Summary
Dette papir foreslår en ny generation af multiparametriske analytiske platforme med øget gennemstrømning til karakterisering af ekstracellulære vesikelundergrupper. Metoden er baseret på en kombination af multipleksede biosensingmetoder med metrologiske og morfomekaniske analyser ved atomkraftmikroskopi, kombineret med Raman-spektroskopi, for at kvalificere vesikulære mål fanget på en mikroarray-biochip.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV'er) er membranafledte, små vesikler produceret af alle celler, der spænder fra 50 til flere hundrede nanometer i diameter og bruges som et middel til intercellulær kommunikation. De fremstår som lovende diagnostiske og terapeutiske værktøjer til en række sygdomme. Der er to primære biogeneseprocesser, der anvendes af celler til at producere elbiler med forskelle i størrelse, sammensætning og indhold. På grund af deres høje kompleksitet i størrelse, sammensætning og celleoprindelse kræver deres karakterisering en kombination af analytiske teknikker. Dette projekt involverer udvikling af en ny generation af multiparametriske analytiske platforme med øget gennemstrømning til karakterisering af delpopulationer af elbiler. For at nå dette mål starter arbejdet fra den nanobioanalytiske platform (NBA), der er etableret af gruppen, som muliggør en original undersøgelse af elbiler baseret på en kombination af multipleksede biosensingmetoder med metrologiske og morfomekaniske analyser ved atomkraftmikroskopi (AFM) af vesikulære mål fanget på en mikroarray-biochip. Målet var at afslutte denne EV-undersøgelse med en fænotypisk og molekylær analyse ved Raman-spektroskopi. Denne udvikling gør det muligt at foreslå en multimodal og brugervenlig analytisk løsning til diskriminering af EV-undergrupper i biologiske væsker med klinisk potentiale
Introduction
Den stigende interesse for EV-forskning i diagnose og terapi 1,2,3,4,5 kombineret med de udfordringer, dette felt står over for, har resulteret i udvikling og implementering af en lang række tilgange og teknikker til kvantificering eller karakterisering af disse vesikler. De mest anvendte metoder til EV-identifikation er proteinspecifik immunblotting og proteomics for at bekræfte oprindelsen af EV'er, transmissionselektronmikroskopi (TEM) for at bekræfte deres struktur og nanopartikelsporingsanalyse (NTA) for at kvantificere deres antal og størrelsesfordeling i et prøvevolumen.
Ingen af disse teknikker alene giver dog alle de oplysninger, der kræves for at karakterisere EV-undergrupper. Elbilers iboende heterogenitet på grund af mangfoldigheden i deres biokemiske og fysiske egenskaber hindrer globale analyser, der er pålidelige og reproducerbare, især for elbiler indeholdt i en blanding (råprøve). Der er derfor behov for detektions- og karakteriseringsmetoder for elektriske køretøjer, både individuelt og generelt for at supplere andre metoder, der er hurtigere, men ikke selektive6.
Billeddannelse i høj opløsning ved hjælp af TEM (eller cryoTEM) eller AFM gør det muligt at bestemme morfologien og metrologien for elbiler med en nanometrisk opløsningpå 7,8,9,10,11,12. Den største begrænsning ved brugen af elektronmikroskopi til biologiske objekter, såsom elbiler, er imidlertid behovet for et vakuum for at udføre undersøgelsen, som kræver fiksering og dehydrering af prøven. En sådan forberedelse gør det vanskeligt at oversætte fra de observerede strukturer til EV-morfologien i opløsningen. For at undgå denne dehydrering af prøven er kryoTEM-teknikken den mest egnede til EV-karakterisering13. Det bruges i vid udstrækning til bestemmelse af elbilers ultrastruktur. Immunmærkning af vesikler med biofunktionaliserede guldnanopartikler gør det også muligt at identificere specifikke underpopulationer af EV'er og skelne dem fra andre partikler, der er til stede i en kompleks biologisk prøve. På grund af det lave antal elbiler, der analyseres ved elektronisk mikroskopi, er det imidlertid ofte vanskeligt at udføre en karakterisering, der er repræsentativ for en kompleks og heterogen prøve.
For at afsløre denne størrelsesheterogenitet foreslår International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) at analysere et tilstrækkeligt antal widefield-billeder, ledsaget af mindre billeder, til at afsløre individuelle elbiler med høj opløsning14. AFM er et alternativ til optiske tilgange og elektroniske diffraktionsteknikker til undersøgelse af elbiler. Denne teknik bruger en skarp spids, der holdes af en fleksibel udkragning, der scanner prøven deponeret på en understøtning, linje for linje, og justerer afstanden mellem spidsen og de elementer, der er til stede gennem en feedback-sløjfe. Dette gør det muligt at karakterisere prøvens topografi og indsamle morfomekaniske oplysninger15,16,17,18. EV'erne kan scannes af AFM enten efter at være blevet deponeret på et atomisk fladt substrat eller efter at være blevet fanget på et specifikt substrat, der er funktionaliseret af antistoffer, peptider eller aptamerer for at karakterisere de forskellige subpopulationer18,19. På grund af dets evne til at kvantificere og samtidig undersøge strukturen, biomekanikken og det membranøse biomolekylære indhold af EV'er i komplekse biologiske prøver uden behov for forbehandling, mærkning eller dehydrering, bruges AFM nu i stigende grad til at karakterisere elbiler på en fin og multiparametrisk måde under fysiologiske forhold for temperatur og medium.
Dette papir foreslår en metode ved hjælp af en kerneguldbiochip, der er i stand til at blive (bio) kemisk funktionaliseret i et multiplexet format. Dette substrat er hjørnestenen i en kraftfuld analytisk platform, der kombinerer biodetektion af EV-delmængder ved overfladeplasmonresonans, og når EV'erne er adsorberet/podet eller immunfanget på chippen, muliggør AFM den metrologiske og morfomekaniske karakterisering af EV'erne. Sammen med Raman-signaturen af EV-undergrupperne, der er fanget på chippen, muliggør denne analytiske platform kvalificering af de EV'er, der er til stede i biologiske prøver, på en etiketfri måde og uden behov for præanalytiske trin. Dette papir viser, at kombinationen af kraftfulde teknikker, assisteret af en meget streng metode til substratforberedelse og dataindsamling, gør EV-analysen dyb, definitiv og robust.
Princippet i den foreslåede tilgang er at forberede et guldsubstrat, at adsorbere/pode eller fange EV-undertyperne og at scanne dem ved hjælp af AFM for at estimere størrelsen og morfologien af hver EV-delmængde. Derudover analyseres disse adsorberede elbiler ved Raman-spektroskopi. Dette substrat kan faktisk præsentere tre typer grænseflader af voksende kompleksitet: nøgne, kemisk funktionaliserede eller ligandmikroarrays. Før de forskellige trin i protokollen beskrives, henvises læserne til den skematiske præsentation af den nanobioanalytiske platform (NBA) tilgang i figur 1, der kombinerer overfladeplasmonresonansbilleddannelse (SPRi), AFM og spektroskopi.
