Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

פלטפורמה אנליטית רב-מודאלית על שבב דימות תהודה פלסמון מרובה פני שטח לניתוח תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאית

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64210
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 4, 1
1Université de Franche-Comté, CNRS UMR-6174, FEMTO-ST Institute, 2Lille Neuroscience & Cognition research centre, 3Institut Galien Paris-Saclay, CNRS UMR-8612 , Université Paris-Saclay, 4Interdisciplinary Lab Carnot Bourgogne LICB, CNRS UMR-6303, Université de Bourgogne Franche-Comté

Summary

מאמר זה מציע דור חדש של פלטפורמות אנליטיות רב-פרמטריות עם תפוקה מוגברת לאפיון תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאיות. השיטה מבוססת על שילוב של שיטות חישה ביולוגית מרובות עם אנליזות מטרולוגיות ומורפומכניות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי, יחד עם ספקטרוסקופיית ראמאן, כדי להכשיר מטרות שלפוחיתיות הכלואות על שבב ביולוגי של מיקרו-מערך.

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן שלפוחיות זעירות שמקורן בקרום, המיוצרות על ידי כל התאים בקוטר של בין 50 לכמה מאות ננומטרים ומשמשות כאמצעי לתקשורת בין-תאית. הם מסתמנים ככלי אבחון וטיפול מבטיחים למגוון מחלות. ישנם שני תהליכי ביוגנזה עיקריים המשמשים תאים לייצור כלי רכב חשמליים עם הבדלים בגודל, בהרכב ובתוכן. בשל מורכבותם הגבוהה בגודלם, הרכבם ומוצא התא, אפיונם דורש שילוב של טכניקות אנליטיות. פרויקט זה כולל פיתוח דור חדש של פלטפורמות אנליטיות מולטי-פרמטריות עם תפוקה מוגברת לאפיון תת-אוכלוסיות של כלי רכב חשמליים. כדי להשיג מטרה זו, העבודה מתחילה מהפלטפורמה הננו-ביואנליטית (NBA) שהוקמה על ידי הקבוצה, המאפשרת חקירה מקורית של כלי רכב חשמליים המבוססת על שילוב של שיטות ביו-חישה מרובות עם ניתוחים מטרולוגיים ומורפומכניים על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) של מטרות שלפוחיתיות הכלואות על שבב ביולוגי של מיקרו-מערך. המטרה הייתה להשלים את חקירת הרכב החשמלי באמצעות ניתוח פנוטיפי ומולקולרי על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן. פיתוחים אלה מאפשרים להציע פתרון אנליטי רב-מודאלי וקל לשימוש להבחנה בין תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים בנוזלים ביולוגיים בעלי פוטנציאל קליני

Introduction

העניין הגובר במחקר EV באבחון ובטיפולים 1,2,3,4,5, בשילוב עם האתגרים העומדים בפני תחום זה, הביאו לפיתוח ויישום של מגוון רחב של גישות וטכניקות לכימות או אפיון שלפוחיות אלה. השיטות הנפוצות ביותר לזיהוי EV הן אימונובלוטציה ספציפית לחלבון ופרוטאומיקה כדי לאשר את מקורם של כלי רכב חשמליים, מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) כדי לאשר את המבנה שלהם, וניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) כדי לכמת את מספרם ואת התפלגות גודלם בנפח דגימה.

עם זאת, אף אחת מהטכניקות הללו כשלעצמה אינה מספקת את כל המידע הדרוש כדי לאפיין תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים. ההטרוגניות המובנית של כלי רכב חשמליים בשל הגיוון בתכונות הביוכימיות והפיזיקליות שלהם מונעת ניתוחים גלובליים אמינים וניתנים לשחזור, במיוחד עבור כלי רכב חשמליים הכלולים בתערובת (מדגם גולמי). לכן, יש צורך בשיטות איתור ואפיון עבור כלי רכב חשמליים, הן באופן פרטני והן באופן כללי כדי להשלים שיטות אחרות שהן מהירות יותר אך לא סלקטיביות6.

הדמיה ברזולוציה גבוהה על ידי TEM (או cryoTEM) או AFM מאפשרת לקבוע את המורפולוגיה והמטרולוגיה של כלי רכב חשמליים ברזולוציה ננומטרית 7,8,9,10,11,12. עם זאת, המגבלה העיקרית של השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים עבור אובייקטים ביולוגיים, כגון EVs, היא הצורך בוואקום לביצוע המחקר הדורש קיבוע והתייבשות של הדגימה. הכנה כזו מקשה על התרגום מהמבנים שנצפו למורפולוגיה של EV בתמיסה. כדי למנוע התייבשות זו של הדגימה, הטכניקה של cryoTEM היא המתאימה ביותר לאפיון EV13. הוא נמצא בשימוש נרחב לקביעת מבנה העל של כלי רכב חשמליים. הסימון החיסוני של שלפוחיות על ידי ננו-חלקיקי זהב ביו-פונקציונליים מאפשר גם לזהות תת-אוכלוסיות ספציפיות של כלי רכב חשמליים ולהבדיל אותן מחלקיקים אחרים הנמצאים בדגימה ביולוגית מורכבת. עם זאת, בשל המספר הנמוך של כלי רכב חשמליים המנותחים במיקרוסקופ אלקטרוני, לעיתים קרובות קשה לבצע אפיון המייצג מדגם מורכב והטרוגני.

כדי לחשוף את ההטרוגניות בגודל זה, האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות (ISEV) מציעה לנתח מספר מספיק של תמונות שדה רחב, בליווי תמונות קטנות יותר, כדי לחשוף כלי רכב חשמליים בודדים ברזולוציה גבוהה14. AFM הוא חלופה לגישות אופטיות וטכניקות עקיפה אלקטרוניות לחקר כלי רכב חשמליים. טכניקה זו משתמשת בקצה חד המוחזק על ידי מקל גמיש הסורק את הדגימה שהונחה על תמיכה אחת, שורה אחר שורה, ומתאים את המרחק בין הקצה לבין האלמנטים הנוכחים באמצעות לולאת משוב. זה מאפשר לאפיין את הטופוגרפיה של המדגם ולאסוף מידע מורפומכני15,16,17,18. ניתן לסרוק את כלי הרכב החשמליים על ידי AFM לאחר שהופקדו על מצע שטוח אטומית או לאחר שנלכדו על מצע ספציפי המתפקד על ידי נוגדנים, פפטידים או אפטמרים כדי לאפיין את תת-האוכלוסיות השונות18,19. בשל יכולתו לכמת ובו זמנית את המבנה, הביומכניקה והתכולה הביומולקולרית הממברנית של כלי רכב חשמליים בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות ללא צורך בטיפול מקדים, תיוג או התייבשות, AFM משמש כיום יותר ויותר לאפיון כלי רכב חשמליים בצורה עדינה ורב-פרמטרית בתנאים פיזיולוגיים של טמפרטורה ומדיום.

מאמר זה מציע מתודולוגיה המשתמשת בביו-שבב זהב ליבה המסוגל להיות (ביו) פונקציונלי כימית בפורמט מרובה. מצע זה הוא אבן הפינה של פלטפורמה אנליטית רבת עוצמה המשלבת זיהוי ביולוגי של תת-קבוצות EV על ידי תהודה פלסמונית על פני השטח, וברגע שכלי הרכב החשמליים נספגים/מושתלים או נלכדים חיסון על השבב, AFM מאפשר אפיון מטרולוגי ומורפומכני של כלי הרכב החשמליים. יחד עם חתימת ראמאן של תת-קבוצות הרכב החשמלי שנלכדו על השבב, פלטפורמה אנליטית זו מאפשרת את ההסמכה של כלי הרכב החשמליים הנמצאים בדגימות ביולוגיות באופן ללא תוויות וללא כל צורך בצעדים פרה-אנליטיים. מאמר זה מראה כי השילוב של טכניקות רבות-עוצמה, בסיוע מתודולוגיה קפדנית ביותר בהכנת מצעים ורכישת נתונים, הופך את ניתוח הרכב החשמלי לעמוק, מוחלט וחזק.

