Evaluación del daño térmico de la craneotomía perforada por robot para la cirugía de ventana craneal en ratones

Summary

Las ventanas craneales se han convertido en una técnica quirúrgica implementada ubicuamente para permitir imágenes intravitales en ratones transgénicos. Este protocolo describe el uso de un robot quirúrgico que realiza perforaciones óseas semiautomáticas de ventanas craneales y puede ayudar a reducir la variabilidad de cirujano a cirujano y mitigar parcialmente el daño de la barrera térmica hematoencefálica.

Abstract

La cirugía de ventana craneal permite la obtención de imágenes del tejido cerebral en ratones vivos con el uso de multifotones u otras técnicas de imagen intravital. Sin embargo, cuando se realiza cualquier craneotomía a mano, a menudo hay daño térmico al tejido cerebral, que es inherentemente variable de cirugía a cirugía y puede depender de la técnica individual del cirujano. La implementación de un robot quirúrgico puede estandarizar la cirugía y conducir a una disminución del daño térmico asociado con la cirugía. En este estudio, se probaron tres métodos de perforación robótica para evaluar el daño térmico: horizontal, punto por punto y pulsado punto por punto. La perforación horizontal utiliza un esquema de perforación continua, mientras que punto por punto perfora varios agujeros que abarcan la ventana craneal. El pulsado punto por punto agrega un esquema de perforación “2 s encendido, 2 s apagado” para permitir el enfriamiento entre perforaciones. Las imágenes fluorescentes del tinte Evans Blue (EB) inyectado por vía intravenosa miden el daño al tejido cerebral, mientras que un termopar colocado debajo del sitio de perforación mide el daño térmico. Los resultados del termopar indican una disminución significativa en el cambio de temperatura en el grupo pulsado punto por punto (6.90 °C ± 1.35 °C) en comparación con los grupos horizontal (16.66 °C ± 2.08 °C) y punto por punto (18.69 °C ± 1.75 °C). Del mismo modo, el grupo pulsado punto por punto también mostró significativamente menos presencia de EB después de la perforación de la ventana craneal en comparación con el método horizontal, lo que indica menos daño a los vasos sanguíneos en el cerebro. Por lo tanto, un método de perforación pulsado punto por punto parece ser el esquema óptimo para reducir el daño térmico. Un taladro robótico es una herramienta útil para ayudar a minimizar el entrenamiento, la variabilidad y reducir el daño térmico. Con el uso cada vez mayor de imágenes multifotónicas en los laboratorios de investigación, es importante mejorar el rigor y la reproducibilidad de los resultados. Los métodos abordados aquí ayudarán a informar a otros sobre cómo utilizar mejor estos robots quirúrgicos para avanzar aún más en el campo.

Introduction

Las ventanas craneales se han utilizado ubicuamente en los campos de la neurociencia, la ingeniería neuronal y la biología para permitir la visualización directa y la obtención de imágenes de la corteza en animales vivos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . La poderosa combinación de ratones transgénicos e imágenes multifotónicas ha proporcionado información extremadamente valiosa sobre la actividad del circuito y otras ideas biológicas en el cerebro in vivo 12,13,14,15,16,17,18. Los microscopios en miniatura montados en el cráneo han ampliado aún más estas capacidades para permitir grabaciones en animales despiertos que se mueven libremente¹⁹. El proceso de creación de una ventana craneal requiere perforación eléctrica para adelgazar o eliminar completamente el hueso craneal para producir craneotomías lo suficientemente grandes como para asegurar una pieza transparente de vidrio sobre la corteza²⁰. El polidimetilsiloxano (PDMS) y otros polímeros también han sido probados como materiales de ventana craneal ^9,21. En última instancia, la ventana craneal ideal es aquella que no altera ni interfiere con la actividad endógena normal debajo. Sin embargo, es comúnmente aceptado que la perforación de la ventana craneal agrava el tejido subyacente, lo que lleva a daños en el cerebro, alteración del medio ambiente y meninges hasta el punto de ocluir la profundidad de la imagen multifotónica²². La neuroinflamación resultante tiene una amplia gama de efectos que van desde la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE) hasta la activación y el reclutamiento de células gliales alrededor del sitio del implante²³. Por lo tanto, la caracterización de métodos de perforación de ventanas craneales más seguros y reproducibles es crucial para una calidad de imagen consistente y reducir los factores de confusión.