Figur 1: Den nanobioanalytiske platform. Fremgangsmåden kombinerer (A) overfladeplasmonresonansbilleddannelse, (B) atomkraftmikroskopi og infrarød / Raman (nano) spektroskopi, alle involveret på det samme substrat - en multiplekset guldchip. Forkortelser: NBA = NanoBioAnalytical platform; SPRi = billeddannelse af overfladeplasmonresonans; AFM = atomkraftmikroskopi; EV = ekstracellulær vesikel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Kerneguldbiochippen udgør hjertet i platformen, da alle de etiketfrie karakteriseringsteknikker udføres på denne biochip. I henhold til behovene for EV-karakterisering (enten globale / samlede EV'er eller EV-delmængder) og begrænsningerne / kravene til de anvendte metoder er der udviklet tre typer guldbiochipoverflader: enten "nøgne", kemisk funktionaliserede "C11 / C16" eller ligand-biofunktionelle, kaldet "ligand" guldoverflade.
Den nøgne biochip, kaldet "naked", muliggør simpel adsorption af elbiler på guld. Det er muligt at vælge den anvendte buffer og realisere denne adsorption enten på en passiv måde (inkubation og derefter skylletrin) eller at overvåge den under flow (i SPRi). Desuden kan denne passive adsorption realiseres enten på hele chippen (som et makroarray) eller lokaliseret i mikroarrays ved hjælp af en mikropipettespotter. "Under flow-proceduren" gør det muligt for efterforskere at følge kinetikken og niveauet af EV-adsorption. Denne fremgangsmåde på det nøgne guldsubstrat anvendes, når grænsefladen mellem det kemiske lag kan interferere med analysemetoden (f.eks. til Raman-spektroskopi).
Den kemisk funktionaliserede biochip, kaldet "C11/C16", bruges til at skabe et tæt og robust "tæppe" af elbiler, der er kovalent bundet på guldoverfladen ved at danne primære amidbindinger med thiolaterne, når målet er at få et globalt overblik over EV-prøven. Faktisk er guldet i dette tilfælde funktionaliseret af en thiolatblanding af mercapto-1-undecanol (11-MUOH: "C11") og mercapto-1-hexadecansyre (16-MHA: "C16"), og en brøkdel af thiolaterne aktiveres kemisk for at etablere kovalent binding med målene. Igen kan denne strategi realiseres enten passivt (inkubation og derefter skylletrin, enten i "macroarray" eller i flere mikroarrays ved hjælp af en mikropipettespotter) eller under strømningshastigheder (i SPRi) for at følge kinetikken og niveauet af EV-podning på guldoverfladen.
Den ligand-biofunktionaliserede biochip, kaldet "ligander", aktiveres kemisk til kovalent podning af forskellige ligander (f.eks. Antistoffer, receptorer) for selektivt at fange (med affinitet) forskellige EV-undergrupper, der sameksisterer i den biologiske prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af guldsubstrat
BEMÆRK: Tre typer overflader produceres på guldflis: 1) nøgen overflade, 2) kemisk funktionaliseret og 3) biofunktionaliseret (ligander podet på C11C16-lag). De vil blive kaldt henholdsvis "nøgne", "C11C16" og "ligander" fra dette tidspunkt og fremefter.
- Forberedelse af guldsubstrat:
BEMÆRK: Til denne protokol blev guldbiochipsene fremstillet internt i renrummet. De hjemmelavede biochips var sammensat af glasglas (SF11) med en belægning af krom (2 nm Cr) og guld (48 nm Au). Biochipens længde var 28 mm, bredden var 12, 5 mm, og tykkelsen var 0, 5 mm20.- Brug DC magnetron sputtering15 til at belægge diasene ved fysisk dampaflejring (PVD).
- Kemisk funktionalisering:
- Funktionaliser de nøgne chips ved at inkubere dem natten over i en 90% / 10% mol blanding af mercapto-1-undecanol (11-MUOH: C11) og mercapto-1-hexadecansyre (16-MHA: C16) ved 1 mM i absolut ethanol, under omrøring og ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Dette trin danner et stabilt, selvmonteret monolag (SAM), som er nyttigt til podning af liganderne. - Rengør biochippen (vask forsigtigt) med absolut ethanol og ultrarent vand, tør den under nitrogen, og opbevar den under renrumsforhold.
- Aktivering af den kemisk funktionaliserede biochip:
BEMÆRK: Fra dette trin skal forsøgene udføres i et analytisk laboratorium.- Rengør biochippen med ultrarent vand ved forsigtigt at vaske den, og tør derefter chippen under let luftstrøm. For at aktivere C16-carboxylgrupperne inkuberes biochippen i en blanding af 200 mM ethyl (dimethylaminopropyl) carbodiimid/N-hydroxysuccinimid (EDC) og 50 mmol / L N-hydroxysuccinimid (Sulfo-NHS) i mindst 30 minutter i mørke ved stuetemperatur. Skyl derefter med vand inden podningsforsøgene.
- Funktionaliser de nøgne chips ved at inkubere dem natten over i en 90% / 10% mol blanding af mercapto-1-undecanol (11-MUOH: C11) og mercapto-1-hexadecansyre (16-MHA: C16) ved 1 mM i absolut ethanol, under omrøring og ved stuetemperatur.
- Podning af liganderne på den funktionaliserede biochip:
BEMÆRK: Immobiliseringen af liganderne (eller EV'erne til nogle eksperimenter) på chippen kan enten udføres passivt uden for SPRi-instrumentet (inkubation af et fald på den aktiverede chip) eller dynamisk underflow i SPRi-instrumentet. Dette udgør EV - eller ligandmodificerede chips. Figur 2 viser guldbiochippen, mikropipettespotteren og biochippen efter at have spottet med 16 liganddråber på 300 nL hver.- Til ligandpodning skal du bruge molekyler såsom antistoffer (f.eks. immunoglobuliner-antiCD41 [specifikke for EV'er afledt af indfødte blodplader, kaldet N-PEV'er], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 og antiOVA [kontrolantistof mod ovalbumin]) og Annexin V. Fortynd dem ved 200 μg / ml i en sur opløsning (fra pH 4,5 til 6 afhængigt af den optimale pH for ligandaktivitet eller funktion).
BEMÆRK: Den optimale pH for podningsantistoffer blev tidligere bestemt ved prækoncentrationsforsøg udført på et SPR-instrument til bestemmelse af den optimale pH til ligandpodning (se figur 3). Da podningsbetingelserne ændres med kloner af antistoffer, der anvendes, anbefales det at bestemme disse betingelser, før du fortsætter med SPRi-eksperimenterne. - Til podningsproceduren tilsættes 300 nL EV'er/ligandopløsning ved hjælp af spotteren.