העיקרון של הגישה המוצעת הוא להכין מצע זהב, לספוח/להשתיל או ללכוד את תת-הסוגים של EV, ולסרוק אותם על ידי AFM כדי להעריך את הגודל והמורפולוגיה של כל תת-קבוצה של EV. בנוסף, כלי הרכב החשמליים הנספחים מנותחים על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן. מצע זה יכול, אכן, להציג שלושה סוגים של ממשקים בעלי מורכבות הולכת וגדלה: עירום, פונקציונלי כימית, או מיקרו-מערכי ליגנד. לפני תיאור השלבים השונים של הפרוטוקול, הקוראים מופנים להצגה הסכמטית של גישת הפלטפורמה הננו-ביואנליטית (NBA) באיור 1, המשלבת דימות תהודה פלסמוני פני השטח (SPRi), AFM וספקטרוסקופיה.

Figure 1
איור 1: הפלטפורמה הננו-ביואנליטית. הגישה משלבת (A) הדמיית תהודה פלסמונית על פני השטח, (B) מיקרוסקופ כוח אטומי, וספקטרוסקופיית אינפרא אדום/ראמאן (ננו), כולם עוסקים על אותו מצע - שבב זהב מרובה. קיצורים: NBA = פלטפורמה ננו-ביואנליטית; SPRi = הדמיית תהודה פלסמונית פני השטח; AFM = מיקרוסקופ כוח אטומי; EV = שלפוחית חוץ-תאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ביו-שבב הזהב מהווה את לב הפלטפורמה מכיוון שכל טכניקות האפיון ללא תוויות מתבצעות על שבב זה. בהתאם לצרכים של אפיון הרכב החשמלי (תת-קבוצות גלובליות/כלל של כלי רכב חשמליים או תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים) והמגבלות/הדרישות של השיטות בהן נעשה שימוש, פותחו שלושה סוגים של משטחי ביו-שבב זהב: או "עירום", "C11/C16" המתפקד כימית, או ליגנד-ביו-פונקציונלי, המכונה משטח זהב "ליגנד".

השבב העירום, המכונה "עירום", מאפשר ספיחה פשוטה של כלי רכב חשמליים על זהב. ניתן לבחור את המאגר המשמש ולממש ספיחה זו באופן פסיבי (שלבי דגירה ולאחר מכן שטיפה) או לפקח עליו תחת זרימה (ב SPRi). יתר על כן, ספיחה פסיבית זו יכולה להתממש או על השבב כולו (כמו macroarray) או מקומי microarrays באמצעות ספוטר micropipette. "נוהל הזרימה" מאפשר לחוקרים לעקוב אחר הקינטיקה ורמת ספיחת הרכב החשמלי. גישה זו על מצע הזהב העירום מאומצת כאשר ממשק השכבה הכימית עלול להפריע לשיטה האנליטית (למשל, עבור ספקטרוסקופיית ראמאן).

השבב הביולוגי המתפקד כימית, הנקרא "C11/C16", משמש ליצירת "שטיח" צפוף וחזק של כלי רכב חשמליים הקשורים באופן קוולנטי על פני הזהב על ידי יצירת קשרי אמיד ראשוניים עם התיולטים כאשר המטרה היא לקבל מבט גלובלי על דגימת הרכב החשמלי. ואכן, במקרה זה, הזהב מתפקד על ידי תערובת תיולאט של mercapto-1-undecanol (11-MUOH: "C11") וחומצה mercapto-1-hexadecanoic (16-MHA: "C16"), וחלק קטן של thiolates מופעלים כימית כדי ליצור קישור קוולנטי עם המטרות. שוב, אסטרטגיה זו יכולה להתממש באופן פסיבי (שלבי דגירה ולאחר מכן שטיפה, או ב"מקרו-מערך" או במספר מיקרו-מערכים באמצעות ספוטר מיקרופיפטה) או תחת קצבי זרימה (ב-SPRi) כדי לעקוב אחר הקינטיקה ורמת השתלת הרכב החשמלי על משטח הזהב.

השבב הביולוגי של הליגנד, הנקרא "ליגנדים", מופעל כימית כדי להשתיל באופן קוולנטי ליגנדים שונים (למשל, נוגדנים, קולטנים) כדי ללכוד באופן סלקטיבי (עם זיקה) תת-קבוצות שונות של EV המתקיימות יחד בדגימה הביולוגית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מצע זהב

הערה: שלושה סוגים של משטחים מיוצרים על שבבי זהב: 1) משטח עירום, 2) מתפקד כימית, 3) ביו-פונקציונלי (ליגנדות שהושתלו על שכבת C11C16). מנקודה זו ואילך הם ייקראו "עירומים", "C11C16" ו"ליגנדים", בהתאמה.

  1. הכנת מצע זהב:
    הערה: עבור פרוטוקול זה, שבבי הזהב יוצרו בבית בחדר הנקי. השבבים הביתיים הורכבו ממגלשות זכוכית (SF11) עם ציפוי של כרום (2 ננומטר Cr) וזהב (48 ננומטר Au). אורך הביו-שבב היה 28 מ"מ, רוחבו 12.5 מ"מ, והעובי היה 0.5 מ"מ20.
    1. השתמש במגנטרון DC sputtering15 כדי לצפות את המגלשות על ידי שקיעת אדים פיזית (PVD).
  2. תפקוד כימי:
    1. פונקציונליזציה של השבבים העירומים על ידי דגירה שלהם למשך הלילה ב-90%/10% על ידי תערובת שומה של mercapto-1-undecanol (11-MUOH: C11) וחומצה mercapto-1-hexadecanoic (16-MHA: C16) ב-1 mM באתנול מוחלט, תחת תסיסה ובטמפרטורת החדר.
      הערה: שלב זה ייצור חד-שכבה יציבה בהרכבה עצמית (SAM), אשר שימושית בהשתלת הליגנדות.
    2. נקו את השבב הביולוגי (שטפו בעדינות) עם אתנול מוחלט ומים טהורים במיוחד, יבשו אותו תחת חנקן ואחסנו אותו בתנאי חדר נקי.
    3. הפעלת השבב הביולוגי המתפקד כימית:
      הערה: משלב זה ואילך, הניסויים חייבים להתבצע במעבדה אנליטית.
      1. נקו את השבב הביולוגי במים טהורים במיוחד על ידי שטיפתו בעדינות, ולאחר מכן יבשו את השבב תחת זרימת אוויר עדינה. כדי להפעיל את קבוצות הקרבוקסיליות C16, יש לדגור על השבב הביולוגי בתערובת של 200 mM ethyl (dimethylaminopropyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide (EDC) ו-50 mmol / L N-hydroxysuccinimide (Sulfo-NHS) למשך 30 דקות לפחות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לשטוף במים לפני ניסויי ההשתלה.
  3. השתלת הליגנדות על השבב הביולוגי הפונקציונלי:
    הערה: אימוביליזציה של ליגנדות (או EVs עבור ניסויים מסוימים) על השבב יכולה להיעשות באופן פסיבי מחוץ למכשיר SPRi (דגירה של טיפה על השבב המופעל) או זרימה דינמית תחת לתוך מכשיר SPRi. זה מהווה את שבבי הרכב החשמלי או הליגנד. איור 2 מציג את שבב הזהב הביולוגי, את תצפיתן המיקרופיפטה ואת השבב הביולוגי לאחר זיהוי עם 16 טיפות ליגנד של 300 nL כל אחת.
    1. עבור השתלת ליגנדים, השתמשו במולקולות כגון נוגדנים (למשל, אימונוגלובולינים-antiCD41 [ספציפיים לרכבים חשמליים שמקורם בטסיות דם טבעיות, הנקראות N-PEVs], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 ו-antiOVA [נוגדן בקרה נגד אובאלבומין]) ו-Annexin V. דללו אותן ב-200 מיקרוגרם/מ"ל בתמיסה חומצית (מ-pH 4.5 עד 6 בהתאם ל-pH האופטימלי לפעילות או תפקוד ליגנד).
      הערה: ה- pH האופטימלי להשתלת נוגדנים נקבע בעבר על ידי ניסויים טרום ריכוז שבוצעו במכשיר SPR לקביעת ה- pH האופטימלי להשתלת ליגנד (ראה איור 3). מכיוון שתנאי ההשתלה משתנים עם שיבוט הנוגדנים המשמשים, מומלץ לקבוע תנאים אלה לפני שממשיכים בניסויי SPRi.
    2. עבור הליך ההשתלה, הוסף 300 nL של EVs/פתרון ליגנד באמצעות הספוטר.
      הערה: פיסת נייר שקועה במים צריכה להישמר הן בבאר השמאלית והן בבאר הימנית כדי למנוע אידוי של טיפות. שלב זה חשוב כדי לשמור על הרכבים החשמליים/ליגנדים בתנאים האופטימליים שלהם ליציבות ופונקציונליות.
    3. לאחר האיתור, יש לשמור את השבב הביולוגי תחת אמבט קולי (תדר: 37 קילוהרץ, הספק: 30%) למשך 30 דקות דגירה. שטפו את השבב הביולוגי מלמעלה במים טהורים במיוחד, והניחו אותו בעדינות על מנסרה עם אותו מקדם שבירה (RI) כמו השבב הביולוגי. בעת התאמת השבב הביולוגי בחלק העליון של המנסרה, הוסף טיפה (~ 2.3 μL) של שמן עם RI זהה למנסרה כדי ליצור שכבה אחידה ודקה בין השבב למנסרה.
      הערה: שלב זה מבטיח תווך רציף של אותו RI בנתיב האופטי. חשוב להימנע משילוב בועות בשכבת השמן בשלב זה, שכן זה ישנה את התכונות האופטיות בנתיב ויעכב ניתוח נוסף.