Mientras que se tiene cuidado de minimizar el trauma en el tejido subyacente, el acto de perforar el hueso tiene el potencial de causar perturbaciones térmicas y mecánicas al cerebro^24,25. El trauma mecánico por penetración accidental del taladro en la duramadre puede inducir diversos grados de lesión cortical²⁴. En un estudio de Shoffstall et al.25, el calor de la perforación ósea resultó en un aumento de la permeabilidad BBB, como lo indica la presencia de colorante Evans Blue (EB) en el parénquima cerebral ²⁵. El colorante EB, inyectado por vía intravenosa, se une a la albúmina circulante en el torrente sanguíneo y, por lo tanto, normalmente no cruza una barrera hematoencefálica saludable en concentraciones apreciables. Como resultado, el colorante EB se utiliza comúnmente como un marcador sensible de la permeabilidad BBB^26,27. Si bien su estudio no midió directamente el impacto de la permeabilidad de la BHE en las secuelas biológicas posteriores en estudio, estudios previos han correlacionado la permeabilidad de la BHE con una mayor respuesta neuroinflamatoria a microelectrodos implantados crónicamente y alteraciones en la función motora²⁸.

Dependiendo de los objetivos del estudio, la magnitud del daño térmico y mecánico puede contribuir a una fuente de error experimental, afectando negativamente el rigor y la reproducibilidad del estudio. Hay docenas de métodos citados para producir ventanas craneales, cada uno utilizando diferentes equipos de perforación, velocidades, técnicas y usuarios 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 informaron que la variación observada en los resultados de calentamiento se atribuyó a la variabilidad en la fuerza aplicada, la velocidad de avance y el ángulo de aplicación del taladro, entre otros aspectos que no pueden controlarse cuando se perfora a mano ²⁵. Existe la creencia de que los sistemas de perforación automatizados y otros equipos estereotáxicos pueden mejorar la reproducibilidad y la consistencia de los resultados, pero los estudios de métodos publicados no han evaluado rigurosamente la temperatura o la permeabilidad de la barrera hematoencefálica como uno de los resultados. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos más reproducibles y consistentemente aplicados para producir ventanas craneales, así como métodos rigurosamente aplicados para evaluar el impacto de la perforación de ventanas craneales en el tejido neural subyacente.

El objetivo de este estudio es determinar y desarrollar métodos de perforación consistentes y seguros para ventanas craneales. El tamaño de la craneotomía para la instalación de la ventana craneal es significativamente mayor que las craneotomías estándar para microelectrodos implantados en el cerebro. Tales craneotomías no pueden completarse con un solo orificio de rebaba cuando se utiliza equipo estándar, introduciendo así más variabilidad de la técnica intercirujano cuando se realiza a mano²⁰. Los robots de perforación quirúrgica se han introducido en el campo, pero no han sido ampliamente adoptados ^1,6,29. La automatización de la perforación ofrece control sobre las variables que contribuyen a la variación observada de ensayo a ensayo, lo que sugiere que el uso del equipo puede reducir los efectos inter e intracirujanos. Esto es de particular interés dada la dificultad añadida de la craneotomía más grande necesaria para la colocación de la ventana craneal. Si bien se podría suponer que hay beneficios claros para el control proporcionado por la automatización de la perforación, ha habido poca evaluación de la implementación de estos equipos. Aunque no se han observado lesiones visibles⁵, se desea la prueba de mayor sensibilidad con EB.

Aquí, la permeabilidad BBB se mide utilizando un robot de perforación quirúrgica disponible comercialmente con el software correspondiente, que permite la programación de coordenadas estereotáxicas, planificación / mapeo de craneotomía y una selección de estilos de perforación (“punto por punto” vs “horizontal”), refiriéndose a la trayectoria enrutada de la broca. Inicialmente, se perforan ocho puntos de “semilla” (Figura 1A), delineando la ventana craneal. A partir de aquí, el espacio entre las semillas se corta utilizando el método de perforación “punto por punto” u “horizontal”. “Punto por punto” realiza cortes verticales de orificios piloto (similares a una prensa de perforación CNC), mientras que “horizontal” realiza cortes horizontales a lo largo de la circunferencia de la ventana craneal que delinea el orificio (similar a un enrutador CNC). El resultado para ambos métodos es un pedazo de cráneo que se puede quitar para revelar la ventana craneal. Para aislar el daño de la perforación, la ventana craneal no se retira físicamente, a fin de evitar cualquier daño adicional. Se utiliza una combinación de colorante EB junto con imágenes fluorescentes para medir la permeabilidad BBB después de realizar craneotomías en ratones, y un termopar insertado se utiliza para medir directamente la temperatura de la superficie cerebral durante la perforación (Figura 1B, C). Observaciones anteriores indicaron que la perforación pulsada encendido / apagado con intervalos de 2 s fue suficiente para mitigar el calentamiento de la perforación²⁵, y por lo tanto se incorpora al enfoque experimental para el robot quirúrgico.