BEMÆRK: Et stykke papir nedsænket i vand skal opbevares i både venstre og højre brønd for at undgå fordampning af dråber. Dette trin er vigtigt for at opretholde elbilerne/liganderne under optimale betingelser for stabilitet og funktionalitet. - Efter spotting skal du opbevare biochippen under et sonisk bad (frekvens: 37 kHz, effekt: 30%) i en 30 minutters inkubation. Vask biochippen ovenfra med ultrarent vand, og læg den forsigtigt på et prisme med samme brydningsindeks (RI) som biochippen. Mens du justerer biochippen på toppen af prismet, tilsættes en dråbe (~ 2,3 μL) olie med samme RI som prismet for at skabe et ensartet, tyndt lag mellem biochippen og prismet.
BEMÆRK: Dette trin sikrer et kontinuerligt medium med samme RI i den optiske sti. Det er vigtigt at undgå at inkorporere bobler i olielaget på dette trin, da dette vil ændre de optiske egenskaber i stien og hindre yderligere analyse.
- Til ligandpodning skal du bruge molekyler såsom antistoffer (f.eks. immunoglobuliner-antiCD41 [specifikke for EV'er afledt af indfødte blodplader, kaldet N-PEV'er], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 og antiOVA [kontrolantistof mod ovalbumin]) og Annexin V. Fortynd dem ved 200 μg / ml i en sur opløsning (fra pH 4,5 til 6 afhængigt af den optimale pH for ligandaktivitet eller funktion).
Figur 2: Biochip og manuel spotter. Guldbiochip (venstre), mikropipettespotter (midten) og biochippen efter spotting med liganddråber på 300 nL hver (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Prækoncentrationstest til bestemmelse af den optimale pH til ligandpodning. Sensorgrammet præsenterer interaktionsniveauet som en funktion af tiden for en ligand injiceret tilfældigt (ved forskellige pH-værdier) i samme koncentration over 2 min på overfladen. OG er vaskemidlet, som gør det muligt at genvinde baseline mellem hver injektion. Her indikerer sensorgrammet, at pH 6 tillod mest ligandpodning med et SPRi-signal på 1091 RU. Forkortelser: OG = octylglucosid; RU = reaktionsenhed. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Billeddannelse af overfladeplasmonresonans
- Monter biochippen på SPRi-systemet. Hold strømningshastigheden for PBS-bufferen (løbende buffer) på 50 μL/min.
BEMÆRK: Hvis der er bobler, skal du øge strømningshastigheden op til 500-1.000 μL / min og injicere 40 mM octylglucosid (OG) ofte for at fjerne dem så hurtigt som muligt. - Konditionering af guldbiochippen i SPRi-instrumentet: Valg af arbejdsvinkler
- Klik på rullemenuen i venstre side af softwaren, og klik på arbejdsmappen for at definere den mappe, hvor de eksperimentelle data skal gemmes. Klik derefter på Plasmon | Erhvervelse af billeder.
- Find billedet (som vist i figur 4A), hvor forskellige pletter er synlige, og klik for at vælge dette billede. For at definere interesseområdet (ROI), som vist i figur 4, skal du enten klikke på automatisk detektion eller manuel definition inde i pletterne (figur 4B) eller på chippen for at henvise til en bestemt placering, selv uden pletter (figur 4C).
- Når multipleksede biochips anvendes, skal du skrive navnet på ligandfamilierne og derefter klikke på de tilsvarende pletter.
BEMÆRK: En ligandfamilie svarer til flere pletter funktionaliseret med samme ligand. Normalt præsenterer chippen mindst duplikater og endda ofte tredobler af hver ligand. - Klik på finish artsdefinition og vent på at blive dirigeret til vinduet, der indeholder de opnåede plasmonkurver.
- Vælg en arbejdsvinkel. Træk den sorte linje med markøren til den optimale arbejdsvinkel, og klik på Flyt spejl til arbejdsvinkel.
BEMÆRK: Plasmonkurven består af værdien af reflektionsevnen (%) versus vinklen, og softwaren giver en anden kurve med værdien af hældningen (%) versus vinklen. For at vælge en god arbejdsvinkel skal du vælge vinklen med hældningens højeste værdi.- I tilfælde af et passiverende trin (på grund af albumin) udført inde i apparatet skal du vælge en arbejdsvinkel for at opnå den optimale følsomhed over for overfladen og dermed etablere en kvalitetskontrol af overfladereaktiviteten.
BEMÆRK: Dette passiveringstrin er vigtigt, når chippen er forberedt til affinitet/indfangningsbiodetektion for at reducere uspecifikke interaktioner mellem prøven og biochippens overflade.
- I tilfælde af et passiverende trin (på grund af albumin) udført inde i apparatet skal du vælge en arbejdsvinkel for at opnå den optimale følsomhed over for overfladen og dermed etablere en kvalitetskontrol af overfladereaktiviteten.
- Klik på Kinetik for at starte kinetisk overvågning i realtid. Når softwaren beder brugeren om at definere den negative kontrol, skal du vælge ingen negativ kontrol på dette tidspunkt (da dette giver mulighed for observation af kinetikken på de negative kontrolpunkter).
- Injicer rotteserumalbumin (RSA, 200 μg/ml, fremstillet i acetatbuffer, pH 4,5) ved 50 μL/min i 4 minutter for at passivere overfladen omkring pletterne og eventuelt udfylde tomme rum inde i ligandpletterne.
BEMÆRK: RSA injiceres for at dække biochippen, som ikke er bundet til nogen ligander. - Ethanolamin (1 M) injiceres ved 20 μL/min i 10 minutter for at deaktivere de carboxylgrupper, der stadig er til stede og reaktive på overfladen.
- Biochippen vaskes ved at injicere 40 mM OG ved 50 μL/ min i 4 min.
BEMÆRK: Efter passiveringstrinnet justeres arbejdsvinklen (som en ny baselinebestemmelse før prøveinjektion) for at være ved den højeste følsomhed på de relevante pletter.
- Injicer rotteserumalbumin (RSA, 200 μg/ml, fremstillet i acetatbuffer, pH 4,5) ved 50 μL/min i 4 minutter for at passivere overfladen omkring pletterne og eventuelt udfylde tomme rum inde i ligandpletterne.
- Injektion af prøve:
- Omdefiner plasmonkurverne efter passivering, og vælg arbejdsvinklen i henhold til liganden denne gang.
- Ved kinetisk overvågning reduceres strømningshastigheden til 20 μL/min, og der ventes på, at basislinjen er stabil.
- Injicer prøven i en valgfri koncentration (fra 1 x 10 8 EV'er/ml til 1 x 1010 EV'er/ml afhængigt af affiniteten mellem elbilerne og de podede ligander), og klik på enten manuel indsprøjtning eller automatisk indsprøjtning. I tilfælde af manuel injektion skal du efter injektion af 200 μL af prøven klikke på stop injektionen. Da injektionens varighed generelt er 10 min, skal du begynde med at følge interaktionens kinetik og måle reflektionsvariationen ved at beregne forskellen i reflektionsevnen mellem start og slut af injektionen, der blev observeret under den kinetiske overvågning (figur 5).