Figure 2
איור 2: שבב ביולוגי וספוטר ידני. שבב ביו-שבב זהב (משמאל), ספוטר מיקרופיפטה (באמצע) והביו-שבב לאחר זיהוי עם טיפות ליגנד של 300 nL כל אחת (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: בדיקות קדם-ריכוז כדי לקבוע את רמת החומציות האופטימלית עבור השתלת ליגנדים. החיישן מציג את רמת האינטראקציה כפונקציה של זמן עבור ליגנד אחד המוזרק באופן אקראי (בערכי pH שונים) באותו ריכוז במשך 2 דקות על פני השטח. OG הוא חומר הניקוי, המאפשר לשחזר את קו הבסיס בין כל הזרקה. כאן, החיישן מציין כי pH 6 איפשר את השתלת הליגנד ביותר, עם אות SPRi של 1091 RU. קיצורים: OG = גלוקוזיד אוקטיל; RU = יחידת תגובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. הדמיית תהודה פלסמונית פני השטח

  1. הרכיבו את השבב הביולוגי על מערכת SPRi. שמור על קצב הזרימה של מאגר PBS (מאגר פועל) על 50 μL/min.
    הערה: אם יש בועות, הגדל את קצב הזרימה עד 500-1,000 מיקרוליטר לדקה, והזריק 40 mM אוקטיל גלוקוזיד (OG) לעתים קרובות כדי להסיר אותם בהקדם האפשרי.
  2. מיזוג שבב הזהב במכשיר SPRi: בחירת זוויות העבודה
    1. לחץ על התפריט הנפתח בצד שמאל של התוכנה, ולחץ על ספריית העבודה כדי להגדיר את התיקיה שבה יש לשמור את נתוני הניסוי. לאחר מכן, לחצו על פלסמון | רכישת תמונות.
    2. מצאו את התמונה (כפי שמוצג באיור 4A) שבה נראים כתמים שונים, ולחצו כדי לבחור בתמונה זו. כדי להגדיר את אזור העניין (ROI), כפי שהוא מיוצג באיור 4, לחצו על זיהוי אוטומטי או הגדרה ידנית בתוך הנקודות (איור 4B) או על השבב כדי להתייחס למיקום מסוים גם ללא כתמים (איור 4C).
    3. כאשר נעשה שימוש בביו-שבבים מרובים, כתוב את שם משפחות הליגנד ולאחר מכן לחץ על המקומות המתאימים.
      הערה: משפחת ליגנדים מתאימה למספר נקודות המתפקדות עם אותו ליגנד. בדרך כלל, השבב מציג לפחות כפילויות ואפילו לעתים קרובות triplicates של כל ליגנד.
    4. לחץ על הגדרת המינים הסופיים והמתן להיות מופנה לחלון המכיל את עקומות פלסמון שהתקבלו.
    5. בחר זווית עבודה. גרור את הקו השחור עם הסמן לזווית העבודה האופטימלית ולחץ על הזז שיקוף לזווית העבודה.
      הערה: עקומת פלסמון מורכבת מערך ההשתקפות (%) לעומת הזווית, והתוכנה נותנת עקומה נוספת עם ערך השיפוע (%) לעומת הזווית. כדי לבחור זווית עבודה טובה, בחר את הזווית עם הערך הגבוה ביותר של המדרון.
      1. במקרה של צעד פסיבי (בגלל אלבומין) המבוצע בתוך המנגנון, בחר זווית עבודה כדי לקבל את הרגישות האופטימלית כלפי פני השטח, ובכך ליצור בקרת איכות של תגובתיות פני השטח.
        הערה: שלב פסיבציה זה חשוב כאשר השבב מוכן לזיהוי ביולוגי של אהדה/לכידה כדי להפחית אינטראקציות לא ספציפיות בין הדגימה למשטח השבב.
  3. לחץ על Kinetics כדי להתחיל את הניטור הקינטי בזמן אמת. ברגע שהתוכנה מבקשת מהמשתמש להגדיר את הבקרה השלילית, בחר ללא שליטה שלילית בשלב זה (מכיוון שהדבר יאפשר התבוננות בקינטיקה על נקודות הבקרה השליליות).
    1. הזריקו אלבומין בסרום החולדות (RSA, 200 מיקרוגרם/מ"ל, מוכן במאגר אצטט, pH 4.5) בטמפרטורה של 50 מיקרוליטר/דקה למשך 4 דקות כדי לסובב את פני השטח סביב הכתמים ואולי למלא חללים ריקים בתוך נקודות הליגנד.
      הערה: ה-RSA מוזרק כדי לכסות את השבב הביולוגי, שאינו קשור לליגנדות כלשהן.
    2. הזריקו אתנולמין (1 M) במהירות של 20 μL/min למשך 10 דקות כדי להשבית את הקבוצות הקרבוקסיליות שעדיין קיימות ומגיבות על פני השטח.
    3. שטפו את השבב הביולוגי על ידי הזרקת 40 mM OG ב-50 מיקרוליטר/דקה למשך 4 דקות.
      הערה: לאחר שלב הפסיבציה, זווית העבודה מותאמת (כקביעה בסיסית חדשה לפני הזרקת הדגימה) כך שתהיה ברגישות הגבוהה ביותר בנקודות המעניינות.
  4. הזרקת דגימה:
    1. הגדירו מחדש את עקומות הפלסמון לאחר פסיבציה, ובחרו הפעם את זווית העבודה בהתאם לליגנד.
    2. בניטור קינטי, הפחיתו את קצב הזרימה ל-20 מיקרוליטר/דקה, והמתינו עד שקו הבסיס יהיה יציב.
    3. הזריקו את הדגימה בריכוז לפי בחירה (מ-1 x 10 8 EVs/mL ל-1 x10 10 EVs/mL בהתאם לזיקה בין כלי הרכב החשמליים לבין הליגנדות המושתלות), ולחצו על הזרקה ידנית או הזרקה אוטומטית. במקרה של הזרקה ידנית, לאחר הזרקת 200 μL של הדגימה, לחץ על עצור את ההזרקה. מאחר שמשך ההזרקה הוא בדרך כלל 10 דקות, התחילו לעקוב אחר הקינטיקה של האינטראקציה, ומדדו את השונות הרפלקטיבית על-ידי חישוב ההבדל ברפלקטיביות בין תחילת הזריקה לסופה שנצפה במהלך הניטור הקינטי (איור 5).
      הערה: הדגימות השונות שהוזרקו מתוארות בסעיף התוצאות המייצגות.
  5. לאחר הזרקת הדגימה, בצע אחת משתי הגישות הבאות כדי לסיים את ניסוי SPRi:
    1. בגישה הלא קבועה/ בנוזל, הוציאו את השבב הביולוגי ממנגנון SPRi, הוסיפו עליו טיפת נוזל והמשיכו לאפיון AFM נוסף של פני השטח בנוזל.
    2. בגישה הקבועה , הזריקו גלוטראלדהיד (0.5%) מדולל במים במהירות של 20 מיקרוליטר/דקה למשך 10 דקות כדי לקבע את המולקולות שנלכדו על השבב. הזריקו מים כדי לשטוף את פני השטח, הוציאו את השבב הביולוגי, שטפו אותו בעדינות רבה במים מזוקקים, וייבשו אותו באוויר כדי לעבור ניתוח נוסף תחת AFM.

