante.
    2. Seleccione los posibles ARN guía utilizando una herramienta web CRISPOR23. Establezca los datos del navegador en Gallus gallus y la secuencia de motivos adyacentes del protoespaciador (PAM) en 5'- NGG -3'. El programa determina los ARN guía de la secuencia de entrada y asigna diferentes puntuaciones basadas en la actividad objetivo y fuera del objetivo. Seleccione las cuatro mejores guías para estudios adicionales.
    3. Para el diseño de oligos específicos de plantilla para la producción de (g)ARN guía, elimine la secuencia PAM (5′- NGG -3′) de la salida de la herramienta de diseño de ARNg. Esto no es necesario para la focalización, pero contiene la secuencia de reconocimiento de escisión Cas9. Sintetizar dos oligos complementarios purificados por HPLC con sitio de restricción de BsmBI en ambos extremos, para cada gRNA potencial.
    4. Clone la secuencia guía en el marco con un andamio de tracrRNA de un vector de elección (aquí, pcU6_1sgRNA vector se usó24).
    5. Disuelva los oligonucleótidos de ARNg a una concentración de 100 μM en agua libre de DNasa/RNasa. Realizar recocido de las dos guías oligo sentido y antisentido utilizando un termociclador con los siguientes parámetros: 95 °C durante 3 min, luego 37 °C durante 15 min, y luego disminuir a 4 °C.
    6. Utilizando técnicas estándar de biología molecular como se describe en25, configuró la digestión de restricción de los oligos recocidos y pcU6_1sgRNA vector de clonación con la enzima BsmBI durante la noche. Configuración de la ligadura con el vector pcU6_1sgRNA lineal gesto-gélido por BsmBI y oligos sgRNA digeridos. Transformarse en una célula competente DH5-alfa y confirmar la secuencia del clon obtenido.
  2. Manipulación de huevos y ventanas
    1. Obtenga huevos recién puestos y límpielos limpiándolos con etanol al 70% para evitar la contaminación. Incubar a 37-38 °C, con 45% de humedad durante 3,5-4 días.
    2. Después de la incubación, coloque el huevo de lado durante al menos 5 minutos antes de abrirlo. Esto permite que el embrión se reposicione en la parte superior de la yema. Use fórceps para hacer pequeños agujeros en la parte superior y en el extremo romo del huevo, de modo que pueda pasar una aguja 21G.
    3. Para evitar daños durante la ventana, retire la albúmina para bajar el embrión lejos de la cáscara. Para hacer esto, use una jeringa de 5 ml y una aguja de 21G para extraer cuidadosamente 2 ml de albúmina de un orificio en el extremo romo del huevo. Use cinta adhesiva transparente para cubrir el agujero en el extremo romo.
    4. Para hacer la ventana del huevo, coloque cinta adhesiva transparente en la parte superior de la cáscara del huevo. Abra una ventana, de unos 2 cm de largo y 1,5 cm de ancho, con tijeras de arco de resorte y exponga el embrión. Use fórceps para abrir las membranas coriónicas que recubren el embrión, permitiendo el acceso al embrión.
  3. Plásmidos de microinyección
    1. Para el experimento de eliminación de genes, prepare dos soluciones: la mezcla de knock-down que contiene la proteína SpCas9 y el plásmido guía - pcU6_1sgRNA, y la mezcla de plásmido trazador de T2K-eGFP (este es un promotor de Ο-actina de pollo que impulsa el casete GFP rodeado por los sitios de transposón de Tol2) junto con el T2TP (la transposasa Tol2 clonada en la construcciónTol2 26,27). El trazador se utiliza para rastrear la eficiencia de la electroporación.
    2. Al electroporar plásmidos múltiples, asegúrese de que la concentración final de ADN sea de al menos 4 μg / μL. Mezcle los tres constructos, plásmido guía: pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP y T2TP, en una proporción de 1: 1: 1 con 1 μg de proteína SpCas9, 30% de sacarosa y 0.1% de colorante verde rápido en un volumen final de 10 μL.
    3. Extraiga agujas para microinyección de capilares de vidrio estándar (longitud 3 pulgadas, OD 1,0 mm) utilizando un extractor de pipeta vertical. Use pinzas finas para romper la punta capilar después de tirar para obtener un diámetro de punta de aproximadamente 50 μm con un extremo cónico.
    4. Coloque los embriones en E3.5 en su lado izquierdo con la cabeza hacia la derecha. De esta manera, solo la vesícula ótica derecha es accesible para la microinyección. Microinyecte la mezcla de derribo en la vesícula ótica. Inyecte alrededor de un volumen de 200 nL de mezcla de solución de ADN para llenar la vesícula ótica.
    5. Determinar la eficiencia de la guía utilizando un ensayo de endonucleasa T728.
  4. Electroporación
    1. Agregue unas gotas de solución salina al 0,719% sobre el embrión antes de la electroporación para reducir la resistencia eléctrica y evitar el sobrecalentamiento del embrión.
    2. Coloque el electrodo positivo a través del orificio hecho en el lado romo del huevo cuando se extrajo la albúmina. Maniobra el electrodo para que quede debajo de la yema. Coloque el electrodo negativo sobre el otocisto lleno.
    3. Utilice la electroporación para transfectar plásmidos en las células del embrión. Utilice un generador de pulsos cuadrados y aplique cinco pulsos de 25 V y 100 ms de duración cada uno, separados por 50 ms. Determinar las condiciones empíricamente basándose en una configuración de electroporación individual.
    4. Hidratar el embrión después de la electroporación añadiendo unas gotas de solución salina al 0,719%. Para limpiar la albúmina desnaturalizada de la superficie de los electrodos, enjuáguela bien con agua destilada. Vuelva a sellar el huevo con cinta adhesiva transparente y vuelva a la incubadora humidificada a 37-38 °C para su posterior incubación.
      NOTA: Los embriones se pueden cultivar hasta la eclosión después de la electroporación, sin embargo, hay una fuerte reducción en la viabilidad.