BEMÆRK: De forskellige prøver, der blev injiceret, er beskrevet i afsnittet om repræsentative resultater.
- Efter injektion af prøve skal du følge en af disse to fremgangsmåder for at afslutte SPRi-eksperimentet:
- I den ikke-fikserede/flydende tilgang tages biochippen ud af SPRi-apparatet, tilsættes en væskedråbe på den, og der fortsættes med yderligere AFM-karakterisering af overfladen i væske.
- I den faste tilgang injiceres glutaraldehyd (0,5%) fortyndet i vand ved 20 μL / min i 10 minutter for at fiksere molekylerne fanget på biochippen. Injicer vand for at skylle overfladen, tag biochippen ud, vask den meget forsigtigt med destilleret vand og lufttør den for at blive analyseret yderligere under AFM.
Figur 4: SPRi CCD-billede af biochippen. (A,B) Multiplexed biochip efter albuminpassivering. (A) En chip uden misligholdelse; (B) nogle fejl, der opstod på chippen: sammensmeltning af pletter (i), svag podning (ii) eller støv eller "forurenende stoffer" (iii). ROI'erne, i farve i pletterne (en farve pr. Ligandfamilie), blev valgt for at undgå disse "forurenende stoffer". Når pletter fusionerede, blev de noteret og enten ignoreret eller navngivet som "blanding af ligander 1 og 2". (C) Nøgen guldchip uden mikroarrays til forsøget med at undersøge adsorption af elbiler på guld. Den blå pil angiver strømningsretningen. Denne chip præsenterede ikke pletter, og ROI'erne blev valgt til at registrere reflektionssignalet fra linje 1 (L1, røde cirkler) til linje 4 (L4, lilla cirkler) under prøveinjektionen. Skalabjælke = 1 mm for alle tre billeder. Forkortelser: SPRi = overfladeplasmonresonansbilleddannelse; CCD = ladningskoblet enhed; ROI'er = interesseregioner EV'er = ekstracellulære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: SPRi-forsøg med EV-injektion på en biochip. (A) Optag eksperiment på en multiplekset biochip, der viser reflektionssignalerne for forskellige ligander. Her var signal-støj-forholdet for de forskellige ligander meget godt (og især på antiCD41-pletterne), da responsen fra den negative kontrol var ubetydelig. (B) Adsorptionsforsøg med elektriske køretøjer på en nøgen biochip. Sensorgram, der viser konditioneringen af chippen med to skylninger af buffer og OG-rengøring (1), med EV-prøveinjektion (2) og reflektionssignalet efter EV-interaktion (3). På denne biochip var der ingen negativ kontrol, men reflektionssignalet (dets kinetik, dets stabilitet efter injektion) var højt, hvilket betyder, at disse elbiler var i stand til at adsorbere og forblive stabile på guldchippen. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikel; OG = octylglucosid. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Atomkraftmikroskopi
- Brug kontakttilstanden til at scanne biochippen i luft og den kvantitative billeddannelsestilstand til at scanne biochippen under flydende forhold.
- Juster biochippen øverst på masken på glasglasset (udviklet i laboratoriet) for at identificere placeringen af de respektive mikropletter på biochippen (figur 6A).
BEMÆRK: Masken indeholder markeringerne af pletterne, som svarer til positionerne af ligandernes pletter i henhold til den anvendte spotter. Denne maske består af et glasglas, hvorpå to vinkelrette kiler muliggør placeringen af chippen. Desuden er glasobjektet markeret med 16 filtprikker svarende til spotlokaliseringen på chippen, hvilket ved gennemsigtighed gør det muligt at lokalisere pletterne og scanne det ønskede område. - Placering af spidsen:
- Brug et CCD-kamera oven på AFM til at lokalisere udkragningen på det rigtige sted, der skal scannes. For at følge denne protokol skal du bruge trekantede udkragninger med en længde på 200 μm, en bredde på 28 μm og en fjederkonstant på 0,08 N/m.
- Juster laseren på toppen af udkragningen i en position, der giver optimal respons i feedback-kontrolmekanismen.
- Scanning:
- Når den er aktiveret og i kontakt med biochippens overflade, skal du starte AFM-anskaffelsen i kontakttilstand eller i kvantitativ billeddannelsestilstand fra tre til fem store områder (typisk 10 × 10 μm²) til små områder (1 x 1 μm²).
BEMÆRK: En repræsentation af de forskellige områder, der kan scannes, er vist i figur 6D. Sørg for, at AFM-karakteriseringen er repræsentativ for hele mm²-punktet, og at nok elbiler visualiseres i en god opløsning til en robust analyse (mindst 300 elbiler tælles og analyseres for hver tilstand), og udfør metrologi- og morfologimålingerne.
- Når den er aktiveret og i kontakt med biochippens overflade, skal du starte AFM-anskaffelsen i kontakttilstand eller i kvantitativ billeddannelsestilstand fra tre til fem store områder (typisk 10 × 10 μm²) til små områder (1 x 1 μm²).
- AFM billedbehandling:
- Behandl AFM-billederne med JPK-databehandlingssoftware ved først at vælge højdekanalen.
- Vælg et polynomium, der skal trækkes fra hver linje for at opnå rettede scanningslinjer.
- Vælg højdetærsklen på guldkorn for at fjerne overfladens ruhed. I den refererede software (se materialetabellen) inden for kornekstraktionsmodulet skal du markere kornene ved hjælp af en højdetærskelværdi ved 8,5 nm. Når kornene er filtreret, vises antallet af korn .
BEMÆRK: Normalt kræver det grove guldsubstrat (RMS på ~ 3 nm) og tilstedeværelsen af de kemiske lag og ligandlagene, at tærsklen indstilles til 8,5 nm. - Hvis du vil udtrække flere egenskaber for de markerede korn, f.eks. højde, volumen og diameter, skal du åbne billedet i den software, der refereres til, og vælge databehandling | Korn | Marker efter tærskel.
- Vælg filterkorn i funktionen af egenskaber. Når et nyt vindue vises, skal du vælge følgende parametre: Værdi = maksimum z-max, Surface = projiceret overflade A0. Vælg derefter kriterierne A OG B.
- Åben kornfordeling; I det vindue, der vises, skal du vælge Værdi (maksimum), Lydstyrke (base: nul) og Ramme (længde). Hold øje med tabellen (i .txt format), der vises, og som viser tre kolonner med højde-, volumen- og diameterværdier for alle de korn, der er registreret ved den indstillede tærskel pr. billede.