Figure 4
איור 4: תמונת SPRi CCD של השבב הביולוגי. (A,B) שבב ביולוגי מרובב לאחר פסיבציה של אלבומין. (א) שבב ללא ברירת מחדל; (B) כמה פגמים שהופיעו על השבב: איחוי כתמים (i), השתלה חלשה (ii), או אבק או "מזהמים" (iii). ה-ROIs, בצבע הכתמים (צבע אחד לכל משפחת ליגנדים), נבחרו כדי להימנע מאותם "מזהמים". כאשר הכתמים התמזגו, הם צוינו וזכו להתעלמות או כ"תערובת של ליגנדות 1 ו-2". (C) שבב זהב עירום ללא מיקרו-מערכים לניסוי הבוחן ספיחת כלי רכב חשמליים על זהב. החץ הכחול מציין את כיוון הזרימה. שבב זה לא הציג כתמים, וה-ROI נבחרו לרשום את אות ההחזרה מקו 1 (L1, עיגולים אדומים) לקו 4 (L4, עיגולים סגולים) במהלך הזרקת הדגימה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ לכל שלוש התמונות. קיצורים: SPRi = הדמיית תהודה פלסמונית פני השטח; CCD = התקן מצומד טעינה; ROI = אזורי עניין; EVs = שלפוחיות חוץ-תאיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניסויי SPRi של הזרקת EV לשבב ביולוגי. (A) ניסוי לכידה על שבב ביולוגי מרובה משתתפים המראה את אותות ההחזרה של ליגנדות שונות. כאן, יחס האות לרעש עבור הליגנדות השונות היה טוב מאוד (ובמיוחד בנקודות antiCD41) מכיוון שתגובת הבקרה השלילית הייתה זניחה. (B) ניסוי ספיחה של כלי רכב חשמליים על שבב ביולוגי עירום. חיישן המציג את ההתניה של השבב עם שתי שטיפות של חיץ וניקוי OG (1), עם הזרקת דגימת EV (2), ואת אות ההחזרה לאחר אינטראקציה EV (3). על שבב ביולוגי זה לא הייתה בקרה שלילית, אך אות ההחזרה (הקינטיקה שלו, יציבותו לאחר ההזרקה) היה גבוה, כלומר אותם רכבים חשמליים הצליחו לספוח ולהישאר יציבים על שבב הזהב. קיצורים: EV = שלפוחית חוץ-תאית; OG = גלוקוזיד אוקטיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. מיקרוסקופ כוח אטומי

  1. השתמש במצב מגע כדי לסרוק את השבב הביולוגי באוויר ובמצב הדמיה כמותית כדי לסרוק את השבב הביולוגי בתנאי נוזל.
  2. יישרו את השבב הביולוגי בחלק העליון של המסכה על שקופית הזכוכית (שפותחה במעבדה) כדי לזהות את המיקום של המיקרו-כתמים המתאימים על השבב הביולוגי (איור 6A).
    הערה: המסכה מכילה את סימוני הכתמים, המתאימים למיקום הכתמים של הליגנדות בהתאם לתצפיתן בו נעשה שימוש. מסכה זו מורכבת משקופית זכוכית שעליה שני טריזים ניצבים מאפשרים את מיקום השבב. יתר על כן, מגלשת הזכוכית מסומנת ב -16 נקודות לבד המתאימות למיקום הנקודה על השבב, המאפשרת, על ידי שקיפות, לאיתור הכתמים וסריקת האזור הרצוי.
  3. מיקום הקצה:
    1. השתמש במצלמת CCD על גבי AFM כדי למקם את המזנון במקום הנכון שיש לסרוק. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש במכלים משולשים באורך 200 מיקרומטר, רוחב 28 מיקרומטר וקבוע קפיץ של 0.08 N/m.
  4. יישרו את הלייזר על החלק העליון של הפתח במיקום שנותן תגובה אופטימלית במנגנון בקרת המשוב.
  5. סריקה:
    1. לאחר הפעלה ומגע עם משטח הביו-שבב, התחל את רכישת AFM במצב מגע או במצב הדמיה כמותית משלושה עד חמישה אזורים גדולים (בדרך כלל 10 × 10 מיקרומ"ר) לאזורים קטנים (1 x 1 מיקרומטר רבוע).
      הערה: ייצוג של האזורים השונים שניתן לסרוק מוצג באיור 6D. ודא שאפיון AFM מייצג את כל נקודת המ"מ² ושמספיק כלי רכב חשמליים מוצגים ברזולוציה טובה לניתוח חזק (לפחות 300 כלי רכב חשמליים נספרים ונותחים עבור כל מצב), ובצע את מדידות המטרולוגיה והמורפולוגיה.
  6. טיפול בהדמיה AFM:
    1. טפל בתמונות AFM באמצעות תוכנת עיבוד נתונים JPK על ידי בחירת ערוץ הגובה תחילה.
    2. בחר התאמה פולינומית שיש להחסיר מכל שורה כדי לקבל קווי סריקה מיושרים.
    3. בחר את סף הגובה על גרגרי זהב כדי למנוע את חספוס המשטח. בתוכנה המוזכרת (ראה טבלת חומרים), בתוך מודול מיצוי התבואה, סמן את הגרגרים באמצעות ערך סף גובה של 8.5 ננומטר. לאחר סינון הגרגרים, מופיע מספר הגרגרים .
      הערה: בדרך כלל, מצע הזהב המחוספס (RMS של ~3 ננומטר) והנוכחות של שכבות הכימיקלים והליגנדים דורשים שהסף ייקבע על 8.5 ננומטר.
    4. כדי לחלץ מספר מאפיינים של הגרגרים המסומנים, כגון גובה, נפח וקוטר, פתח את התמונה בתוכנה שאליה בוצעה הפניה ובחר טיפול בנתונים | דגנים | סימון לפי סף.
    5. בחר גרגרי מסנן בפונקציה של מאפיינים. כאשר מופיע חלון חדש, בחר את הפרמטרים הבאים: ערך = מקסימום z-max, משטח = משטח מוקרן A0. לאחר מכן, בחר את הקריטריונים A ו- B.
    6. הפצת תבואה פתוחה; בחלון שמופיע, בחר ערך (מרבי), אמצעי אחסון (בסיס: אפס) וגבול (אורך). התבונן בטבלה (בתבנית .txt) שמופיעה, המציגה שלוש עמודות עם ערכי הגובה, הנפח והקוטר של כל הגרעינים שזוהו בסף שנקבע לכל תמונה.
    7. מהגובה, h וקוטר, D, חשב את רדיוס העקמומיות, Rc, של כל EV באמצעות משוואה (1)8, ולאחר מכן חשב את הנפח, V, באמצעות משוואה (2):
      Equation 1(1)
      Equation 2(2)
    8. מתוך V, חשב את הקוטר האפקטיבי, d eff, של כל EV (קוטר כדור באותו נפח) באמצעות משוואה (3):
      Equation 3(3)
    9. תרשימי התוויית תרשים המציגים את הגדלים (גובה נמדד, קוטר נמדד וקוטר אפקטיבי מחושב) של כלי רכב חשמליים, כאשר כל חלקיק נספר מיוצג על ידי נקודה.
      הערה: כך, בסוף האפיון, פלטפורמת NBA מאפשרת את ההתאמה של אות הזיהוי הביולוגי ולאחר מכן, הפנוטיפ, עם המספרים והגדלים של תת-קבוצות הרכב החשמלי.