2. Disección de papila basilar

  1. Use etanol al 70% para desinfectar la mesa quirúrgica, la etapa del microscopio y el área circundante. El calor o el alcohol esterilizan el equipo de microdisección que incluye tijeras de arco de resorte mínimo, microcureta y dos pares de pinzas finas.
  2. Prepare las siguientes placas de disección: una placa de Petri de vidrio con una base de silicio negro, una placa de Petri de plástico de 90 mm y una placa de Petri de 60 mm. Enfríe la solución salina tamponada con fosfato (PBS) o la solución salina balanceada de Hanks (HBSS) para las disecciones.
  3. Rompe suavemente el huevo en la placa de Petri de 90 mm. Identifica la oreja externa del pollito. Decapitar el embrión cortando el cuello justo por debajo del nivel de la mandíbula inferior con unas tijeras. Transfiera el cabezal a una placa de Petri de 60 mm llena de PBS helado.
  4. Oriente el embrión con la parte superior del pico mirando hacia el experimentador y sostenga el pico usando uno de los pinzas # 5. Saque los ojos con el segundo pinza #5. Pasando de rostral a caudal, corta el cráneo a lo largo de su línea media. Saca el cerebro.
  5. Agregue más PBS o HBSS helado y ubique las dos estructuras brillantes, cerca del nivel del pabellón auricular. Estos son los otolitos de la lagena al final del conducto coclear y se encuentran cerca de la línea media.
  6. Corte aproximadamente entre las dos lagenas, y muy por encima y por debajo de esta región para aislar dos oídos internos. Bajo iluminación oblicua, visualice el contorno del oído interno. Retire el tejido extraño y el vestíbulo.
  7. Transfiera la cóclea aislada a una placa base de silicona negra con PBS helado. Usando fórceps #5, retire la cápsula coclear cartilaginosa para obtener el conducto coclear. Localice la capa ondulada (tegmento) del conducto coclear y retire usando pinzas #55 para exponer la PA. Usando pinzas #55, retire la membrana tectorial para exponer HC y SC.

