Évaluation des dommages thermiques causés par la craniotomie robotisée pour la chirurgie de la fenêtre crânienne chez la souris

Summary

Les fenêtres crâniennes sont devenues une technique chirurgicale omniprésente pour permettre l’imagerie intravitale chez les souris transgéniques. Ce protocole décrit l’utilisation d’un robot chirurgical qui effectue un forage osseux semi-automatisé des fenêtres crâniennes et peut aider à réduire la variabilité d’un chirurgien à l’autre et à atténuer partiellement les dommages thermiques de la barrière hémato-encéphalique.

Abstract

La chirurgie de la fenêtre crânienne permet l’imagerie du tissu cérébral chez des souris vivantes avec l’utilisation de multiphotons ou d’autres techniques d’imagerie intravitale. Cependant, lors de la réalisation d’une craniotomie à la main, il y a souvent des dommages thermiques au tissu cérébral, ce qui est intrinsèquement variable d’une chirurgie à l’autre et peut dépendre de la technique individuelle du chirurgien. La mise en œuvre d’un robot chirurgical peut normaliser la chirurgie et entraîner une diminution des dommages thermiques associés à la chirurgie. Dans cette étude, trois méthodes de forage robotisé ont été testées pour évaluer les dommages thermiques: horizontale, point par point et pulsée point par point. Le forage horizontal utilise un schéma de forage continu, tandis que le forage point par point perce plusieurs trous englobant la fenêtre crânienne. Le point par point pulsé ajoute un schéma de forage « 2 s sur, 2 s off » pour permettre le refroidissement entre les forages. L’imagerie fluorescente du colorant Evans Blue (EB) injecté par voie intraveineuse mesure les dommages aux tissus cérébraux, tandis qu’un thermocouple placé sous le site de forage mesure les dommages thermiques. Les résultats des thermocouples indiquent une diminution significative du changement de température dans le groupe pulsé point par point (6,90 °C ± 1,35 °C) par rapport aux groupes horizontal (16,66 °C ± 2,08 °C) et point par point (18,69 °C ± 1,75 °C). De même, le groupe pulsé point par point a également montré significativement moins de présence d’EB après le perçage de fenêtres crâniennes par rapport à la méthode horizontale, indiquant moins de dommages aux vaisseaux sanguins dans le cerveau. Ainsi, une méthode de forage point par point pulsé semble être le schéma optimal pour réduire les dommages thermiques. Une perceuse robotisée est un outil utile pour aider à minimiser la formation, la variabilité et à réduire les dommages thermiques. Avec l’utilisation croissante de l’imagerie multiphotonique dans les laboratoires de recherche, il est important d’améliorer la rigueur et la reproductibilité des résultats. Les méthodes abordées ici aideront à informer les autres sur la façon de mieux utiliser ces robots chirurgicaux pour faire progresser le domaine.

Introduction

Les fenêtres crâniennes sont devenues omniprésentes dans les domaines des neurosciences, de l’ingénierie neuronale et de la biologie pour permettre la visualisation directe et l’imagerie du cortex chez les animaux vivants 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . La puissante combinaison de souris transgéniques et d’imagerie multiphotonique a fourni des informations extrêmement précieuses sur l’activité des circuits et d’autres connaissances biologiques dans le cerveau in vivo 12,13,14,15,16,17,18. Les microscopes miniatures montés sur le crâne ont encore étendu ces capacités pour permettre des enregistrements chez des animaux éveillés et en mouvement libre¹⁹. Le processus de création d’une fenêtre crânienne nécessite un forage électrique pour amincir ou enlever complètement l’os crânien afin de produire des craniotomies suffisamment grandes pour fixer un morceau de verre transparent sur le cortex²⁰. Le polydiméthylsiloxane (PDMS) et d’autres polymères ont également été testés comme matériaux de fenêtre crânienne ^9,21. En fin de compte, la fenêtre crânienne idéale est celle qui n’altère pas ou n’interfère pas avec l’activité endogène normale en dessous. Cependant, il est communément admis que le perçage de fenêtres crâniennes aggrave les tissus sous-jacents, entraînant des dommages au cerveau, une perturbation de l’environnement et des méninges affectant au point d’obstruer la profondeur d’imagerie multiphotonique²². La neuroinflammation qui en résulte a un large éventail d’effets allant de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) à l’activation et au recrutement des cellules gliales autour du site implantaire²³. Par conséquent, la caractérisation de méthodes de perçage de fenêtres crâniennes plus sûres et plus reproductibles est cruciale pour une qualité d’imagerie constante et la réduction des facteurs de confusion.

