ओवो और एक्स ओवो विधियों में एवियन इनर कान के विकास का अध्ययन करने के लिए
Summary
चूजा विभिन्न अध्ययनों के लिए एक लागत प्रभावी, सुलभ और व्यापक रूप से उपलब्ध मॉडल जीव है। यहां, एवियन आंतरिक कान के विकास और पुनर्जनन के अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला विस्तृत है।
Abstract
आंतरिक कान ध्वनि को समझता है और कोक्ले और वेस्टिब्यूल का उपयोग करके संतुलन बनाए रखता है। यह एक समर्पित मेकेनोसेंसरी सेल प्रकार का उपयोग करके ऐसा करता है जिसे हेयर सेल के रूप में जाना जाता है। आंतरिक कान में बुनियादी शोध ने इस बात की गहरी समझ पैदा की है कि बाल कोशिका कैसे कार्य करती है, और कैसे डिसरेग्यूलेशन से सुनवाई हानि और चक्कर आ सकता है। इस शोध के लिए, माउस पूर्व-प्रतिष्ठित मॉडल प्रणाली रहा है। हालांकि, चूहों, सभी स्तनधारियों की तरह, बालों की कोशिकाओं को बदलने की क्षमता खो चुके हैं। इस प्रकार, आंतरिक कान समारोह को बहाल करने के लिए सेलुलर उपचारों को समझने की कोशिश करते समय, अन्य कशेरुक प्रजातियों में पूरक अध्ययन आगे अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। पक्षियों का श्रवण उपकला, बेसिलर पैपिला (बीपी), एपिथेलियम की एक शीट है जो मेकेनोसेंसरी हेयर सेल (एचसी) से बना होता है जो सहायक कोशिकाओं (एससी) द्वारा परस्पर जुड़ा होता है। यद्यपि बेसिलर पैपिला और स्तनधारी कोक्लेया की शारीरिक वास्तुकला भिन्न होती है, आंतरिक कान के विकास और सुनवाई के आणविक तंत्र समान होते हैं। यह बेसिलर पैपिला को न केवल तुलनात्मक अध्ययन के लिए बल्कि पुनर्जनन को समझने के लिए एक उपयोगी प्रणाली बनाता है। यहां, हम चिकन आंतरिक कान के लिए विच्छेदन और हेरफेर तकनीकों का वर्णन करते हैं। तकनीक आनुवंशिक और छोटे अणु निषेध विधियों को दिखाती है, जो आंतरिक कान के विकास के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है। इस पेपर में, हम सीआरआईपीआर-सीएएस 9 विलोपन का उपयोग करके बेसिलर पैपिला को आनुवंशिक रूप से परेशान करने के लिए ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीकों में चर्चा करते हैं, इसके बाद बेसिलर पैपिला का विच्छेदन करते हैं। हम एपिथेलियम और बाल कोशिकाओं के विकास का निरीक्षण करने के लिए बीपी अंग संस्कृति और संस्कृति मैट्रिक्स के इष्टतम उपयोग का भी प्रदर्शन करते हैं।
Introduction
सभी कशेरुकियों के आंतरिक कान एक साधारण उपकला से प्राप्त होते हैं जिन्हें ओटिक प्लाकोड 1,2 के रूप में जाना जाता है। यह सुनवाई और संतुलन धारणा से जुड़े मेकेनोसेंसरी जानकारी को ट्रांसड्यूस करने के लिए आवश्यक सभी संरचनात्मक तत्वों और सेल प्रकारों को जन्म देगा। बाल कोशिकाएं (एचसी), आंतरिक कान का सिलिएटेड सेंसर, सहायक कोशिकाओं (एससी) से घिरे होते हैं। एचसी आठवें कपाल तंत्रिका के न्यूरॉन्स के माध्यम से श्रवण हिंडब्रेन को जानकारी रिले करते हैं। ये ओटिक प्लाकोड3 से भी उत्पन्न होते हैं। ध्वनि का प्राथमिक पारगमन श्रवण एचसी की एपिकल सतह पर, यांत्रिक रूप से संवेदनशील बाल बंडल 4 के माध्यम से प्राप्त कियाजाता है। यह स्टीरियोसिलिया नामक संशोधित एक्टिन-आधारित