3. Cultivo de explantes de papila basilar

  1. Cultivo de membrana de la PA
    1. Tome una placa de cultivo de tejido de seis pocillos y coloque un inserto de membrana de cultivo por pocillo.
    2. Recoger la papila basilar disecada (explante) en una pipeta de 200 μL con 1x tampón HBSS y transferirla a una membrana. Para evitar que el tejido se pegue a la pared de la pipeta, extraiga algunos medios antes de aspirar el tejido.
    3. Oriente el explante de tal manera que la papila basilar quede hacia arriba, de modo que el pelo y las células de soporte sean visibles desde la parte superior29. Una vez posicionado el explante, aspire lentamente el tampón HBSS desde la superficie de la membrana de cultivo. En este proceso, el explante se unirá a la membrana de cultivo.
    4. Agregue 1.2 ml de medio de cultivo Eagle (DMEM) modificado de Dulbecco entre el inserto de membrana y la pared del pozo para llenar los pozos de la placa de seis pocillos. Se pueden cultivar hasta seis explantes en una sola membrana de cultivo de 30 mm.
  2. Cultivo de colágeno del conducto coclear
    1. Prepare la mezcla de colágeno agregando 400 μL de 3 mg/ml de colágeno de cola de rata, 50 μL de 10x DMEM, 30 μL de NaHCO3 al 7,5% y 5 μL de HEPES en una campana de cultivo de tejidos.
    2. Tome un plato de cuatro pocillos y agregue tres gotas de mezcla de colágeno en cada pocillo. Transfiera el conducto coclear disecado a cada gota de colágeno. Incubar la placa durante 10 min a 37 °C, 5% deCO2 para curar la matriz de colágeno.
  3. Tratamiento de cultivos con moléculas pequeñas
    1. Preparar medios de cultivo (DMEM, suplemento N-2, penicilina) con el modulador farmacológico o su disolvente solo (para su uso como control). Reemplace los medios de cultivo con 700 μL de medios suplementados con el inhibidor. Cultivar los explantes en una incubadora a 37 °C, 5%CO2.
    2. Reemplace el 50% de los medios de cultivo todos los días. Después del tiempo de incubación adecuado, retire los medios de cultivo y utilice los explantes para ensayos posteriores.