Bien que l’on prenne soin de minimiser les traumatismes au tissu sous-jacent, le fait de percer l’os peut causer des perturbations thermiques et mécaniques au cerveau^24,25. Un traumatisme mécanique résultant d’une pénétration accidentelle de perceuse dans la dure-mère peut en outre induire divers degrés de lésions corticales²⁴. Dans une étude de Shoffstall et coll.25, la chaleur du forage osseux a entraîné une augmentation de la perméabilité de la BHE, comme l’indique la présence de colorant bleu Evans (EB) dans le parenchyme cérébral ²⁵. Le colorant EB, injecté par voie intraveineuse, se lie à l’albumine circulante dans la circulation sanguine et ne traverse donc normalement pas une BHE saine à des concentrations appréciables. En conséquence, le colorant EB est couramment utilisé comme marqueur sensible de la perméabilité BBB^26,27. Bien que leur étude n’ait pas mesuré directement l’impact de la perméabilité de la BHE sur les séquelles biologiques ultérieures à l’étude, des études antérieures ont corrélé la perméabilité de la BHE à une réponse neuroinflammatoire accrue aux microélectrodes implantées de façon chronique et à des altérations de la fonction motrice²⁸.

Selon les objectifs de l’étude, l’ampleur des dommages thermiques et mécaniques peut contribuer à une source d’erreur expérimentale, affectant négativement la rigueur et la reproductibilité de l’étude. Il existe des dizaines de méthodes citées pour produire des fenêtres crâniennes, chacune utilisant un équipement de forage, des vitesses, des techniques et des utilisateurs^différents 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et coll.25 ont signalé que la variation observée dans les résultats de chauffage était attribuée à la variabilité de la force appliquée, de la vitesse d’avance et de l’angle d’application de la foreuse, entre autres aspects qui ne peuvent être contrôlés lors du forage manuel ²⁵. On croit que les systèmes de forage automatisés et d’autres équipements stéréotaxiques peuvent améliorer la reproductibilité et la cohérence des résultats, mais les études de méthodes publiées n’ont pas rigoureusement évalué la température ou la perméabilité BBB comme l’un des résultats. Par conséquent, il est nécessaire de disposer de méthodes plus reproductibles et appliquées de manière cohérente pour produire des fenêtres crâniennes, ainsi que de méthodes rigoureusement appliquées pour évaluer l’impact du forage de fenêtres crâniennes sur le tissu neural sous-jacent.

L’objectif de cette étude est de déterminer et de développer des méthodes de forage cohérentes et sécuritaires pour les fenêtres crâniennes. La taille de la craniotomie pour l’installation de fenêtres crâniennes est significativement plus grande que les craniotomies standard pour les microélectrodes implantées dans le cerveau. De telles craniotomies ne peuvent pas être complétées avec un seul trou de bavure lors de l’utilisation d’un équipement standard, introduisant ainsi une plus grande variabilité technique inter-chirurgienne lorsqu’elles sont effectuées à la main²⁰. Des robots de forage chirurgical ont été introduits sur le terrain, mais n’ont pas été largement adoptés ^1,6,29. L’automatisation du forage offre un contrôle sur les variables contribuant à la variation observée d’un essai à l’autre, ce qui suggère que l’utilisation de l’équipement peut réduire les effets inter- et intra-chirurgiens. Ceci est particulièrement intéressant étant donné la difficulté supplémentaire de la craniotomie plus grande nécessaire pour la mise en place de la fenêtre crânienne. Bien que l’on puisse supposer que le contrôle fourni par l’automatisation du forage présente des avantages évidents, il y a eu peu d’évaluation de la mise en œuvre de ces équipements. Bien que des lésions visibles n’aient pas été observées⁵, le test de sensibilité plus élevé utilisant EB est souhaité.

Ici, la perméabilité BBB est mesurée à l’aide d’un robot de forage chirurgical disponible dans le commerce avec le logiciel correspondant, qui permet la programmation de coordonnées stéréotaxiques, la planification / cartographie de la craniotomie et une sélection de styles de forage (« point par point » vs « horizontal »), se référant à la trajectoire acheminée du foret. Initialement, huit points « de départ » sont forés (Figure 1A), décrivant la fenêtre crânienne. De là, l’espace entre les graines est découpé à l’aide de la méthode de forage « point par point » ou « horizontale ». « Point par point » effectue des coupes de trous pilotes verticaux (similaires à une perceuse CNC), tandis que « horizontal » effectue des coupes horizontales le long de la circonférence de la fenêtre crânienne qui délimite le trou (similaire à une routeur CNC). Le résultat pour les deux méthodes est un morceau de crâne qui peut être enlevé pour révéler la fenêtre crânienne. Pour isoler les dommages causés par le forage, la fenêtre crânienne n’est pas physiquement retirée, afin d’éviter tout dommage supplémentaire. Une combinaison de colorant EB couplée à une imagerie fluorescente est utilisée pour mesurer la perméabilité de la BHE après avoir effectué des craniotomies chez la souris, et un thermocouple inséré est utilisé pour mesurer directement la température de la surface du cerveau pendant le forage (Figure 1B, C). Des observations antérieures ont indiqué que le forage pulsé marche/arrêt avec des intervalles de 2 s était suffisant pour atténuer le chauffage du forage²⁵, et est donc incorporé dans l’approche expérimentale pour le robot chirurgical.

L’objectif du travail présenté est de démontrer les méthodes d’évaluation des dommages thermiques causés par le forage de craniotomie. Bien que les méthodes soient présentées dans le contexte du forage automatisé, ces méthodes peuvent également être appliquées aux schémas de forage manuel. Ces méthodes peuvent être utilisées pour valider l’utilisation d’équipements et/ou de schémas de forage avant de les adopter comme procédure standard.

Figure 1 : Schéma du pipeline expérimental. Schéma montrant le procédé que les animaux ont subi pour la quantification EB de la procédure de fenêtre post-crânienne. (A) Configuration schématique de la souris avec le cadre stéréotaxique et la perceuse robot chirurgicale. Un exemple de fenêtre crânienne est montré au-dessus du cortex moteur avec des points de départ (vert) et des points de bord (bleu). (B) La configuration de perfusion comprend l’injection de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans tout l’animal pour éliminer tout sang, suivie d’une extraction du cerveau. (C) Le cerveau est ensuite placé dans la chambre du système d’imagerie fluorescente EB pour effectuer l’imagerie fluorescente sur le colorant bleu Evans. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Toutes les procédures et pratiques de soins aux animaux ont été examinées, approuvées et exécutées conformément au comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center. 1. Configuration du matériel de robot chirurgical Avant la chirurgie, suivez le manuel et le guide du robot chirurgical (voir le tableau des matériaux) pour configurer le matériel et les logici…

Representative Results

Évaluation thermiqueLe potentiel de dommages thermiques a été évalué en mesurant le changement de température par rapport à la ligne de base dû au forage à l’aide de méthodes horizontales (figure 2A), point par point (figure 2B) et pulsées point par point (figure 2C). La figure 2D montre la configuration expérimentale pour obtenir des données thermiques. Une taille d?…

Discussion

L’utilisation du colorant EB et de l’imagerie est simple, rapide et utile pour évaluer les dommages vasculaires dans le cerveau pour de nouvelles méthodes et techniques. Qu’il s’agisse d’utiliser un robot chirurgical ou de confirmer les méthodes actuellement utilisées en laboratoire, il est important de valider les méthodes chirurgicales pour isoler les effets des traitements expérimentaux par rapport à l’impact chirurgical et améliorer le bien-être animal. Une configuration de thermocouple est égal…

Materials

1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent	VWR	MRGF-6235	For Evans Blue dilution
Aura Software Type: Tool	Spectral Instruments Imaging		Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems
Buprenorphine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool	Stoelting	58640-1
Carprofen Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Cefazolin Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Evans Blue Dye Type: Reagent	Millipore Sigma	E2129	Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline
Isoflurane Type: Drug	Sourced from Animal Facility
IVIS Lumina II Type: Tool	Perkin Elmer	CLS136334	IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market
Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool	Jenco	765JF	For Thermocouple setup
Ketamine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
LivingImage Type: Tool	Perkin Elmer		Software for IVIS Lumina III
Marcaine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Neurostar Software Type: Tool	Stoelting		Comes with surgical robot purchase
Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool	Kent Scientific	PS-03	Used to monitor vitals
PrismPlus mice Type: Animal	Jackson Labortory	031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old	Animals used for the study
Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool	Stoelting	58640	Main robotic drill with stereotaxic frame
Thermocouple Type: Tool	TC Direct	206-557	For Thermocouple setup
USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool	National Instruments	USB-6008	For Thermocouple setup
Xylazine Type: Drug	Sourced from Animal Facility