प्रोट्रूशियंस के माध्यम से मध्यस्थ होता है, जिसे एक वर्गीकृत, सीढ़ी पैटर्न 5 में व्यवस्थित किया जाताहै। इसके अलावा, एक संशोधित प्राथमिक सिलियम, जिसे किनोसिलियम कहा जाता है, बाल बंडल गठन को व्यवस्थित करता है और स्टीरियोसिलिया 6,7,8 की सबसे ऊंची पंक्ति से सटा हुआ है। स्टीरियोसिलिया की वास्तुकला ध्वनिक ऊर्जा से प्राप्त यांत्रिक उत्तेजनाओं को विद्युततंत्रिका संकेतों में परिवर्तित करने में इस भूमिका के लिए महत्वपूर्ण है। उम्र बढ़ने, संक्रमण, ओटोएकोस्टिक आघात, या ओटोटॉक्सिक सदमे के माध्यम से श्रवण एचसी को नुकसान आंशिक या पूर्ण सुनवाई हानि का परिणाम हो सकता है, जो स्तनधारियोंमें अपरिवर्तनीय है।
सेलुलर प्रतिस्थापन उपचार प्रस्तावित किए गए हैं जो इस तरह के नुकसान की मरम्मत कर सकतेहैं 11,12. इस शोध का दृष्टिकोण स्तनधारी बाल कोशिका के सामान्य विकास को समझना और यह पूछना है कि क्या विकास कार्यक्रमों को पूर्वज जैसी कोशिकाओं में फिर से शुरू किया जा सकता है जो आंतरिक कान13 के भीतर मौजूद हो सकते हैं। एक दूसरा दृष्टिकोण स्तनधारियों के बाहर देखने के लिए रहा है, गैर-स्तनधारी कशेरुकियों के लिए जिसमें श्रवण बाल कोशिकाओं का मजबूत उत्थान होता है, जैसे कि पक्षी14,15। पक्षियों में, बाल कोशिका पुनर्जनन मुख्य रूप से एक सहायक कोशिका के पूर्वज जैसी स्थिति में डी-भेदभाव के माध्यम से होता है, इसके बाद बाल कोशिका उत्पन्न करने और सेल16 का समर्थन करने के लिए असममित माइटोटिक विभाजन होता है। इसके अलावा, बाल कोशिका उत्पन्न करने के लिए एक सहायक कोशिका का प्रत्यक्षविभेदन भी देखा गया है।
जबकि एवियन श्रवण विकास के तंत्र स्तनधारियों के साथ महत्वपूर्ण समानताएं दिखाते हैं, मतभेद हैं18. चूजा बीपी में एचसी और एससी भेदभाव भ्रूण के दिन (ई) 7 से स्पष्ट है, जो समय के साथ अधिक विशिष्ट हो जाता है। ई 12 द्वारा, एक अच्छी तरह से पैटर्न और अच्छी तरह से ध्रुवीकृत बेसिलर पैपिला (बीपी) की कल्पना की जा सकती है, और ई 17 द्वारा अच्छी तरह से विकसित बाल कोशिकाओंको 19 देखा जा सकता है। ये समय बिंदु भेदभाव, पैटर्निंग और ध्रुवीयता के तंत्र के साथ-साथ बाल कोशिका परिपक्वता में खिड़कियां प्रदान करते हैं। यह समझना कि क्या ऐसे तंत्र संरक्षित या भिन्न हैं, महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे मेकेनोसेंसरी बाल कोशिकाओं की उत्पत्ति के गहरे होमोलॉजी में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।
यहां, हम आंतरिक कान के अंग के विकास के दौरान प्रसार, भाग्य विनिर्देश, भेदभाव, पैटर्निंग और रखरखाव जैसी सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रारंभिक और देर से भ्रूण चरणों में की गई तकनीकों की एक सरणी का प्रदर्शन करते हैं। यह एक्सप्लेंट कल्चर20,21,22 में आंतरिक कान के विकास को समझने पर अन्य प्रोटोकॉल का पूरक है। हम पहले ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके ई 3.5 ओटोसिस्ट के भीतर बीपी अग्रदूतों में बहिर्जात डीएनए या आरएनए की शुरूआत पर चर्चा करते हैं। यद्यपि आनुवंशिक जोड़तोड़ मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, इस प्रकार उत्पन्न फेनोटाइप प्लियोट्रोपिक हो सकते हैं और परिणामस्वरूप भ्रमित हो सकते हैं। यह बाद के आंतरिक कान के विकास के दौरान विशेष रूप से सच है, जहां साइटोस्केलेटल रीमॉडेलिंग जैसी मौलिक प्रक्रियाएं कोशिका विभाजन, ऊतक मोर्फोजेनेसिस और सेलुलर विशेषज्ञता में कई भूमिका निभाती हैं। हम सुसंस्कृत खोजों में औषधीय निषेध के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो खुराक और उपचार के समय और अवधि को नियंत्रित करने में फायदे प्रदान करते हैं, विकास तंत्र के सटीक स्थानिक हेरफेर की पेशकश करते हैं।
छोटे अवरोधकों की उपचार अवधि के आधार पर विभिन्न अंग संस्कृति विधियों का उपयोग किया जा सकता है। यहां हम अंग संस्कृति के दो तरीकों का प्रदर्शन करते हैं जो उपकला मोर्फोजेनेसिस और सेलुलर विशेषज्ञता में अंतर्दृष्टि की अनुमति देते हैं। कोक्लियर डक्ट को कल्चर करने के लिए मैट्रिक्स के रूप में कोलेजन का उपयोग करके 3 डी कल्चर के लिए एक विधि विकासशील बीपी के मजबूत संवर्धन और लाइव विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाती है। स्टीरियोसिलिया के गठन को समझने के लिए, हम एक झिल्ली संस्कृति विधि प्रस्तुत करते हैं जैसे कि उपकला ऊतक को एक कठोर मैट्रिक्स पर सुसंस्कृत किया जाता है जो एक्टिन प्रोट्रूशियंस को स्वतंत्र रूप से बढ़ने में सक्षम बनाता है। दोनों विधियां डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग जैसे लाइव-सेल इमेजिंग, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम), सेल रिकॉर्डिंग आदि की अनुमति देती हैं। ये तकनीकें एवियन श्रवण उपकला के विकास, परिपक्वता और उत्थान को समझने और हेरफेर करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में चूजे के प्रभावी उपयोग के लिए एक रोडमैप प्रदान करती हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
चूजा मॉडल जीवों के लिए एक लागत प्रभावी और सुविधाजनक अतिरिक्त है जिसका उपयोग एक प्रयोगशाला आंतरिक कान पर शोध करने के लिए कर सकती है। यहां वर्णित विधियों का उपयोग नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में किया…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एनसीबीएस, टीआईएफआर, इंफोसिस-टीआईएफआर लीडिंग एज रिसर्च ग्रांट, डीएसटी-एसईआरबी और रॉयल नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर द डेफ से समर्थन को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं। हम केंद्रीय कुक्कुट विकास संगठन और प्रशिक्षण संस्थान, हेसरघट्टा, बेंगलुरु को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम सीआईएफएफ और ईएम सुविधा और एनसीबीएस में प्रयोगशाला समर्थन के आभारी हैं। हम योशिको ताकाहाशी और कोइची कवाकामी को टोल 2-ईजीएफपी और टी 2 टीपी निर्माण के लिए धन्यवाद देते हैं, और गाइ रिचर्डसन एचसीए और जी 1 9 पीसीडीएच 15 एंटीबॉडी के लिए। हम प्रोटोकॉल पर उनके निरंतर समर्थन और मूल्यवान प्रतिक्रिया के लिए ईयरलैब सदस्यों के आभारी हैं।
Materials
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
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