Figure 6
איור 6: אפיון ביו-שבב על-ידי AFM. לאחר ניסוי SPRi, השבב תוקן והתייבש או נשמר בנוזל לצורך אפיון AFM. (A) שקופית זכוכית במכונה (עם שני טריזי מיקום מאונכים, המסומנים באות "w" על התמונה) המציגה מסכה המתאימה ללוקליזציה של 16 מיקרו-מערכי הביו-שבב. על ידי חשיפה לאור ושקיפות, לאחר התקנתו לאפיון AFM, מגלשת הזכוכית מאפשרת למקם את קצה ה-AFM על הנקודה הרצויה כדי לאפיין אותו. (B) השבב הביולוגי המותקן על שקופית ה"מסכה" ותחת טיפת חיץ לסריקה בתנאי נוזל. (C) תמונת SPRi של 16 המיקרו-מערכים. (D) מיקרו-מערך אחד שצולם במיקרוסקופ אופטי לאחר לכידה חיסונית של ננו-חלקיקי כיול ביו-פונקציונליים בקוטר 920 ננומטר. הריבועים הלבנים מציינים את הדגימה של האזורים השונים שנסרקו על ידי AFM בכל נקודה מעניינת כדי להפוך את אפיון AFM לחזק. פסי קנה מידה = (C) 1 מ"מ, (D) 500 מיקרומטר. קיצורים: AFM = מיקרוסקופ כוח אטומי; SPRi = הדמיית תהודה פלסמונית פני השטח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. ספקטרוסקופיית ראמאן

הערה: עבור ספקטרוסקופיית ראמאן, החלף את שקופית הזכוכית המשמשת כמצע בשקופית של CaF2, בעלת חתימת ראמאן זניחה.

  1. תנאים אופטיים לרכישה:
    1. הגדר את התנאים הבאים עבור מיקרוסקופ הדמיה ראמאן: מטרת המיקרוסקופ: 50x; אורך גל לייזר: 532 ננומטר; עוצמת לייזר: 10 mW; זמן חשיפה: 500 ms; מספר הצטברות: 140; טווח ספקטרלי: מ 450 cm−1 עד 3,200 cm−1.
      הערה: שימוש בכוח רב מדי ו/או זמן רכישה ארוך מדי עלול להוביל לנזק לדגימה, המתבטא בספקטרום לא יציב לאורך זמן. התחל עם כמות נמוכה של אנרגיה והגדל אותה אם האות חלש מדי. ניתן להשתמש באורכי גל לייזר גבוהים יותר (633 ננומטר, 785 ננומטר) כדי להפחית את הפלואורסצנטיות המזיקה למדידות ראמאן. עם זאת, העוצמה יורדת עם העוצמה הרביעית של אורך הגל, ויש לקחת בחשבון את הרגישות הספקטרלית של המצלמה.
  2. הדמיית ראמאן:
    1. ראשית, התבונן בספקטרום החי עם מספר מופחת של הצטברויות (10) כדי למצוא את האזור עם יחס האות לרעש הטוב ביותר.
      הערה: אות חזק באזור התדר הגבוה (2,800-3,000 ס"מ−1) יכול להקל על זיהוי כלי רכב חשמליים על פני השטח עם זמני חשיפה נמוכים, כפי שהוצג קודם לכן10.
    2. לאחר בחירת החזר ההשקעה, בחר את הרזולוציה המרחבית בהתאם לזמן הזמין לרכישה.
      הערה: הרזולוציה המרחבית מוגבלת על-ידי מגבלת העקיפה (~500 ננומטר).
    3. התחל את רכישת מיפוי ראמאן.
  3. עיבוד מקדים של נתונים:
    1. באמצעות סביבת פיתוח משולבת Python (IDE) (למשל, Spyder), פתח את הקובץ המכיל את הספקטרה.
    2. החסר את קו הבסיס של הספקטרום כדי לתקן את ההפרעה מפלואורסצנטיות אפשרית. לדוגמה, השתמש בפונקציה "arpls" מהחבילה "irfpy"23. בדוק ערכים שונים של הפרמטר "lam" כדי למצוא את אחד שנותן את תיקון קו הבסיס הטוב ביותר (בדרך כלל בין 10,3 ו 10,7).
    3. לנרמל את הספקטרה, למשל, על ידי חלוקת כל העוצמות של ספקטרום בעוצמתו ב-2,900 ס"מ-1 או על ידי חיסור הממוצע של הספקטרום ולאחר מכן חלוקתו בסטיית התקן שלו (נורמליזציה של "משתנה נורמלי סטנדרטי").
      הערה: שלב זה נחוץ כדי להשוות את ההרכב המולקולרי היחסי של כלי רכב חשמליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קביעת תנאי החומציות האופטימליים להשתלת ליגנד
הליגנדות השונות שמשמשות להכנת הביו-שבבים נבדקות כפונקציה של ה-pH והזמינות שלהן לאינטראקציה עם השכבה הכימית של תיולאט (איור 3). הליגנדות מדוללות במאגר אצטט בערכי pH שונים ומוזרקות על השבב הביולוגי המתפקד כימית עם שכבת C11C16. התמיסות מוזרקות באופן אקראי על פני השטח, וחומר ניקוי (OG ב 40 mM) מוזרק לאחר כל הזרקת ליגנד כדי לשחזר את קו הבסיס. בדיקת ריכוז מוקדמת זו מאפשרת לקבוע את רמת החומציות האופטימלית עבור כל השתלת ליגנד. בדוגמה המוצגת באיור 3, pH של 6 נבחר כ-pH הטוב ביותר במונחים של שיפוע ורמת השתלת ליגנדים.

SPRi CCD תמונות
תמונות SPRi CCD הרשומות על השבב הביולוגי (עירום, מתפקד כימית או מציג מיקרו-מערכים) לאחר החדרתן למכונת SPRi מוצגות באיור 4. במקרה של השבב המציג מיקרו-מערך, התמונה צולמה לאחר פסיבציה אלבומין של פני השטח. כפילויות או טריפליקטים של כתמים מומשו באופן שיטתי על השבב, ושליטה שלילית הייתה אוטומטית גם על השבב. הבקרה השלילית כללה בעיקר נוגדן לא רלוונטי. ב-SPRi, כאשר נעשה שימוש בביו-שבב ללא איתור - לספיחה על זהב עירום או להשתלה ישירה של כלי רכב חשמליים על שבב ביולוגי המתפקד כימית - ה-ROI נבחרו באופן שרירותי באזור החישה. לדוגמה, איור 4C מראה החזר השקעה שנבחר על שבב זהב עירום לפני הזרקת כלי רכב חשמליים.

הודות לתמונת SPRi CCD זו, ניתן להתעלם מכתמים מסוימים אם בעיות כאלה מופיעות במהלך ההשתלה. תמונת SPRi CCD מאפשרת גם להעריך את ההומוגניות של השתל בתוך הכתם, מבטיחה את יכולת השחזור של ההשתלה בין נקודות שונות של אותו ליגנד, ולבסוף, מבטיחה שהגילוי הביולוגי של EV מתקדם במערכים שווי ערך מבחינת צפיפות פני השטח.

תוצאות SPRi
כאשר ההחזר על ההשקעה נבחר, קו הבסיס יציב, כלומר ניתן להזריק את הדגימה. איור 5 מראה תוצאות שונות שהתקבלו על שבב ביולוגי מרובה, וחושף יחס אות לרעש גבוה עבור מערכים חיסוניים מסוימים (אות ההחזרה היה 1.4% ב- antiCD41 בהשוואה לתגובה בבקרה השלילית של 0.02%). איור 5B מציג את התוצאות עבור ספיחת רכב חשמלי שהתקבלו לאחר הזרקת דגימת EV על שבב זהב עירום. דגימת N-PEVs הייתה מטסיות דם. התמיסה הייתה צנטריפוגה ב 3,000 × גרם במשך 15 דקות ב 22 ° C; לאחר מכן הסופרנאטנט היה צנטריפוגה שוב ב 20,000 × גרם במשך 15 דקות ב 22 ° C. הגלולה שהתקבלה הושעתה מחדש בחיץ. תוצאות SPRi שהתקבלו על N-PEV שנלכדו במערכת החיסון הושוו לתוצאות הכתם המערבי (WB). ה-WB חשף ביטוי חזק של CD41, CD62P ו-CD9 בדגימות אלה, והדגיש מתאם טוב עם תוצאות SPRi (איור משלים S1).

איור 5B מציג את התוצאות עבור ספיחת רכב חשמלי שהתקבלו לאחר הזרקת דגימת EV מתאי אפיתל ראשוניים של חלב אנושי (HMECs) על שבב זהב עירום. תרבית תאי HMEC עברה צנטריפוגה ב-3,650 × גרם במשך 10 דקות, ואז הסופרנאטנט עבר שוב צנטריפוגה ב-10,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הגלולה שהתקבלה הושעתה מחדש בחיץ PBS 1x כדי לשטוף אותה, והצנטריפוגה בוצעה שוב ב 10,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C. לבסוף, הגלולה הושעתה במאגר PBS 1x.