4. Imágenes y análisis

  1. Análisis inmunofluorescente
    1. Retire los medios de cultivo de los pozos y lave los explantes dos veces con 1x HBSS. Con una pipeta, añadir 1 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% al pocillo e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
    2. Retire el PFA y lave los explantes tres veces con 1x PBS a temperatura ambiente. Para recoger los explantes de la membrana de cultivo, haga un pequeño corte alrededor de la membrana que contiene la pieza del tejido con tijeras de arco de resorte pequeñas y transfiera el tejido junto con la membrana a una placa de cultivo de 48 pocillos usando fórceps.
      NOTA: Si los tejidos están flotando después de la fijación, aspire con una pipeta de 200 μL y transfiérala a placas de 48 pocillos para su posterior procesamiento. Evite el desprendimiento forzado del tejido de la membrana.
    3. Para el cultivo de gotitas de colágeno, use fórceps para transferir toda la gota de colágeno a una placa de silicio. Agregue 200 μL de 1x PBS y elimine el colágeno con la ayuda de fórceps, y luego transfiera el tejido a una placa de cultivo de 48 pocillos.
    4. Permeabilizar los explantes con 1 mL de 1x PBS suplementado con 0,3% de Tween-20 (PBST) durante 30 min a temperatura ambiente. Incubar los explantes con 200 μL de tampón de bloqueo (10% de suero de cabra + 1% de albúmina sérica bovina en PBST) durante 1 h a temperatura ambiente.
    5. Incubar los explantes con 200 μL de solución de anticuerpos primarios (1:300, en tampón de bloqueo) durante la noche a 4 °C. Retire la solución de anticuerpos primarios y lave bien los explantes 5 x 20 min con PBST.
    6. Incubar los explantes con 200 μL de faloidina y solución de anticuerpos secundarios (en tampón de bloqueo) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Retire la solución de faloidina y anticuerpos secundarios y lave bien los explantes 5 x 20 min con PBST.
      NOTA: La concentración secundaria de anticuerpos y la longitud de lavado deben determinarse para cada aplicación de imagen individual. Para las imágenes utilizando microscopía de súper resolución, normalmente aumentamos la concentración del anticuerpo secundario de 1:500 a 1:200 y aumentamos la concentración de faloidina de 1:400 a 1:200.
    7. Incubar los explantes con una solución de DAPI (1:1000 en PBST) durante 15 min a temperatura ambiente. Retire la solución DAPI y lave los explantes 3 x 5 min con PBST.
    8. Utilice el medio de montaje para montar explantes en una guía con la presión arterial hacia arriba (contra el cubreobjetos). Para imágenes confocales, utilice medios de montaje antidecoloración. Deje que el medio de montaje se seque durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Imagine directamente o guarde las diapositivas a 4 °C hasta que se le dé la imagen.
  2. Fijación OTOTO para análisis SEM
    1. Prepare todas las soluciones frescas y manipule de acuerdo con las pautas de seguridad locales. Fijar explantes cultivados por membrana (a partir del paso 4.1.4) en glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato sódico 0,1 M (pH 7,3) con 3 mM CaCl2. Realizar la fijación a 4 °C durante 24 a 72 h con un cambio de fijador cada 24 h.
    2. Retire el fijador y lave el pañuelo con cacodilato de sodio 0,1 M 3 x 5 min a temperatura ambiente. Fijación secundaria con OsO 4 al 1% (diluido a partir de una cepa de OsO 4 al4% utilizando tampón de cacodilato de sodio 0,1 M) durante 1 h a temperatura ambiente. Realice esto y los pasos posteriores hasta la deshidratación en una campana extractora.
    3. Enjuagar con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M 3 x 5 min a temperatura ambiente. Luego enjuague con agua doble destilada o ultrapura 3 x 5 min a temperatura ambiente.
    4. Prepare una solución al 0,5% de tiocarbohidrazida (TCH) en agua ultrapura. Revuelva a 75 °C durante 10 min y filtre la solución cuando se haya enfriado a temperatura ambiente.
      NOTA: TCH es extremadamente peligroso. El uso debe ser aprobado por el comité de seguridad local, y se debe tener cuidado al manipularlo.
    5. Retire el agua ultrapura de la muestra y agregue 0.5% de TCH gota a gota. Si la solución se vuelve marrón, deténgase y enjuague la muestra con agua ultrapura, antes de agregar cuidadosamente la solución de TCH al 0,5%. Una vez que la solución esté clara, reemplácela con 0.5% TCH. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min30,31.
    6. Enjuague la muestra con agua ultrapura 3 x 5 min a temperatura ambiente. Repita los pasos 4.2.2, 4.2.3 y 4.2.5 dos veces más terminando con la incubación de OsO4 seguida de enjuague.
    7. Deshidratar las muestras en una serie de etanol a etanol 100% anhidro (EtOH). Incubar primero en 25% ETOH durante 10 min, luego 50% ETOH durante 10 min, 75% EtOH durante 10 min, 95% ETOH durante 10 min, antes de incubar por un total de 3x durante 10 min cada uno en 100% ETOH.
    8. Realizar el secado del punto crítico utilizandoCO2 líquido. Monte inmediatamente las muestras en un talón SEM con cinta adhesiva de carbono de doble cara. Proceda a pulverizar la capa para proporcionar 5-10 nm de recubrimiento. Si no se obtienen imágenes inmediatamente, almacene las muestras en un desecador al vacío.