- Fra højden, h og diameteren, D, beregnes krumningsradius, Rc, for hver EV ved hjælp af ligning (1)8, og derefter beregnes volumenet, V, ved hjælp af ligning (2):
(1)
(2) - Fra V beregnes den effektive diameter, d eff, for hver EV (diameteren af en kugle med samme volumen) ved hjælp af ligning (3):
(3) - Afbildningsgrafer, der viser størrelserne (målt højde, målt diameter og beregnet effektiv diameter) af elbilerne, hvor hver talt partikel er repræsenteret af en prik.
BEMÆRK: I slutningen af karakteriseringen muliggør NBA-platformen således korrelationen mellem biodetektionssignalet og derefter fænotypningen med antallet og størrelserne af EV-undergrupperne.
(1)
(2)
(3)
Figur 6: Biochipkarakterisering af AFM. Efter SPRi-eksperimentet blev chippen enten fikseret og tørret eller vedligeholdt i væske til AFM-karakterisering. (A) Det bearbejdede glasglas (med to vinkelrette positionskiler, angivet med et "w" på billedet), der præsenterer en maske, der passer til lokaliseringen af de 16 biochipmikroarrays. Ved lyseksponering og gennemsigtighed, når det er installeret til AFM-karakteriseringen, gør glasglideren det muligt at placere AFM-spidsen på det ønskede sted for at karakterisere den. (B) Biochippen installeret på "maske" dias og under en dråbe buffer til scanning under flydende forhold. (C) SPRi-billede af de 16 mikroarrays. (D) Et mikroarray afbildet ved optisk mikroskopi efter immunindfangning af biofunktionaliserede kalibreringsnanopartikler med en diameter på 920 nm. De hvide firkanter angiver prøveudtagningen af de forskellige områder, der er scannet af AFM på hvert sted af interesse for at gøre AFM-karakteriseringen robust. Skalastænger = (C) 1 mm, (D) 500 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; SPRi = billeddannelse af overfladeplasmonresonans. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Raman-spektroskopi
BEMÆRK: For Raman-spektroskopi skal du udskifte glasglasset, der bruges som substrat, med et dias af CaF2, som har en ubetydelig Raman-signatur.
- Optiske betingelser for erhvervelsen:
- Indstil følgende betingelser for Raman-billedmikroskopet: mikroskopmål: 50x; laserbølgelængde: 532 nm; lasereffekt: 10 mW; eksponeringstid: 500 ms; antal akkumuleringer: 140; spektralområde: fra 450 cm-1 til 3.200 cm-1.
BEMÆRK: Brug af for meget strøm og/eller for lang anskaffelsestid kan føre til beskadigelse af prøven, hvilket fremgår af ustabile spektre over tid. Start med en lav mængde energi og øg denne, hvis signalet er for svagt. Højere laserbølgelængder kan bruges (633 nm, 785 nm) til at reducere fluorescensen, der er skadelig for Raman-målinger. Intensiteten falder imidlertid med bølgelængdens fjerde effekt, og kameraets spektrale følsomhed bør overvejes.
- Indstil følgende betingelser for Raman-billedmikroskopet: mikroskopmål: 50x; laserbølgelængde: 532 nm; lasereffekt: 10 mW; eksponeringstid: 500 ms; antal akkumuleringer: 140; spektralområde: fra 450 cm-1 til 3.200 cm-1.
- Raman billeddannelse:
- Først skal du observere live-spektrene med et reduceret antal akkumuleringer (10) for at finde området med det bedste signal-støj-forhold.
BEMÆRK: Et stærkt signal i højfrekvensområdet (2.800-3.000 cm−1) kan lette detekteringen af elbiler på overfladen med lave eksponeringstider, som tidligere vist10. - Når ROI er valgt, skal du vælge den rumlige opløsning i henhold til den tid, der er til rådighed for erhvervelsen.
BEMÆRK: Den rumlige opløsning er begrænset af diffraktionsgrænsen (~ 500 nm). - Start anskaffelsen af Raman-kortlægningen.
- Først skal du observere live-spektrene med et reduceret antal akkumuleringer (10) for at finde området med det bedste signal-støj-forhold.
- Forbehandling af data:
- Brug et Python integreret udviklingsmiljø (IDE) (f.eks. Spyder) til at åbne filen, der indeholder spektrene.
- Træk spektrenes basislinje fra for at korrigere for interferens fra mulig fluorescens. Brug for eksempel funktionen "arpls" fra pakken "irfpy"23. Test forskellige værdier af parameteren "lam" for at finde den, der giver den bedste baselinekorrektion (normalt mellem 10,3 og 10,7).
- Normaliser spektrene, for eksempel ved at dividere alle intensiteterne af et spektrum med dets intensitet ved 2.900 cm-1 eller ved at trække gennemsnittet af spektret og derefter dividere det med dets standardafvigelse ("standard normal variat" normalisering).
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at sammenligne den relative molekylære sammensætning af elbiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestemmelse af de optimale pH-betingelser for ligandpodning
De forskellige ligander, der anvendes til fremstilling af biochips, testes som en funktion af pH og deres tilgængelighed til at interagere med det thiolatkemiske lag (figur 3). Liganderne fortyndes i acetatbuffer ved forskellige pH-værdier og injiceres på biochippen, der er kemisk funktionaliseret med et C11C16-lag. Opløsningerne injiceres tilfældigt på overfladen, og et vaskemiddel (OG ved 40 mM) injiceres efter hver ligandinjektion for at genvinde basislinjen. Denne prækoncentrationstest gør det muligt at bestemme den optimale pH for hver ligandpodning. I eksemplet præsenteret i figur 3 blev en pH på 6 valgt som den bedste pH med hensyn til hældningen og niveauet af ligandpodning.
SPRi CCD-billeder
SPRi CCD-billederne, der er registreret på biochippen (nøgne, kemisk funktionaliserede eller præsenterer mikroarrays) efter indsættelse i SPRi-maskinen, er vist i figur 4. I tilfælde af den mikroarray-præsenterende biochip blev billedet taget efter albuminpassivering af overfladen. Duplikater eller tredoblinger af pletter blev systematisk realiseret på chippen, og en negativ kontrol var automatisk også til stede på chippen. Den negative kontrol bestod hovedsageligt af et irrelevant antistof. I SPRi, når biochippen blev brugt uden spotting - til adsorption på nøgent guld eller til direkte podning af elbiler på en kemisk funktionaliseret biochip - blev ROI'erne valgt vilkårligt i sensorområdet. Som et eksempel viser figur 4C ROI'er valgt på en nøgen guldchip før injektion af elbiler.
Takket være dette SPRi CCD-billede er det muligt at ignorere visse pletter, hvis sådanne problemer opstår under podningen. SPRi CCD-billedet tillader også estimering af homogeniteten af podningen inde i stedet, sikrer reproducerbarheden af podningen mellem forskellige pletter af samme ligand og sikrer endelig, at EV-biodetektionen fortsætter på arrays, der er ækvivalente med hensyn til overfladetæthed.