אפיון AFM
לאחר ניסויי SPRi וטעינת EV על השבבים הביולוגיים (בין אם על ידי ספיחה, השתלה או לכידת זיקה), AFM בוצע על ידי ביצוע המתודולוגיה של סריקת סריקות גדולות (10 x 10 מיקרומ"ר) ולאחר מכן (~ 10 לפחות) סריקות קטנות יותר (כמה מיקרומ"ר). איור 7 מציג דוגמאות של תמונות AFM בקנה מידה גדול ובקנה מידה קטן של כלי רכב חשמליים על שבבים ביולוגיים.

Figure 7
איור 7: אפיון AFM של כלי רכב חשמליים על שבב ביולוגי. תמונות המתקבלות במצב מגע של דגימה מיובשת. (A) דוגמה אחת של שטח סריקה גדול כדי לתת תצוגה מייצגת של החזר ההשקעה של mm² על השבב. תוצאה זו התקבלה לאחר השתלה קוולנטית של כלי רכב חשמליים על משטח שעבר שינוי כימי. (B) דוגמה נוספת לשטח סריקה גדול שהתקבל לאחר לכידתם של כלי רכב חשמליים על מערכים חיסוניים. (C) מבט מקרוב על העצמים כדי לקבל רזולוציה גבוהה ולאפשר מטרולוגיה (בגובה ובקוטר) של כלי רכב חשמליים. (D) מבט מקרוב על השבב הביולוגי בתמונה ב-(A) עם תמונה מוטה תלת-ממדית. (E) תצוגה מוגדלת של רכב חשמלי אחד גדול שנספג על שבב ביולוגי מזהב עירום בתמונה תלת-ממדית מוטה. סולם Z הוא (A, B) 30 ננומטר ו-(C) 20 ננומטר. פסי קנה מידה = (A, B) 2 מיקרומטר, (C) 500 ננומטר. קיצורים: AFM = מיקרוסקופ כוח אטומי; EVs = שלפוחיות חוץ-תאיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח Gwyddion
תוכנת Gwyddion שימשה לעיבוד הנתונים עבור כל שלפוחית שהוצגה בכל אצווה של תמונות AFM. ראשית, נסרק שטח גדול (בטווח של 10 x 10 מיקרומ"ר) המציג תצוגה מייצגת של החזר ההשקעה של mm² על השבב. התמונה באיור 7A מראה שהמשטח היה מכוסה בצפיפות בעצמים. במקרה זה, כלי הרכב החשמליים (מחלב בקר) הוזרקו בעוצמה של 2.5 ×10 10/מ"ל לשבב פעיל המתפקד בתיול. לאחר סילוק קזאין מהדגימה, סופרנאטנטים של מי גבינה רוכזו על ידי צנטריפוגות בטמפרטורה של 4,000 × גרם ו-20°C באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות של Amicon 100 kDa ובודדו את כלי הרכב החשמליים באמצעות גישת האולטרה-צנטריפוגה ההדרגתית של סוכרוז. תוצאה זו מתאימה לכלי רכב חשמליים שהושתלו באופן קוולנטי על משטח שעבר שינוי כימי. איור 7B מראה דוגמה נוספת לאזור סריקה גדול שהתקבל לאחר לכידה של כלי רכב חשמליים על מערכים חיסוניים. גם כאן, עצמים היו נוכחים על פני השטח אך הראו כיסוי פחות צפוף מאשר כאשר הרכבים החשמליים הושתלו באופן קוולנטי על השבב. מבט מקרוב, באיור 7C, במספר מקומות בהחזר ההשקעה מאפשר רזולוציה גבוהה ואת המטרולוגיה (בגובה ובקוטר) של כלי רכב חשמליים. מבט קרוב יותר (איור 7D) על השבב הביולוגי שמוצג באיור 7A, עם תמונה מוטה תלת-ממדית, מגלה עצמים שהם בועיות אך גם נימיים (למעלה משמאל). ואכן, בעוד ששבבים חיסוניים מאפשרים לכידה סלקטיבית ודיפרנציאלית של תת-קבוצות EV, השתלה קוולנטית משתילה את כל העצמים עם קבוצות אמין חופשיות שנמצאות בדגימה. באיור 7E, AFM חושף רכב חשמלי אחד גדול מתרבות HMEC שנספג על זהב עירום. לפיכך, AFM מסוגל לחשוף כלי רכב חשמליים קטנים עד גדולים ולמדוד אותם ומסייע לספור את מספר העצמים למ"מ² בכך שהוא מאפשר הדמיה של כל רכב חשמלי.

נקבעו הגובה והקוטר הנמדדים של כל רכב חשמלי, שממנו התקבל הקוטר האפקטיבי. גבהי הרכב החשמלי כיסו טווח שבין 10 ננומטר ל-50 ננומטר, עם ממוצע של 15 ננומטר; קוטר הרכב החשמלי שנמדד נע בין 50 ננומטר ל-300 ננומטר, עם ממוצע של 100 ננומטר. ראינו שהקוטר האפקטיבי של כלי הרכב החשמליים נע בין 30 ננומטר ל-300 ננומטר, כאשר רובם הגדול נע סביב 60 ננומטר (איור 8A). מדידות אלה בוצעו בנוזל או לאחר קיבוע וייבוש. איור 8B מגלה שהתוצאות שהתקבלו בשני התנאים האלה היו דומות.

Figure 8
איור 8: תוצאות שנוצרו על ידי אפיון AFM של כלי רכב חשמליים על שבב ביולוגי. (A) מטרולוגיה של כלי רכב חשמליים בנקודה אחת (antiCD41 immunoarray), שנקבעה בסף של 8.5 ננומטר ולאחר הזרקת דגימת EV ב-2.5 ×10 10/mL. "הקוטר המחושב האפקטיבי" מוצג, כאשר כל נקודה מתאימה לחלקיק המודגם בתמונות AFM. (B) היסטוגרמה המופקת מהנתונים ב-(A), המראה את התפלגות הקוטר האפקטיבי של כלי הרכב החשמליים. תוצאות שהתקבלו באוויר (באדום: מדגם קבוע ומיובש) ובנוזל (בכחול: לא קבוע). קיצורים: AFM = מיקרוסקופ כוח אטומי; EVs = שלפוחיות חוץ-תאיות . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח N-PEV על ידי AFM הושווה לתוצאות נת"ע. תוצאות "בתמיסה" האחרונות, של נת"ע, הראו התפלגות של קוטר הרכב החשמלי מ-32 ננומטר ל-650 ננומטר, עם רוב גדול בין 90 ננומטר לקוטר 250 ננומטר. לפיכך, בהתחשב בכך שנת"ע אינה רגישה לגדלים קטנים (קרוב ל-50 ננומטר), מדידות AFM אלה מראות מתאם טוב עם תוצאות אלה (איור משלים S2).

ניסויי הרמאן, שמומשו על כלי רכב חשמליים שנספחו על שבב עירום, הניבו תוצאות מעודדות; באופן ספציפי, התקבל ספקטרום ברור של כלי הרכב החשמליים (איור 9). ניתן להפריד את ספקטרום הרמאן לשלושה טווחים שונים: אזור "טביעת האצבע" (מתחת ל-1,800 ס"מ-1), המכיל פסגות היוצרות תבניות ספציפיות למולקולריות ולכן הוא החלק החשוב ביותר למטרות זיהוי; האזור ה"ביו-שקט" (1,800-2,800 ס"מ-1), שבדרך כלל נזרק בעת בדיקת דגימות ביולוגיות מכיוון שאינו מכיל פסגות; ואזור "התדרים הגבוהים", המכיל בעיקר מידע על ליפידים ולעתים קרובות הוא החלק האינטנסיבי ביותר בספקטרום אך פחות ספציפי. הספקטרום מראה שיאים המתאימים בעיקר לתנודות CH 2 (2,853 ס"מ−1, 1,444 ס"מ−1 ו-130 ס"מ−1), המשויכות לשומנים של קרום הרכב החשמלי ולשיא המתאים לחומצת האמינו פנילאלנין 21. טבלת הקצאת שיא ראמאן של מולקולות נפוצות הקיימות בכלי רכב חשמליים ניתן למצוא במאמר של Penders et al.22.