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Representative Results

En la configuración de electroporación, el posicionamiento del electrodo puede desempeñar un papel en el dominio de la transfección. El electrodo positivo se coloca debajo de la yema, y el negativo sobre el embrión (Figura 1A). Esto da como resultado una mayor expresión de GFP en gran parte del oído interno y ambos órganos vestibulares (Figura 1B) y papila basilar auditiva (Figura 1C, D), lo que confirma la transfección.

Al evaluar el fenotipo de los knockdowns CRISPR, diseñamos ARN guía para el factor de transcripción de células ciliadas Atonal homólogo 1 (Atoh1). Los mutantes de ratón de Atoh1 son incapaces de formar células ciliadas32; después de la electroporación de los ARN guía de Atoh1 y la incubación hasta E10, encontramos que el desarrollo de HC se ve afectado en comparación con el control y el control de plásmidos vacíos (Figura 2). Aunque la electroporación es mosaico (Figura 2E,F), las células electroporadas de control son capaces de formar células ciliadas. En muestras electroporadas de ARNg de Atoh1, las células positivas para GFP nunca muestran los marcadores de desarrollo de HC (Figura 2B).

El cultivo de órganos de la PA proporciona accesibilidad al tejido. Los cultivos en una matriz 3D, como el colágeno, proporcionan una excelente preservación de la morfología del tejido durante un máximo de 5 días. La organización de HC y SC se mantiene en estas condiciones de cultivo (Figura 3).

Los cultivos de órganos en una membrana son preferibles para obtener imágenes de estereocilios. Tales cultivos se pueden cultivar hasta por 5 días mientras se mantiene la integridad del paquete capilar. Esto se puede ver por la localización de la proteína de enlace de punta, protocadherina 1533 (Pcdh15) (Figura 4). Para interrogar el desarrollo del haz de pelo, se necesitan imágenes de mayor resolución, y tales enfoques, utilizando microscopía de súper resolución (Figura 4D) o microscopía electrónica de barrido (Figura 4E), proporcionan información más completa.

Figure 1
Figura 1. La expresión de GFP es visible en E10 después de la electroporación in ovo en E4. (A) Diagrama esquemático que ilustra la microinyección in ovo y la electroporación en vesícula ótica de pollo en E4. La pipeta de inyección se llena con plásmidos Tol2-eGFP (T2K-eGFP) y Tol2-transposasas (T2TP), junto con un colorante verde rápido para la visualización. (B) Imagen del oído interno electroporado en E10 usando una lente de objetivo de aire 0.63x en un microscopio estereoscópico. El oído interno izquierdo es el control interno. La flecha roja marca la expresión de GFP en el conducto coclear del oído interno derecho, y el asterisco rojo muestra la expresión de GFP en órganos vestibulares; La barra de escala es de 2 cm. (C) Imagen de fluorescencia de campo amplio de una sección transversal del conducto coclear derecho utilizando un objetivo de aire 20x de 0.5 NA. La expresión de GFP se limita principalmente al epitelio sensorial; La barra de escala es de 10 μm. (D) Imagen confocal de la papila basilar de montaje completo fotografiada utilizando un objetivo de aire 10x de 0.5 NA teñido con faloidina conjugada con fluoróforo Alexa 647. La expresión de GFP se observa desde el extremo proximal hasta el distal en el lado neural de la PA; La barra de escala es de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. La eliminación del gen Atoh1 mediada por CRISPR / Cas9 a través de la electroporación ovo produce la pérdida de células ciliadas (HC). El plásmido guía del gen Atoh1 pcU6_1-Atoh1sgRNA y los plásmidos trazadores Tol2-eGFP (T2K-eGFP) y Tol2-transposasas (T2TP) con proteína SpCas9 se microinyectan y electroporan en vesícula ótica de pollo en E4. Todas las imágenes son de la papila basilar E10 del pollito con una barra de escala de 10 μm, capturadas con un objetivo de inmersión en aceite de 60x de 1.42 NA utilizando un microscopio confocal láser. Se proporcionan inserciones ampliadas para todas las imágenes. (A,B,C,D) El panel izquierdo contiene PA con células ciliadas (HC), electroporada con pcU6_1sgRNA vacía y T2K-eGFP, y T2TP con proteína SpCas9. (E,F,G,H) El panel lateral derecho contiene PA con pérdida de HC, electroporada con guía Atoh1 (pcU6_1-Atoh1sgRNA) y T2K-eGFP, y T2TP con proteína SpCas9. (A,E) Imagen combinada que muestra las células ciliadas (HC) en la papila basilar. Estos son inmunorreactivos para la miosina 7a (azul); F-actina teñida con faloidina conjugada con Alexa 647 (rojo); La expresión de GFP de los plásmidos Tol2-eGFP se detecta utilizando un anticuerpo anti-GFP (verde). La pérdida de HC es evidente a partir de la inmunorreactividad de la miosina 7a cuando se comparan los tratamientos con pcU6_1sgRNA vacía (D) y pcU6_1-Atoh1sgRNA (H). Las imágenes de actina F de ambos tratamientos resaltan el haz de cabello de la HC (B, F). (C,G) T2K-eGFP y T2TP se utilizan para medir la ubicación y la eficiencia de la transfección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. El cultivo de órganos del conducto coclear en el cultivo de gotitas de colágeno 3D mantiene la organización del epitelio sensorial. La PA en E10 se cultiva en un cultivo de gotas de colágeno 3D durante 1 día y se obtiene una imagen utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 60x de 1.42 NA utilizando un microscopio confocal láser. (A) Imagen de PA completa de E10 cultivada durante 1 día en una gota de colágeno y teñida con anticuerpos contra el antígeno de las células ciliadas (HCA)34. La barra de escala es de 100 μm. (B) Imagen combinada que muestra la organización preservada del epitelio sensorial del lado distal de la PA teñida con (C) faloidina (verde) y (D) HCA (azul); La barra de escala es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Haces estereociliares de papila basilar bajo microscopio electrónico y óptico. La PA tratada con dimetilsulfóxido (DMSO) al 0,1% se explantó en E10 y se cultivó durante 3 días in vitro (DIV) en insertos de cultivo de membrana. (A) Explant se visualiza utilizando un objetivo de inmersión en aceite 60x de 1.42 NA con un microscopio confocal de escaneo láser. La imagen combinada muestra la expresión de la protocadherina 15 (Pcdh15) y estereocilios marcados por faloidina conjugada con Alexa 488 (verde). Se muestran imágenes de un solo canal de F-actina ( B) y Pcdh15 (C). La barra de escala es de 10 μm. (D) Imagen de superresolución de estereocilios teñidos con faloidina conjugada con tinción de Alexa 488 en verde. La imagen se obtuvo utilizando un objetivo de inmersión en aceite 63x de 1.42 NA en modo Airyscan de microscopio confocal de escaneo láser. La barra de escala es de 5 μm. (E) La imagen SEM se tomó con un aumento de 16340x utilizando un voltaje de alta tensión (EHT ) de electrones de 7 kV. El asterisco rojo marca la kinocilia y la cuña roja marca los estereocilios. El brillo y el contraste se ajustaron a automático y la imagen se afiló con FIJI. La barra de escala es de 1 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El pollito es una adición rentable y conveniente a los organismos modelo que un laboratorio puede usar para investigar el oído interno. Los métodos descritos aquí se utilizan rutinariamente en nuestro laboratorio y complementan la investigación en curso en el oído interno de los mamíferos. La electroporación in ovo se utiliza para introducir manipulaciones genéticas en el genoma del pollo. La electroporación también puede ser utilizada para introducir constructos que codifican proteínas fluorescentes dirigidas a orgánulos particulares o estructuras subcelulares35,36. Si bien este es un procedimiento simple, la manipulación de embriones in ovo afecta la viabilidad. Para una electroporación eficiente, los huevos deben obtenerse frescos (poco después de la puesta). Con frecuencia se observa un aumento en la mortalidad y / o desarrollo anormal en huevos que han estado almacenados durante más de 5 días. El uso de la técnica estéril, asegurando que el óvulo esté debidamente sellado para que no pierda humedad, y minimizando las manipulaciones realizadas en el embrión mejoran la viabilidad.

Encontramos que dirigirse al otocisto en E3.5 a E4 reduce el trauma que enfrenta el embrión, y el uso de electrodos cuidadosamente colocados permite una buena orientación de los precursores sensoriales de la PA. Sin embargo, en esta etapa, los precursores del ganglio acústico-vestibular ya han migrado lejos del oído interno37,38. Para dirigirse a estas células, se deben seleccionar puntos de tiempo más tempranos para la electroporación de otocistos y hacer adaptaciones para la disminución correspondiente de la viabilidad. Otra nota de precaución es la posibilidad de mosaicismo en embriones electroporados. No todas las células ocupan todo el plásmido, y por lo tanto el mosaicismo puede confundir la interpretación. El uso de plásmidos trazadores ayuda en la interpretación de datos y proporciona cierto control sobre los posibles efectos de mosaico. El uso de repeticiones múltiples, análisis cuidadosos y métodos estadísticos ayudarán en la evaluación de los fenotipos en mosaico. Un enfoque alternativo es utilizar codornices modificadas genéticamente39. Actualmente, estos números son limitados y no siempre están disponibles para muchos laboratorios. Sin embargo, la disponibilidad aumentará, y los embriones de codorniz, que expresan constitutivamente proteínas fluorescentes dirigidas subcelularmente, son una propuesta atractiva para los experimentos de imágenes.

En este método, electroporamos proteínas y ADN para derribos mediados por CRISPR a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ)24. La generación mediada por CRISPR / Cas9 de construcciones de fusión a través de la reparación dirigida por homología (HDR) sigue siendo ineficiente en este paradigma particular (Singh et al., observaciones no publicadas). El método de electroporación se puede adaptar para su uso con otros tipos de construcciones de ADN (estas podrían ser construcciones que codifican proteínas de fusión), así como para ARN y proteína. Cabe señalar que durante el desarrollo (y la división celular) las construcciones de expresión basadas en el ADN se diluirán a menos que el vector incorpore sitios que medien la inserción del ADN exógeno en el genoma de estas células (por ejemplo, Tol2 o PiggyBac). Esto permite una expresión más estable del constructo.

Después de la electroporación, los embriones generalmente se cultivan in ovo hasta la etapa E10 para estudios de diferenciación y desarrollo de células ciliadas. Pero si es necesario, el cultivo in ovo se puede continuar hasta que los huevos eclosionen; Sin embargo, con el aumento de la duración de la incubación hay una caída correspondiente en la viabilidad. Para evitar esto, la electroporación in ovo puede combinarse con disecciones de PA seguidas de cultivo ex ovo a largo plazo. El cultivo de explantes dentro de una matriz 3D permite una buena preservación de la morfología del tejido. Este método se puede utilizar para estudiar los cambios en el patrón tisular, la polaridad y la diferenciación. El cultivo de la PA sobre una membrana permite la visualización del lado apical del tejido27, particularmente imágenes de alta resolución de los estereocilios.