SPRi resultater
Når ROI'erne vælges, er baseline stabil, hvilket betyder, at prøven kan injiceres. Figur 5 viser forskellige resultater opnået på en multiplekset biochip, der afslører et højt signal-støj-forhold for visse immunoarrays (reflektionssignalet er 1,4% på antiCD41 sammenlignet med responsen på den negative kontrol på 0,02%). Figur 5B viser resultaterne for EV-adsorption opnået efter injektion af EV-prøven på en nøgen guldchip. N-PEV-prøven var fra blodplader. Opløsningen blev centrifugeret ved 3.000 × g i 15 minutter ved 22 °C; Supernatanten blev derefter centrifugeret igen ved 20 000 × g i 15 minutter ved 22 °C. Den resulterende pellet blev resuspenderet i bufferen. Disse SPRi-resultater opnået på immunfangede N-PEV'er blev sammenlignet med Western blot (WB) resultaterne. WB afslørede et stærkt udtryk for CD41, CD62P og CD9 i disse prøver, hvilket fremhævede en god sammenhæng med SPRi-resultaterne (supplerende figur S1).
Figur 5B viser resultaterne for EV-adsorption opnået efter injektion af EV-prøven fra humane primære brystepitelceller (HMEC'er) på en nøgen guldchip. HMEC-cellekulturen blev centrifugeret ved 3.650 × g i 10 minutter, og derefter blev supernatanten centrifugeret igen ved 10.000 × g i 30 minutter ved 4 °C. Den resulterende pellet blev resuspenderet i 1x PBS-buffer for at vaske den, og centrifugering blev udført igen ved 10.000 × g i 30 minutter ved 4 °C. Endelig blev pelleten suspenderet i 1x PBS-buffer.
AFM karakterisering
Efter SPRi-eksperimenterne og EV-indlæsning på biochipsene (enten ved adsorption, podning eller affinitetsoptagelse) blev AFM udført ved at følge metoden til at scanne store scanninger (10 x 10 μm²) og derefter (~ 10 mindst) mindre (et par μm²). Figur 7 viser eksempler på store og små AFM-billeder af elbiler på biochips.
Figur 7: AFM-karakterisering af elbiler på en biochip. Billeder opnået i kontakttilstand af en tørret prøve. (A) Et eksempel på et stort scanningsområde for at give et repræsentativt billede af mm² ROI på chippen. Dette resultat blev opnået efter kovalent podning af elbiler på en kemisk modificeret overflade. (B) Et andet eksempel på et stort scanningsområde opnået efter optagelse af EV'er på immunoarrays. (C) Et nærmere billede af objekterne for at få høj opløsning og muliggøre metrologi (i højde og diameter) af elbiler. (D) Et nærmere billede af biochippen i billedet i (A) med et 3D-vippet billede. (E) Et zoomet billede af en stor EV adsorberet på en nøgen guldbiochip i et vippet 3D-billede. Z-skalaen er (A, B) 30 nm og (C) 20 nm. Skalastænger = (A, B) 2 μm, (C) 500 nm. Forkortelser: AFM = Atomic Force Microscopy; EV'er = ekstracellulære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Gwyddion analyse
Gwyddion-software blev brugt til at behandle dataene for hver vesikel, der blev visualiseret på hvert parti AFM-billeder. Først blev et stort område (i området 10 x 10 μm²), der viser en repræsentativ visning af mm² ROI på chippen, scannet. Billedet i figur 7A viser, at overfladen var tæt dækket af genstande. I dette tilfælde blev elbilerne (fra komælk) injiceret ved 2,5 × 1010 / ml på en aktiveret thiolfunktionaliseret chip. Efter eliminering af kasein fra prøven blev vallesupernatanterne koncentreret ved centrifugering ved 4.000 × g og 20 °C ved hjælp af Amicon 100 kDa centrifugalfilterenheder, og EV'erne blev isoleret ved hjælp af ultracentrifugeringsmetoden med saccharosegradient. Dette resultat svarer til kovalent podede elbiler på en kemisk modificeret overflade. Figur 7B viser et andet eksempel på et stort scanningsområde opnået efter indfangning af elbiler på immunarrays. Også her var objekter til stede på overfladen, men viste en mindre tæt dækning, end da elbilerne blev podet kovalent på chippen. Et nærmere billede i figur 7C flere steder i investeringsafkastet muliggør høj opløsning og metrologi (i højde og diameter) af elbiler. Et andet nærmere billede (figur 7D) af biochippen vist i figur 7A med et 3D-vippet billede afslører objekter, der er vesikler, men også filamentøse (øverst til venstre). Faktisk, mens immunchips muliggør selektiv og differentiel indfangning af EV-undergrupper, poder kovalent podning alle objekter med frie amingrupper, der er til stede i prøven. I figur 7E afslører AFM en enkelt stor EV fra HMEC-kulturen adsorberet på nøgent guld. Således er AFM i stand til at afsløre små til store elbiler og måle dem og hjælper med at tælle antallet af objekter pr. mm² ved at tillade visualisering af hver EV.
Den målte højde og diameter for hver EV blev bestemt, hvorfra den effektive diameter blev opnået. EV-højderne dækkede et område fra 10 nm til 50 nm med et gennemsnit på 15 nm; de målte EV-diametre dækkede et område fra 50 nm til 300 nm med et gennemsnit på 100 nm. Vi observerede, at elbilernes effektive diameter varierede fra 30 nm til 300 nm, med et stort flertal omkring 60 nm (figur 8A). Disse målinger blev foretaget i væske eller efter fiksering og tørring. Figur 8B viser, at resultaterne opnået under disse to betingelser var sammenlignelige.
Figur 8: Resultater genereret af AFM-karakteriseringen af elbiler på en biochip. (A) Metrologi af elektriske køretøjer på ét sted (antiCD41-immunoarray), bestemt med en tærskelværdi på 8,5 nm og efter injektion af en EV-prøve ved 2,5 ×10 10/ml. Den "effektive beregnede diameter" præsenteres, hvor hver prik svarer til en partikel visualiseres på AFM-billederne. B) Histogram genereret ud fra dataene i punkt A, der viser fordelingen af EV'ernes effektive diameter. Resultater opnået i luft (i rødt: prøven fikseret og tørret) og i væske (i blåt: ufastgjort). Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; EV'er = ekstracellulære vesikler . Klik her for at se en større version af denne figur.
N-PEV-analysen fra AFM blev sammenlignet med NTA-resultaterne. De sidste "in-solution" resultater, af NTA, viste en fordeling af EV diametre fra 32 nm til 650 nm, med et stort flertal mellem 90 nm og 250 nm i diameter. Under hensyntagen til, at NTA ikke er følsom for små størrelser (tæt på 50 nm), viser disse AFM-målinger således god korrelation med disse resultater (supplerende figur S2).
Raman-eksperimenterne, som blev realiseret på elbiler adsorberet på en nøgen chip, afslørede opmuntrende resultater; specifikt blev der opnået et klart spektrum af elbilerne (figur 9). Raman-spektre kan opdeles i tre forskellige områder: "fingeraftryk" -regionen (under 1.800 cm-1), som indeholder toppe, der danner molekylærspecifikke mønstre og dermed er den vigtigste del til identifikationsformål; den "bio-tavse" region (1.800-2.800 cm-1), som normalt kasseres, når man studerer biologiske prøver, da den ikke indeholder toppe; og området "højfrekvenser", som hovedsageligt indeholder information om lipider og ofte er den mest intense del af spektret, men er mindre specifik. Spektret viser toppe, der hovedsageligt svarer tilCH2-vibrationer (2.853 cm-1, 1.444 cm-1 og 130 cm-1), som er forbundet med lipiderne i EV-membranen og en top svarende til phenylalaninaminosyren21. En Raman peak tildelingstabel over almindelige molekyler til stede i EV'er kan findes i papiret af Penders et al.22.
Figur 9: Ramanspektroskopikarakterisering af elbiler på en biochip. Her blev EV-prøven afledt af en HMEC-kultur og genvundet ved centrifugering ved 20.000 × g. (A) Eksempel på et Raman-billede af elbiler adsorberet på en nøgen biochip (gennemsnitlig intensitet), overlejret på et brightfield-billede. (B) Eksempel på målte Raman-spektre af elektriske køretøjer. De stiplede linjer svarer til identificerede vibrationer. α, scissoring; τ, vridning; υ, strækning (s, symmetrisk; som, asymmetrisk). Skalabjælke = (A) 50 μm. Forkortelser: EV'er = ekstracellulære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Nanopartikelsporingsanalyse (NTA) målinger af N-PEV'er. Elbilerne blev fortyndet i PBS; eksperimenterne blev udført i tre eksemplarer ved hjælp af et MALVERN-instrument NS300. Gennemsnitlig diameter = 137,5 nm ± 1,3 nm; Mode diameter = 104,9 nm ± 13,3 nm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Western blot-assays af N-PEV'er. N-PEV'er (1) og (2) svarer til to batcher af N-PEV'er fremstillet af to trombocytkoncentratlommer. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De seneste metoder til EV-identifikation, der er mest anvendt, er proteinspecifik immunblotting for at bekræfte oprindelsen af EV'er, TEM for at bekræfte deres struktur og NTA for at kvantificere deres antal og størrelsesfordeling i et prøvevolumen3. Ikke desto mindre har den store interesse for elbiler i (bio)medicinsk forskning og begrænsningerne i eksisterende analytiske værktøjer fået det videnskabelige samfund til at udvikle nye metoder til karakterisering, diskrimination og kvantificering af elbiler.
De fleste udviklinger fokuserer på at kombinere principperne for immunmærkning eller immunindfangning med avancerede fysiske metoder til EV-detektion. Nogle af disse tilgange fokuserer på identifikation af individuelle elbiler for at opnå maksimalt pålidelige data på nanoobjektskala. Andre er mere optaget af at foreslå globale metoder, der er overkommelige og pålidelige til klinisk brug.
NBA-platformen, der kombinerer biodetektion af elbiler på et multiplekset guldsubstrat og AFM-karakterisering, muliggør dyb kvalificering af nanovesiklerne, der findes i komplekse biologiske væsker. På grund af biochipens selektivitet kan råprøver injiceres, og vesikelbidraget kan fremhæves.
Den foreslåede fremgangsmåde består i karakterisering af elbiler, der adsorberes/podes eller fanges ved affinitet på et groft guldsubstrat. AFM, som traditionelt anvendes på atomisk flade substrater, viser stadig optimal ydeevne på den ru guldchip, hvilket afslører forskellige grænseflader, der er mikro / nanostrukturerede.
Den multipleksede biochip, der præsenterer flere steder at scanne (op til 16 indtil nu) og NBA-tilgangen til faste og tørrede prøver blev udviklet for at reducere den tid, der er nødvendig for en dyb og meget løst AFM-undersøgelse af hvert sted. Forskellige tests udført i laboratoriet viste, at denne procedure (fiksering, tørring og billeddannelse i luft) ikke påvirker metrologien af elbiler signifikant.
Der er to vigtige kritiske trin i tilgangen: at finde et kompromis for at vælge den bedste spånfølsomhed for alle de forskellige podede ligander og EV-dissociation fra substratet i slutningen efter injektion. Her blev der anvendt en SPRi-maskine, der arbejdede med en enkelt resonansvinkel, hvilket indikerer, at det bedste kompromis i plasmonrespons for alle ligandpletterne skal vælges. For nogle ligander vil detektionen være meget følsom (tæt på den optimale vinkel); For andre vil detektionen være mindre følsom, hvis den faste vinkelværdi er forskellig fra den optimale vinkel. Dette kan overvindes ved at bruge den sidste generation af SPRi-instrumentering, der giver op til 10 forskellige arbejdsvinkler.
Det andet kritiske trin er adskillelsen af elbilerne fra underlaget efter injektion. Hvis dissociationen er for høj (fordi elbilerne f.eks. kun har få specifikke proteiner på overfladen), vil det ikke være muligt at scanne ved hjælp af AFM bagefter. Disse situationer er meget sjældne, men når de opstår, skal strømningshastigheden og injektionsvarigheden optimeres for at løse problemet.
En begrænsning af den foreslåede metode kunne være manglende repræsentativitet af korrelationen mellem AFM-observationerne og mm²-området af EV-interaktioner på biochippen. Til det formål skal forskellige områder på stedet scannes, herunder fra store områder til små områder og forskellige steder inde på stedet. Ideelt set bør scanningen udføres i ROI-området for en god sammenhæng mellem AFM-karakteriseringen og SPRi-responsen.
I andre værker brugte forfatterne af denne undersøgelse optisk detektion og digital tælling af individuelle elbiler, der er baseret på interferometrisk billeddannelse af elbiler fanget på et biofunktionaliseret siliciumsubstrat. Denne teknik gør det muligt at estimere elbilernes størrelse på grund af den observerede kontrast. Denne platform gjorde det således muligt ved hjælp af de rigelige markører CD9, CD63 og CD81 at multiplexere analysen og detektere tilstedeværelsen af elbiler, der udtrykker en neuronal markør, CD171, i cerebrospinalvæske hos mennesker24.
Denne kombinerede og mærkningsfri tilgang, assisteret af streng metode i forberedelsen af biochippen og i AFM-erhvervelsestilstanden, udgør en valgfri metode til karakterisering af elbiler gennem deres optagelse i realtid og under flow i selv komplekse og rå prøver. Faktisk er der ikke behov for præanalytiske trin med prøven og ingen mærknings- eller afmaskningstrin i den præsenterede metode. I litteraturen afslørede Ertsgaard et al. forskellige rigelige EV-membranmarkører ved hjælp af en enkelt partikelinterferometrisk reflektionsbilleddannelsessensor (SP-IRIS), men i statisk tilstand (intet flow) uden kinetiske målinger, og gav kun et skøn over EV-størrelsen25.
På grund af denne optimerede procedure, der muliggør fremstilling af reaktive, kontrollerede biogrænseflader og passiverede multipleksede biochips, kan EV-undergrupper karakteriseres dybt, når de injiceres som rå prøver. Disse forskellige elementer gør denne NBA-platform til en yderst relevant metode til direkte, dyb og løst analyse af elbiler i rå prøver.
Spektroskopi, og især overfladeforstærket Raman-spektroskopi (SERS), dukker op som en foretrukken metode til biokemisk analyse af svagt udtrykte EV-biomarkører. Denne strategi har gjort det muligt at udvikle multipleksede assays med følsomheder på nogle få snese elbiler pr. μL. SERS-billeddannelse kombineret med sorteringsmetoder (f.eks. dielektroforese) muliggør analyse med høj kapacitet af EV-sammensætning26.
I dette arbejde var Raman-eksperimenterne udført på guldbiochips også meget opmuntrende, da der blev opnået et klart spektrum af EV'er, hvilket gav indsigt i deres molekylære sammensætning. Fremtidige udviklinger kan også omfatte SERS for at øge signalet fra elbilerne på overfladen af biochippen og tipforstærket Raman-spektroskopi (TERS) for at opnå billeder med nanometrisk opløsning, hvilket muliggør karakterisering af en enkelt EV.
Den seneste udvikling i laboratoriet er blevet foretaget for at forbedre følsomheden af biodetektion og diskriminationen mellem EV-undergrupper, der sameksisterer i en prøve og potentielt interagerer sammen på de samme arrays. For at øge følsomheden skiftes eksperimenter til SPRi-systemet, som gør det muligt at vælge flere vinkler til EV-detektion på forskellige steder. For at forbedre diskriminationen af EV-undergrupper skal forskellige udfordringer imødekommes: i) opnåelse af den spektroskopiske Raman-signatur for hver EV-delmængde på biochippen, ii) forøgelse af antallet af pletter, der er identificeret på biochippen (fra 16 til 100), og iii) forøgelse af analysens gennemstrømning ved hjælp af højhastigheds-AFM (HS AFM). Desuden vil HS AFM også muliggøre karakterisering af EV-undergrupper hurtigt og under flydende forhold.
Nogle andre punkter at bemærke er, at hvis hydrofiliciteten af guldbiochippen er høj, er der risiko for, at ligandernes pletter overlapper hinanden og blandes sammen (som vist i figur 4B). Det er nødvendigt at undgå at injicere luftbobler under injektion af opløsninger under SPRi, da dette ville føre til ændringer i reflektionsevnen og bidrage til forkert overvågning af SPRi-signalet.
Mens du scanner overfladerne med AFM, er det nødvendigt at observere billederne for at kontrollere, om der er drastiske ændringer i sumværdien, eller om der er artefakter (f.eks. Gentagne udseende af objekter). Dette kan skyldes AFM-spidsforurening; I dette tilfælde skal spidsen udskiftes.
Der er et par begrænsninger ved den teknik, vi har observeret: den valgte chipfølsomhed for alle de forskellige podede ligander er ikke optimal for dem alle; adskillelsen af elbilerne fra substratet ved injektionens afslutning og den lavere opløsning (end AFM) af Raman-billeddannelse, som ikke tillader visualisering af individuelle elbiler.
På trods af begrænsningerne har denne protokol mange væsentlige fordele i forhold til eksisterende metoder. Ved at kombinere de etiketfrie metoder (SPRi + AFM + Raman-spektroskopi) på det samme substrat og derefter på den samme biologiske prøve undgås bias mellem analyserne på grund af substratet og giver høj originalitet og tillid til analysen af EV-delmængder.
En sådan konstrueret analytisk platform kunne hjælpe med EV-karakterisering i forskellige sammenhænge, såsom inden for diagnose og acellulær bioterapi og biofluider fra blod til cellesupernatanter. Ud over EV-kvalifikation kan andre nanoobjekter (f.eks. Molekylære komplekser, syntetiske nanopartikler, vira) karakteriseres af denne multimodale analytiske platform.
På trods af de mange forskellige metoder, der er udviklet og implementeret i EV-samfundet, har hver af disse teknikker sit eget potentiale og forskelle i ydeevne med hensyn til det dynamiske område, nøjagtighed, gennemstrømning og anvendelse til analyse af specifikke EV-parametre26. Innovative, ultrafølsomme og flertrinsmetoder (adskillelse, udvælgelse, spektral signatur og analyse af vesikulært indhold), såsom denne multimodale analytiske platform, selv når den anvendes på små mængder chips (lab-on-a-chip), giver nye perspektiver inden for flydende biopsier, bioovervågning og præcisionsmedicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Kelly Aubertin og Fabien Picot fra IVETh-kerneanlægget (Paris) er anerkendt for Raman-billeddannelseseksperimenterne. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) og Zuzana Krupova (fra Helincourt, Frankrig) er anerkendt for at levere EV-prøverne fra henholdsvis blodplade- og komælksprøver. Arbejdet blev støttet af regionen Bourgogne Franche-Comté og EUR EIPHI graduate school (NOVICE-projektet, 2021-2024). En del af dette arbejde blev udført ved hjælp af CLIPP-platformen og i RENATECH renrumsfaciliteter i FEMTO-ENGINEERING, hvilket vi takker Rabah Zeggari for.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France) | 3450 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumine antibody | Sigma | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
| Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
| Sodium acetate buffer | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
References
- Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).
- Xunian, Z., Kalluri, R. Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes. Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).
- Hartjes, T. A., et al. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
- Xing, Y., et al. Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms. Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).
- Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations. Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).
- Boireau, W., Elie-Caille, C. Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization. Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).
- Brisson, A. R., et al. Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study. Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).
- Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., Pétry, J. Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy. Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006 (2017).
- Beekman, P., et al. Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy. Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).
- Malenica, M., et al. Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids. Biomedicines. 9 (6), 603 (2021).
- Verweij, F. J., et al. The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo. Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Obeid, S., et al. NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).
- Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for «on-chip» qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).
- Ridolfi, A., et al. AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles. Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).
- Vorselen, D., et al. The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis. Nature Communications. 9 (1), 4960 (2018).
- Hardij, J., et al. Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045 (2013).
- Jorgensen, M., et al. Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920 (2013).
- Remy-Martin, F., et al. Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).
- Czamara, K., et al. Raman spectroscopy of lipids: A review. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).
- Penders, J., et al. Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers. ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).
- Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing. Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).
- Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Scientific Reports. 6, 37246 (2016).
- Ertsgaard, C. T., et al. Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles. Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