Figure 9
איור 9: אפיון ספקטרוסקופיית ראמאן של כלי רכב חשמליים על שבב ביולוגי. כאן, דגימת הרכב החשמלי נלקחה מ-HMECculture ונמצאה באמצעות צנטריפוגה ב-20,000 × גרם. (A) דוגמה לתמונת ראמאן של כלי רכב חשמליים הנספחים על שבב ביולוגי עירום (עוצמה ממוצעת), על גבי תמונת שדה בהיר. (B) דוגמה לספקטרום ראמאן נמדד של כלי רכב חשמליים. הקווים המקווקווים מתאימים לתנודות מזוהות. α, מספריים; τ, מתפתל; υ, מתיחה (s, סימטרי; as, אסימטרי). סרגל קנה מידה = (A) 50 מיקרומטר. קיצורים: EVs = שלפוחיות חוץ-תאיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: מדידות מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) של N-PEVs. כלי הרכב החשמליים דוללו ב-PBS; הניסויים נעשו בטריפליקט באמצעות מכשיר MALVERN NS300. קוטר ממוצע = 137.5 ננומטר ± 1.3 ננומטר; קוטר מצב = 104.9 ננומטר ± 13.3 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: מבחני כתמים מערביים של N-PEVs. N-PEVs (1) ו-(2) מתאימים לשתי קבוצות של N-PEVs שהוכנו משני כיסים של תרכיז טסיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטות האחרונות לזיהוי EV שנמצאות בשימוש הנרחב ביותר הן אימונובלוטינג ספציפי לחלבון כדי לאשר את מקורם של כלי רכב חשמליים, TEM כדי לאשר את המבנה שלהם, ונת"ע כדי לכמת את התפלגות מספרם וגודלם במדגםנפח 3. עם זאת, העניין הרב ברכבים חשמליים במחקר (ביו)רפואי והמגבלות של הכלים האנליטיים הקיימים הניעו את הקהילה המדעית לפתח שיטות חדשות לאפיון, אפליה וכימות של כלי רכב חשמליים.

רוב הפיתוחים מתמקדים בשילוב עקרונות התיוג החיסוני או לכידת החיסון עם שיטות פיזיקליות מתקדמות לזיהוי רכב חשמלי. חלק מגישות אלה מתמקדות בזיהוי של כלי רכב חשמליים בודדים כדי להשיג נתונים אמינים ביותר בקנה מידה ננו-עצמי. אחרים מודאגים יותר מהצעת שיטות גלובליות שהן זולות ואמינות לשימוש קליני.

פלטפורמת ה-NBA, המשלבת זיהוי ביולוגי של כלי רכב חשמליים על מצע זהב מרובה ואפיון AFM, מאפשרת את ההסמכה העמוקה של הננו-שלפוחיות הקיימות בנוזלים ביולוגיים מורכבים. ואכן, בשל הסלקטיביות של השבב הביולוגי, ניתן להזריק דגימות גולמיות, וניתן להדגיש את תרומת השלפוחית.

הגישה המוצעת מורכבת מאפיון של כלי רכב חשמליים שנספגו/הושתלו או נתפסו על ידי זיקה על מצע זהב גולמי. AFM, המשמש בדרך כלל על מצעים שטוחים אטומית, עדיין מראה ביצועים אופטימליים על שבב הזהב הגס, וחושף ממשקים שונים שהם מיקרו/ננו-מבנים.

השבב הביולוגי המרובב המציג מספר כתמים לסריקה (עד 16 עד כה) וגישת ה-NBA לדגימות קבועות ומיובשות פותחו כדי להפחית את הזמן הדרוש לחקירת AFM עמוקה ופעונה מאוד של כל נקודה. בדיקות שונות שנערכו במעבדה הראו כי הליך זה (קיבוע, ייבוש והדמיה באוויר) אינו משפיע באופן משמעותי על המטרולוגיה של כלי רכב חשמליים.

ישנם שני שלבים קריטיים עיקריים בגישה: מציאת פשרה לבחירת רגישות השבב הטובה ביותר עבור כל הליגנדות המושתלות השונות ודיסוציאציה של EV מהמצע בסוף לאחר ההזרקה. כאן, נעשה שימוש במכונת SPRi העובדת עם זווית תהודה אחת ויחידה, המציינת כי יש לבחור את הפשרה הטובה ביותר בתגובת פלסמון עבור כל כתמי הליגנדות. עבור ליגנדות מסוימות, הגילוי יהיה רגיש מאוד (קרוב לזווית האופטימלית); עבור אחרים, הזיהוי יהיה פחות רגיש אם ערך הזווית הקבועה שונה מהזווית האופטימלית. ניתן להתגבר על כך על ידי שימוש בדור האחרון של מכשור SPRi המספק עד 10 זוויות עבודה שונות.

השלב הקריטי השני הוא ניתוק כלי הרכב החשמליים מהמצע לאחר ההזרקה. אם הדיסוציאציה גבוהה מדי (מכיוון שכלי הרכב החשמליים מציגים, למשל, רק חלבונים ספציפיים מעטים על פני השטח שלהם), לא ניתן יהיה לסרוק באמצעות AFM לאחר מכן. מצבים אלה נדירים מאוד, אך כאשר הם מתרחשים, קצב הזרימה ומשך ההזרקה חייבים להיות אופטימליים כדי לפתור את הבעיה.

מגבלה של השיטה המוצעת יכולה להיות חוסר ייצוגיות של המתאם בין תצפיות AFM עם שטח mm² של אינטראקציות EV על השבב. לשם כך יש לסרוק אזורים שונים במקום, כולל מאזורים גדולים לאזורים קטנים ובמקומות שונים בתוך המקום. באופן אידיאלי, הסריקה צריכה להתבצע באזור החזר ההשקעה עבור מתאם טוב בין אפיון AFM לבין תגובת SPRi.

בעבודות אחרות, מחברי המחקר השתמשו בזיהוי אופטי וספירה דיגיטלית של כלי רכב חשמליים בודדים, המבוססים על הדמיה אינטרפרומטרית של כלי רכב חשמליים שנלכדו על מצע סיליקון ביו-פונקציונלי. טכניקה זו מאפשרת להעריך את גודל כלי הרכב החשמליים בשל הניגודיות שנצפתה. פלטפורמה זו, אם כן, אפשרה, באמצעות הסמנים השופעים CD9, CD63, ו- CD81, להכפיל את הניתוח ולזהות את נוכחותם של EVs המבטאים סמן עצבי, CD171, בנוזל השדרה בבני אדם24.

גישה משולבת ונטולת תוויות זו, המסתייעת במתודולוגיה קפדנית בהכנת השבב הביולוגי ובמצב רכישת AFM, מהווה שיטה מועדפת לאפיון כלי רכב חשמליים באמצעות לכידתם בזמן אמת ותחת זרימה אפילו בדגימות מורכבות וגולמיות. ואכן, אין צורך בשלבים פרה-אנליטיים עם הדגימה ואין צורך בשלבי תיוג או הסרת מסכה בשיטה המוצגת. בספרות, ארטסגארד ועמיתיו חשפו סמני ממברנת EV נפוצים שונים באמצעות חיישן דימות החזרה אינטרפרומטרית של חלקיק יחיד (SP-IRIS), אך במצב סטטי (ללא זרימה) ללא מדידות קינטיות, ונתנו רק הערכה של גודל EV25.

הודות להליך אופטימלי זה המאפשר הכנת ממשקים ביולוגיים תגובתיים ומבוקרים וביו-שבבים מרובבים פסיביים, ניתן לאפיין באופן עמוק תת-קבוצות של EV כאשר הן מוזרקות כדגימות גולמיות. אלמנטים שונים אלה הופכים את פלטפורמת ה-NBA הזו לשיטה רלוונטית ביותר לניתוח ישיר, עמוק ופתור, של כלי רכב חשמליים בדגימות גולמיות.

ספקטרוסקופיה, ובמיוחד ספקטרוסקופיית ראמאן משופרת פני השטח (SERS), מסתמנת כשיטת בחירה לניתוח ביוכימי של סמנים ביולוגיים של EV המבוטאים בצורה חלשה. אסטרטגיה זו אפשרה פיתוח של בדיקות מרובות עם רגישויות של כמה עשרות כלי רכב חשמליים למיקרוליטר. הדמיית SERS בשילוב עם שיטות מיון (למשל, דיאלקטרופורזה) מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של הרכב רכב חשמלי26.