La intención del trabajo presentado es demostrar métodos para evaluar el daño térmico de la perforación de craneotomía. Si bien los métodos se presentan en el contexto de la perforación automatizada, dichos métodos también se pueden aplicar a los esquemas de perforación manual. Estos métodos se pueden utilizar para validar el uso de equipos y / o esquemas de perforación antes de adoptarlos como procedimiento estándar.

Figura 1: Esquema experimental de tuberías. Esquema que demuestra el proceso al que se sometieron los animales para el procedimiento de cuantificación de EB después de la ventana craneal. (A) Configuración esquemática del ratón con el marco estereotáxico y el taladro quirúrgico del robot. Un ejemplo de ventana craneal se muestra sobre la corteza motora con puntos semilla (verde) y puntos de borde (azul). (B) La configuración de perfusión incluye inyectar 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) en todo el animal para eliminar cualquier sangre, seguida de la extracción del cerebro. (C) Luego, el cerebro se coloca en la cámara del sistema de imágenes fluorescentes EB para realizar imágenes fluorescentes en el tinte Evans Blue. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Todos los procedimientos y prácticas de cuidado de animales fueron revisados, aprobados y realizados de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico del Departamento de Asuntos de Veteranos Louis Stokes Cleveland. 1. Configuración del hardware del robot quirúrgico Antes de la cirugía, siga el manual y la guía del robot quirúrgico (consulte la Tabla de materiales) para configurar el hardware y el software….

Representative Results

Evaluación térmicaEl potencial de daño térmico se evaluó midiendo el cambio en la temperatura desde la línea de base debido a la perforación utilizando métodos horizontales (Figura 2A), punto por punto (Figura 2B) y pulsados punto por punto (Figura 2C). La figura 2D muestra la configuración experimental para obtener datos térmicos. Se utilizó un tamaño de muestra de N = …

Discussion

El uso del tinte EB y las imágenes es sencillo, rápido y útil para evaluar el daño vascular en el cerebro para nuevos métodos y técnicas. Ya sea utilizando un robot quirúrgico o confirmando los métodos que se realizan actualmente en el laboratorio, es importante validar los métodos quirúrgicos para aislar los efectos de los tratamientos experimentales frente al impacto quirúrgico y mejorar el bienestar animal. Una configuración de termopar también es útil para evaluar los métodos de perforación para garan…

Materials

1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent	VWR	MRGF-6235	For Evans Blue dilution
Aura Software Type: Tool	Spectral Instruments Imaging		Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems
Buprenorphine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool	Stoelting	58640-1
Carprofen Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Cefazolin Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Evans Blue Dye Type: Reagent	Millipore Sigma	E2129	Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline
Isoflurane Type: Drug	Sourced from Animal Facility
IVIS Lumina II Type: Tool	Perkin Elmer	CLS136334	IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market
Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool	Jenco	765JF	For Thermocouple setup
Ketamine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
LivingImage Type: Tool	Perkin Elmer		Software for IVIS Lumina III
Marcaine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Neurostar Software Type: Tool	Stoelting		Comes with surgical robot purchase
Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool	Kent Scientific	PS-03	Used to monitor vitals
PrismPlus mice Type: Animal	Jackson Labortory	031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old	Animals used for the study
Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool	Stoelting	58640	Main robotic drill with stereotaxic frame
Thermocouple Type: Tool	TC Direct	206-557	For Thermocouple setup
USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool	National Instruments	USB-6008	For Thermocouple setup
Xylazine Type: Drug	Sourced from Animal Facility