En algunos casos, las limitaciones de la modificación genética se pueden superar mediante el uso de diferentes tratamientos basados en moléculas pequeñas. Los compuestos farmacológicamente activos actúan como inhibidores o agonistas para las vías de señalización o procesos biológicos celulares. Su aplicación es particularmente útil para diseccionar el requisito temporal. Sin embargo, los modos exactos de administración y las concentraciones óptimas deben determinarse empíricamente, ya que en algunos casos la estandarización realizada en líneas celulares no es comparable a la dosis requerida en los tejidos. El parto dentro del embrión puede ser problemático, y la cantidad necesaria combinada con el impacto en otros sistemas de órganos puede comprometer significativamente la viabilidad. Una alternativa lista son los métodos de cultivo de órganos20,21,22. Sin embargo, el método de cultivo exacto depende de los tipos de estudio y análisis que se pretenden. Mientras que el cultivo de colágeno preserva la morfología tisular de la PA, el cultivo de membrana es más adecuado para estudiar los haces de pelo apical de la HC. El tejido simplemente se puede colocar en la parte superior de la membrana para visualizar la superficie apical utilizando microscopía electrónica de barrido o microscopía de súper resolución. Las disecciones para cultivo de órganos requieren buenas prácticas. Estos incluyen el mantenimiento de un espacio de trabajo estéril y el uso de instrumentos afilados. Tales herramientas de microdisección son sensibles, y encontramos que el uso de platos de silicio es importante para preservar la integridad de las herramientas microquirúrgicas.

Juntas, las técnicas representan enfoques valiosos para promover la comprensión del desarrollo del oído interno. Los conocimientos en biología comparativa y regeneración que ofrecen los embriones de pollo pueden proporcionar información significativa sobre el desarrollo y la función de las células ciliadas.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos el apoyo de NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB y el Royal National Institute for the Deaf. Nos gustaría agradecer a la Organización Central de Desarrollo Avícola y al Instituto de Capacitación, Hesaraghatta, Bangalore. Estamos agradecidos con el apoyo de laboratorio y las instalaciones de CIFF y EM en NCBS. Agradecemos a Yoshiko Takahashi y Koichi Kawakami por las construcciones Tol2-eGFP y T2TP, y a Guy Richardson por HCA y el anticuerpo G19 Pcdh15. Agradecemos a los miembros de Earlab por su apoyo constante y valiosos comentarios sobre el protocolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 Integrated DNA Technologies 1081061 High fidelity Cas9 protein
Anti-GFP antibody Abcam ab290 Rabbit polyclonal to GFP
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Calcium Chloride Dihydrate Thermo Fisher Scientific Q12135
Collagen I, rat tail Thermo Fisher Scientific A1048301
Critical Point Dryer Leica EM CPD300 Leica
CUY-21 Electroporator Nepagene
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
DM5000B Widefield Microscope Leica
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569010
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252
Fluoroshield Sigma-Aldrich F6182
FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope Olympus
Glutaraldehyde (25 %) Sigma-Aldrich 340855
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11001
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A-11032
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
Goat Serum Sterile filtered HiMedia RM10701 Heat inactivated
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14025092
LSM980 Airyscan Microscope Zeiss
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm Sigma-Aldrich PICM03050
MVX10 Stereo Microscope Olympus
MYO7A antibody DSHB 138-1 Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa
MZ16 Dissecting microscope Leica
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502048
Noyes Scissors, 14cm (5.5'') World Precision Instruments 501237
Osmium tetroxide (4%) Sigma-Aldrich 75632
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PC-10 Puller Narishige
pcU6_1sgRNA Addgene 92395 Mini vector with modified chicken U6 promoter
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich P3032
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
SMZ1500 Dissecting microscope Nikon
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M Electron Microscopy Sciences 11652
Sodium chloride HiMedia GRM853
Sputtre Coater K550X Emitech
Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament World Precision Instruments 1B100-3
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
The MERLIN Compact VP Zeiss
Thiocarbohydrazide Alfa Aesar L01205
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379

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References

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Biología del desarrollo Número 184
<em>Métodos In</em> Ovo y <em>Ex Ovo</em> para estudiar el desarrollo del oído interno aviar
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Singh, N., Prakash, A., Chakravarthy, S. R., Kaushik, R., Ladher, R. K. In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development. J. Vis. Exp. (184), e64172, doi:10.3791/64172 (2022).

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