בעבודה זו, ניסויי הרמאן שבוצעו על שבבי זהב היו גם מעודדים מאוד, שכן התקבל ספקטרום ברור של כלי רכב חשמליים, ובכך נתנו תובנה לגבי ההרכב המולקולרי שלהם. פיתוחים עתידיים עשויים לכלול גם SERS כדי להגדיל את האות המגיע מכלי הרכב החשמליים על פני השטח של השבב הביולוגי וספקטרוסקופיית ראמאן משופרת קצה (TERS) כדי לקבל תמונות ברזולוציה ננומטרית, ובכך לאפשר אפיון של רכב חשמלי יחיד.

התפתחויות אחרונות במעבדה נעשו כדי לשפר את הרגישות של זיהוי ביולוגי ואת ההבחנה בין תת-קבוצות EV המתקיימות יחד בדגימה ועשויות לקיים אינטראקציה משותפת באותם מערכים. כדי להגביר את הרגישות, עוברים הניסויים למערכת SPRi, המאפשרת בחירה של מספר זוויות לזיהוי רכב חשמלי בנקודות שונות. כדי לשפר את ההבחנה בין תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים, יש לעמוד באתגרים שונים: i) השגת חתימת Raman ספקטרוסקופית של כל תת-קבוצה של EV על השבב הביולוגי, ii) הגדלת מספר הכתמים שזוהו על הביו-שבב (מ-16 ל-100), ו-iii) הגדלת התפוקה של הניתוח באמצעות AFM במהירות גבוהה (HS AFM). יתר על כן, HS AFM יאפשר גם אפיון של תת-קבוצות EV במהירות ובתנאי נוזל.

כמה נקודות אחרות שיש לשים לב אליהן הן שאם ההידרופיליות של שבב הזהב גבוהה, קיים סיכון שכתמי הליגנדות יחפפו ויתערבבו יחד (כפי שמוצג באיור 4B). יש להימנע מהזרקת בועות אוויר במהלך הזרקת תמיסות תחת SPRi, שכן הדבר יוביל לשינויים בהשתקפות ויתרום לניטור שגוי של אות SPRi.

בעת סריקת המשטחים עם AFM, יש צורך לצפות בתמונות כדי לבדוק אם יש שינויים דרסטיים בערך הסכום או אם יש חפצים (למשל, מראה חוזר של אובייקטים). ייתכן שהסיבה לכך היא זיהום בקצה AFM; במקרה זה, יש להחליף את החוד.

ישנן כמה מגבלות של הטכניקה שראינו: רגישות השבב שנבחרה עבור כל הליגנדות המושתלות השונות אינה אופטימלית עבור כולן; ניתוק כלי הרכב החשמליים מהמצע בתום ההזרקה; והרזולוציה הנמוכה יותר (מאשר AFM) של הדמיית ראמאן, שאינה מאפשרת הדמיה של כלי רכב חשמליים בודדים.

למרות המגבלות, לפרוטוקול זה יתרונות רבים ומשמעותיים ביחס לשיטות הקיימות. שילוב השיטות ללא תוויות (ספקטרוסקופיית SPRi + AFM + ראמאן) על אותו מצע ולאחר מכן על אותה דגימה ביולוגית מונע הטיה בין האנליזות עקב המצע ומעניק מקוריות גבוהה וביטחון לניתוח תת-קבוצות EV.

פלטפורמה אנליטית מהונדסת כזו תוכל לסייע באפיון רכב חשמלי בהקשרים שונים, כגון בתחומי האבחון והביותרפיה האצלולרית ונוזלים ביולוגיים מדם לסופרנאטים של תאים. בנוסף להסמכת EV, ננו-עצמים אחרים (למשל, קומפלקסים מולקולריים, ננו-חלקיקים סינתטיים, וירוסים) יכולים להיות מאופיינים על ידי פלטפורמה אנליטית רב-מודאלית זו.

למרות המגוון הרחב של שיטות שפותחו ויושמו בקהילת הרכב החשמלי, לכל אחת מהטכניקות הללו יש פוטנציאל משלה והבדלים בביצועים במונחים של טווח דינמי, דיוק, תפוקה ויישום לניתוח פרמטרים ספציפיים של EV26. גישות חדשניות, אולטרה-רגישות ורב-שלביות (הפרדה, בחירה, חתימה ספקטרלית וניתוח של תכולת שלפוחית), כגון פלטפורמה אנליטית רב-מודאלית זו, גם כאשר היא מיושמת על נפחים קטנים על שבבים (מעבדה על שבב), מספקות פרספקטיבות חדשות בתחום הביופסיות הנוזליות, ניטור ביולוגי ורפואה מדויקת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

קלי אוברטין ופביאן פיקו ממתקן הליבה IVETh (פריז) מוכרים על ניסויי ההדמיה של ראמאן. תיירי בורנוף (האוניברסיטה הרפואית של טאיפיי, טייוואן) וזוזנה קרופובה (מהלינקור, צרפת) מוכרים על מתן דגימות EV שמקורן בדגימות טסיות דם וחלב בקר, בהתאמה. העבודה נתמכה על ידי אזור Bourgogne Franche-Comté ובית הספר לתארים מתקדמים EUR EIPHI (פרויקט טירון, 2021-2024). חלק מעבודה זו נעשתה באמצעות פלטפורמת CLIPP ובמתקני החדרים הנקיים של RENATECH ב-FEMTO-ENGINEERING, ועל כך אנו מודים לרבאח זגרי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD41a antibody Diaclone SAS (France) 447528
CP920 Microparticles GmbH, Germany 448303
DXR3xi  Thermo Fisher Scientific T1502
EDC Sigma A6272
Ethanolamine Sigma P5368-10PAK
Evs derived from platelet concentrates Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) S2889
Evs from bovine milk Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France) 3450
Glutaraldehyde Sigma 56845
Gwyddion  853.223.020
Magnetron sputtering PLASSYS SAB5300165
mercapto-1-hexadecanoic acid Sigma G5882
Mercapto-1-undecanol  Sigma O8001
Mountains SPIP ones Digital Surf
NanoWizard 3 Bioscience  Bruker-JPK 
Octyl Glucoside (OG)  Sigma
Ovalbumine antibody Sigma
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma
Rat Albumin Serum (RSA) Sigma
Sodium acetate buffer  Sigma
SPR-Biacore 3000 GE Healthcare/ Cytiva life sciences
SPRi Biochip MIMENTO technology platform The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon
SPRi Plex II Horiba Scientific 
Sulfo-NHS Sigma

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).
  2. Xunian, Z., Kalluri, R. Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes. Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).
  3. Hartjes, T. A., et al. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
  4. Xing, Y., et al. Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms. Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).
  5. Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations. Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).
  6. Boireau, W., Elie-Caille, C. Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization. Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).
  7. Brisson, A. R., et al. Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study. Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).
  8. Yuana, Y., et al. Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).
  9. Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., Pétry, J. Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy. Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006 (2017).
  10. Beekman, P., et al. Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy. Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).
  11. Malenica, M., et al. Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids. Biomedicines. 9 (6), 603 (2021).
  12. Verweij, F. J., et al. The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo. Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).
  13. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  14. Obeid, S., et al. NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).
  15. Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for «on-chip» qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).
  16. Ridolfi, A., et al. AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles. Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).
  17. Vorselen, D., et al. The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis. Nature Communications. 9 (1), 4960 (2018).
  18. Hardij, J., et al. Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045 (2013).
  19. Jorgensen, M., et al. Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920 (2013).
  20. Remy-Martin, F., et al. Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).
  21. Czamara, K., et al. Raman spectroscopy of lipids: A review. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).
  22. Penders, J., et al. Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers. ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).
  23. Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing. Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).
  24. Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Scientific Reports. 6, 37246 (2016).
  25. Ertsgaard, C. T., et al. Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles. Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).
  26. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).

Tags

ביולוגיה גיליון 193
פלטפורמה אנליטית רב-מודאלית על שבב דימות תהודה פלסמון מרובה פני שטח לניתוח תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raizada, G., Namasivayam, B., Obeid, … More

Raizada, G., Namasivayam, B., Obeid, S., Brunel, B., Boireau, W., Lesniewska, E., Elie-Caille, C. Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets. J. Vis. Exp. (193), e64210, doi:10.3791/64210 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter