Summary
В данной работе предлагается новое поколение многопараметрических аналитических платформ с повышенной пропускной способностью для характеристики подмножеств внеклеточных везикул. Метод основан на сочетании мультиплексных методов биозондирования с метрологическим и морфомеханическим анализом методом атомно-силовой микроскопии в сочетании с рамановской спектроскопией для квалификации везикулярных мишеней, захваченных на микрочипе.
Abstract
Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой мембранные, крошечные везикулы, продуцируемые всеми клетками, которые варьируются от 50 до нескольких сотен нанометров в диаметре и используются в качестве средства межклеточной коммуникации. Они становятся многообещающими диагностическими и терапевтическими инструментами для лечения различных заболеваний. Существует два основных процесса биогенеза, используемых клетками для производства EV с различиями в размере, составе и содержании. Из-за их высокой сложности по размеру, составу и происхождению клеток их характеристика требует сочетания аналитических методов. Данный проект предполагает разработку нового поколения многопараметрических аналитических платформ с повышенной пропускной способностью для характеризации субпопуляций электромобилей. Для достижения этой цели работа начинается с созданной группой нанобиоаналитической платформы (NBA), которая позволяет проводить оригинальные исследования электромобилей на основе комбинации мультиплексных методов биозондирования с метрологическим и морфомеханическим анализом методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) везикулярных мишеней, захваченных на микрочипе. Цель состояла в том, чтобы завершить это исследование EV фенотипическим и молекулярным анализом с помощью рамановской спектроскопии. Эти разработки позволяют предложить мультимодальное и простое в использовании аналитическое решение для дискриминации подмножеств EV в биологических жидкостях с клиническим потенциалом
Introduction
Растущий интерес к исследованиям электромобилей в диагностике и терапии 1,2,3,4,5 в сочетании с проблемами, с которыми сталкивается эта область, привел к разработке и внедрению большого разнообразия подходов и методов для количественной оценки или характеристики этих везикул. Наиболее широко используемыми методами идентификации EV являются белково-специфический иммуноблоттинг и протеомика для подтверждения происхождения EV, просвечивающая электронная микроскопия (TEM) для подтверждения их структуры и анализ отслеживания наночастиц (NTA) для количественной оценки их количества и распределения по размерам в объеме образца.
Однако ни один из этих методов сам по себе не дает всей информации, необходимой для характеристики подмножеств электромобилей. Присущая электромобилям гетерогенность из-за разнообразия их биохимических и физических свойств препятствует глобальному анализу, который является надежным и воспроизводимым, особенно для электромобилей, содержащихся в смеси (сыром образце). Таким образом, методы обнаружения и определения характеристик необходимы для электромобилей, как индивидуально, так и в целом, чтобы дополнить другие методы, которые являются более быстрыми, но не селективными6.
Визуализация с высоким разрешением с помощью ПЭМ (или криоТЕМ) или АСМ позволяет определять морфологию и метрологию электромобилей с нанометровым разрешением 7,8,9,10,11,12. Однако основным ограничением использования электронной микроскопии для биологических объектов, таких как EV, является необходимость вакуума для проведения исследования, которое требует фиксации и обезвоживания образца. Такая подготовка затрудняет перевод от наблюдаемых структур к морфологии EV в растворе. Чтобы избежать такого обезвоживания образца, метод криоТЭМ является наиболее подходящим для характеристики ЭВ13. Он широко используется для определения ультраструктуры электромобилей. Иммуномаркировка везикул биофункционализированными наночастицами золота также позволяет идентифицировать специфические субпопуляции ЭВ и отличать их от других частиц, присутствующих в сложном биологическом образце. Однако из-за небольшого количества электромобилей, анализируемых с помощью электронной микроскопии, часто бывает трудно выполнить характеристику, репрезентативную для сложного и неоднородного образца.
Чтобы выявить эту гетерогенность размеров, Международное общество внеклеточных везикул (ISEV) предлагает проанализировать достаточное количество широкопольных изображений, сопровождаемых изображениями меньшего размера, чтобы выявить отдельные EV с высоким разрешением14. АСМ является альтернативой оптическим подходам и электронным дифракционным методам для исследования электромобилей. В этом методе используется острый наконечник, удерживаемый гибким консолью, который сканирует образец, нанесенный на одну опору, строка за линией, и регулирует расстояние между наконечником и присутствующими элементами через петлю обратной связи. Это позволяет охарактеризовать топографию образца и собрать морфомеханическую информацию15,16,17,18. EV могут быть отсканированы с помощью AFM либо после осаждения на атомарно плоской подложке, либо после захвата на специфический субстрат, функционализированный антителами, пептидами или аптамерами, для характеристики различных субпопуляций18,19. Благодаря своей способности количественно определять и одновременно исследовать структуру, биомеханику и мембранное биомолекулярное содержание электромобилей в сложных биологических образцах без необходимости предварительной обработки, маркировки или обезвоживания, АСМ в настоящее время все чаще используется для точной и многопараметрической характеристики электромобилей в физиологических условиях температуры и среды.
В данной работе предложена методология с использованием основного золотого биочипа, способного к (био)химической функционализации в мультиплексированном формате. Этот субстрат является краеугольным камнем мощной аналитической платформы, объединяющей биообнаружение подмножеств EV с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и после того, как EV адсорбированы / привиты или иммунозахвачены на чипе, AFM позволяет метрологические и морфомеханические характеристики EV. В сочетании с рамановской сигнатурой подмножеств EV, захваченных на чипе, эта аналитическая платформа позволяет квалифицировать EV, присутствующие в биологических образцах, без меток и без необходимости в преаналитических этапах. В этой статье показано, что сочетание мощных методов, подкрепленных очень строгой методологией подготовки субстрата и сбора данных, делает анализ EV глубоким, окончательным и надежным.
Принцип предлагаемого подхода заключается в приготовлении золотого субстрата, адсорбции/трансплантации или захвате подтипов EV и сканировании их с помощью AFM для оценки размера и морфологии каждого подмножества EV. Кроме того, эти адсорбированные электромобили анализируются с помощью рамановской спектроскопии. Этот субстрат действительно может представлять три типа интерфейсов растущей сложности: голые, химически функционализированные или лигандные микрочипы. Прежде чем описывать различные этапы протокола, читатели могут обратиться к схематическому представлению подхода нанобиоаналитической платформы (NBA) на рисунке 1, сочетающего поверхностную плазмонно-резонансную томографию (SPRi), АСМ и спектроскопию.
Рисунок 1: Платформа NanoBioAnalytical. Этот подход сочетает в себе (A) поверхностно-плазмонно-резонансную томографию, (B) атомно-силовую микроскопию и инфракрасную/рамановскую (нано)спектроскопию, которые выполняются на одной и той же подложке - мультиплексированном золотом чипе. Сокращения: NBA = NanoBioAnalytical platform; SPRi = поверхностно-плазмонно-резонансная томография; АСМ = атомно-силовая микроскопия; EV = внеклеточный везикула. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Основной золотой биочип является сердцем платформы, поскольку на этом биочипе проводятся все методы определения характеристик без меток. В соответствии с потребностями характеристики EV (либо глобальные/общие EV, либо подмножества EV) и ограничениями/требованиями используемых методов, были разработаны три типа поверхностей золотых биочипов: либо «голые», химически функционализированные «C11/C16», либо лигандно-биофункционализированные, называемые «лигандной» золотой поверхностью.
Голый биочип, называемый «голым», обеспечивает простую адсорбцию электромобилей на золоте. Можно выбрать используемый буфер и реализовать эту адсорбцию либо пассивным способом (этапы инкубации и последующей промывки), либо контролировать его под потоком (в SPRi). Более того, эта пассивная адсорбция может быть реализована либо на всем чипе (в виде макрочипа), либо локализована в микрочипах с помощью микропипетки-споттера. «Процедура под потоком» позволяет исследователям следить за кинетикой и уровнем адсорбции EV. Этот подход на голой золотой подложке применяется, когда граница раздела химического слоя может мешать аналитическому методу (например, для рамановской спектроскопии).
Химически функционализированный биочип, называемый «C11 / C16», используется для создания плотного и прочного «ковра» из EV, ковалентно связанных на поверхности золота, путем образования первичных амидных связей с тиолатами, когда цель состоит в том, чтобы иметь глобальное представление об образце EV. Действительно, в этом случае золото функционализируется тиолатной смесью меркапто-1-ундеканола (11-MUOH: «C11») и меркапто-1-гексадекановой кислоты (16-MHA: «C16»), а часть тиолатов химически активируется для установления ковалентного связывания с мишенями. Опять же, эта стратегия может быть реализована либо пассивно (этапы инкубации, а затем промывки, либо в «макромассиве», либо в нескольких микрочипах с использованием микропипетки-споттера), либо при низких скоростях потока (в SPRi), чтобы следить за кинетикой и уровнем прививки EV на поверхности золота.
Лиганд-биофункционализированный биочип, называемый «лигандами», химически активируется для ковалентного трансплантата различных лигандов (например, антител, рецепторов) для селективного захвата (с аффинностью) различных подмножеств EV, которые сосуществуют в биологическом образце.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка золотого субстрата
ПРИМЕЧАНИЕ: На золотой крошке производятся три типа поверхностей: 1) голая поверхность, 2) химически функционализированная и 3) биофункционализированная (лиганды, привитые к слою C11C16). С этого момента они будут называться «голыми», «C11C16» и «лигандами» соответственно.
- Подготовка золотого субстрата:
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола золотые биочипы были изготовлены на собственном производстве в чистом помещении. Самодельные биочипы состояли из предметных стекол (SF11) с покрытием из хрома (2 нм Cr) и золота (48 нм Au). Длина биочипа составляла 28 мм, ширина — 12,5 мм, а толщина —0,5 мм20.- Используйте магнетронное распыление постоянного тока15 для покрытия предметных стекол физическим осаждением из паровой фазы (PVD).
- Химическая функционализация:
- Функционализируйте голые чипсы, инкубируя их в течение ночи в 90% / 10% мольной смеси меркапто-1-ундеканола (11-MUOH: C11) и меркапто-1-гексадекановой кислоты (16-MHA: C16) при 1 мМ в абсолютном этаноле, при перемешивании и при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образуется стабильный самоорганизующийся монослой (SAM), который полезен при пересадке лигандов. - Очистите биочип (аккуратно вымойте) абсолютным этанолом и сверхчистой водой, высушите под азотом и храните в чистых помещениях.
- Активация химически функционализированного биочипа:
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, эксперименты должны проводиться в аналитической лаборатории.- Очистите биочип сверхчистой водой, аккуратно промыв его, а затем высушите чип под мягким потоком воздуха. Для активации карбоксильных групп С16 биочип инкубируют в смеси 200 мМ этил(диметиламинопропил) карбодиимида/N-гидроксисукцинимида (EDC) и 50 ммоль/л N-гидроксисукцинимида (Sulfo-NHS) в течение не менее 30 мин в темноте при комнатной температуре. Затем промойте водой перед прививкой опытов.
- Функционализируйте голые чипсы, инкубируя их в течение ночи в 90% / 10% мольной смеси меркапто-1-ундеканола (11-MUOH: C11) и меркапто-1-гексадекановой кислоты (16-MHA: C16) при 1 мМ в абсолютном этаноле, при перемешивании и при комнатной температуре.
- Прививка лигандов на функционализированный биочип:
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммобилизация лигандов (или EV для некоторых экспериментов) на чипе может быть выполнена либо пассивно вне прибора SPRi (инкубация капли на активированном чипе), либо динамически под потоком в прибор SPRi. Это представляют собой чипы, модифицированные EV или лигандами. На рисунке 2 представлены золотой биочип, микропипетка и биочип после обнаружения с 16 лигандными каплями по 300 нл каждая.- Для пересадки лиганда используйте такие молекулы, как антитела (например, иммуноглобулины-антиCD41 [специфичные для EV, полученные из нативных тромбоцитов крови, называемые N-PEV], антиCD61, антиCD62P, антиCD9 и антиOVA [контрольные антитела против овальбумина]) и Annexin V. Разбавьте их до 200 мкг/мл в кислом растворе (от рН 4,5 до 6 в зависимости от оптимального рН для активности или функции лиганда).
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный рН для прививки антител был определен ранее с помощью экспериментов по предварительному концентрированию, проведенных на приборе SPR для определения оптимального рН для прививки лиганда (см. рис. 3). Поскольку условия прививки изменяются в зависимости от клонов используемых антител, рекомендуется определить эти условия, прежде чем приступать к экспериментам SPRi. - Для процедуры прививки добавьте 300 нл раствора EV / лиганда с помощью споттера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лист бумаги, погруженный в воду, следует хранить как в левом, так и в правом колодцах, чтобы избежать испарения капель. Этот шаг важен для поддержания EV/лигандов в их оптимальных условиях для стабильности и функциональности. - После обнаружения биочипа держите под звуковой ванной (частота: 37 кГц, мощность: 30%) в течение 30 минут инкубации. Промойте биочип сверху сверхчистой водой и аккуратно поместите его на призму с тем же индексом преломления (RI), что и биочип. При регулировке биочипа в верхней части призмы добавьте каплю (~ 2,3 мкл) масла с тем же RI, что и призма, чтобы создать однородный тонкий слой между биочипом и призмой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг обеспечивает непрерывную среду одного и того же RI в оптическом тракте. На этом этапе важно избегать попадания пузырьков в масляный слой, так как это изменит оптические свойства пути и затруднит дальнейший анализ.
- Для пересадки лиганда используйте такие молекулы, как антитела (например, иммуноглобулины-антиCD41 [специфичные для EV, полученные из нативных тромбоцитов крови, называемые N-PEV], антиCD61, антиCD62P, антиCD9 и антиOVA [контрольные антитела против овальбумина]) и Annexin V. Разбавьте их до 200 мкг/мл в кислом растворе (от рН 4,5 до 6 в зависимости от оптимального рН для активности или функции лиганда).
Рисунок 2: Биочип и ручной споттер. Золотой биочип (слева), микропипетка (посередине) и биочип после кровянистых выделений с лигандными каплями по 300 нл каждая (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Тесты на предварительную концентрацию для определения оптимального рН для пересадки лиганда. Сенсорограмма представляет уровень взаимодействия как функцию времени для одного лиганда, введенного случайным образом (при разных значениях рН) в одной и той же концентрации в течение 2 мин на поверхности. OG - это моющее средство, которое позволяет восстанавливать базовый уровень между каждой инъекцией. Здесь сенсорограмма показывает, что рН 6 допускает наибольшую пересадку лиганда с сигналом SPRi 1091 RU. Сокращения: OG = октилглюкозид; RU = единица ответа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Поверхностная плазмонно-резонансная томография
- Установите биочип на систему SPRi. Поддерживайте расход буфера PBS (рабочего буфера) на уровне 50 мкл / мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть какие-либо пузырьки, увеличьте скорость потока до 500-1,000 мкл / мин и часто вводите 40 мМ октилглюкозида (OG), чтобы удалить их как можно скорее. - Кондиционирование золотого биочипа в приборе SPRi: выбор рабочих углов
- Нажмите на раскрывающееся меню в левой части программного обеспечения и нажмите на рабочий каталог , чтобы определить папку, в которой должны быть сохранены экспериментальные данные. После этого нажмите « Плазмон» | Получение изображения.
- Найдите изображение (как показано на рисунке 4A), на котором видны различные пятна, и нажмите, чтобы выбрать это изображение. Чтобы определить область интереса (ROI), как показано на рисунке 4, нажмите либо на автоматическое обнаружение, либо на ручное определение внутри пятен (рисунок 4B), либо на чипе, чтобы обратиться к определенному месту даже без пятен (рисунок 4C).
- При использовании мультиплексированных биочипов напишите название семейств лигандов, а затем нажмите на соответствующие точки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Семейство лигандов соответствует нескольким точкам, функционализированным одним и тем же лигандом. Обычно чип представляет, по крайней мере, дубликаты, а то и часто тройки каждого лиганда. - Нажмите на кнопку «Завершить определение вида » и дождитесь перехода к окну, содержащему полученные плазмонные кривые.
- Выберите рабочий угол. Перетащите черную линию курсором на оптимальный рабочий угол и нажмите « Переместить зеркало на рабочий угол».
ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмонная кривая состоит из значения отражательной способности (%) по отношению к углу, а программное обеспечение выдает другую кривую со значением наклона (%) по отношению к углу. Чтобы выбрать хороший рабочий угол, выберите угол с наибольшим значением наклона.- В случае пассивирующей стадии (из-за альбумина), выполняемой внутри аппарата, выберите рабочий угол , чтобы получить оптимальную чувствительность к поверхности, тем самым установив контроль качества поверхностной реакционной способности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап пассивации важен, когда чип подготовлен к биодетекции сродства/захвата, чтобы уменьшить неспецифические взаимодействия между образцом и поверхностью биочипа.
- В случае пассивирующей стадии (из-за альбумина), выполняемой внутри аппарата, выберите рабочий угол , чтобы получить оптимальную чувствительность к поверхности, тем самым установив контроль качества поверхностной реакционной способности.
- Нажмите на Kinetics , чтобы начать кинетический мониторинг в реальном времени. После того, как программное обеспечение предложит пользователю определить отрицательный контроль, выберите «Нет отрицательного управления » на этом этапе (так как это позволит наблюдать кинетику на отрицательных контрольных точках).
- Вводят сывороточный альбумин крысы (RSA, 200 мкг/мл, приготовленный в ацетатном буфере, рН 4,5) со скоростью 50 мкл / мин в течение 4 мин , чтобы пассивировать поверхность вокруг пятен и, возможно, заполнить пустые пространства внутри лигандных пятен.
ПРИМЕЧАНИЕ: RSA вводится для покрытия биочипа, который не связан ни с какими лигандами. - Вводите этаноламин (1 М) со скоростью 20 мкл / мин в течение 10 мин , чтобы дезактивировать карбоксильные группы, все еще присутствующие и реакционноспособные на поверхности.
- Промойте биочип, впрыскивая 40 мМ OG со скоростью 50 мкл / мин в течение 4 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этапа пассивации рабочий угол регулируется (в качестве нового базового определения перед впрыском образца) так, чтобы он имел максимальную чувствительность в интересующих местах.
- Вводят сывороточный альбумин крысы (RSA, 200 мкг/мл, приготовленный в ацетатном буфере, рН 4,5) со скоростью 50 мкл / мин в течение 4 мин , чтобы пассивировать поверхность вокруг пятен и, возможно, заполнить пустые пространства внутри лигандных пятен.
- Впрыск образца:
- Переопределите плазмонные кривые после пассивации и на этот раз выберите рабочий угол в соответствии с лигандом.
- При кинетическом мониторинге уменьшите скорость потока до 20 мкл / мин и подождите, пока базовый уровень не станет стабильным.
- Введите образец в выбранной концентрации (от 1 x 10 8 EV / мл до 1 x 10 10 EV / мл в зависимости от сродства между EV и трансплантированными лигандами) и нажмите либо ручную инъекцию, либо автоматическую инъекцию. В случае ручного впрыска после введения 200 мкл образца нажмите «Остановить инъекцию». Поскольку продолжительность инъекции обычно составляет 10 минут, начните следить за кинетикой взаимодействия и измерьте изменение отражательной способности, вычислив разницу в отражательной способности между началом и концом инъекции, наблюдаемую во время кинетического мониторинга (рис. 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные образцы, которые были введены, описаны в разделе репрезентативных результатов.
- После впрыска образца следуйте одному из следующих двух подходов, чтобы завершить эксперимент SPRi:
- При нефиксированном/жидкостном подходе выньте биочип из аппарата SPRi, добавьте на него каплю жидкости и приступайте к дальнейшей характеристике поверхности в жидкости с помощью АСМ.
- При фиксированном подходе вводят глутаровый альдегид (0,5%), разбавленный водой со скоростью 20 мкл / мин, в течение 10 мин , чтобы зафиксировать молекулы, захваченные на биочипе. Впрысните воду, чтобы промыть поверхность, выньте биочип, очень осторожно промойте его дистиллированной водой и высушите на воздухе для дальнейшего анализа под АСМ.
Рисунок 4: ПЗС-изображение биочипа SPRi. (А,Б) Мультиплексированный биочип после пассивации альбумина. (A) Чип без дефолта; (B) некоторые дефекты, появившиеся на чипе: слияние пятен (i), слабая прививка (ii) или пыль или «загрязнения» (iii). ROI, по цвету в пятнах (по одному цвету на семейство лигандов), были выбраны, чтобы избежать этих «загрязняющих веществ». Когда пятна сливались, они отмечались и либо игнорировались, либо назывались «смесью лигандов 1 и 2». (C) Голая золотая крошка без микрочипов для эксперимента по изучению адсорбции EV на золоте. Синяя стрелка указывает направление потока. На этом чипе не было пятен, и ROI были выбраны для регистрации сигнала отражательной способности от линии 1 (L1, красные круги) до линии 4 (L4, фиолетовые круги) во время впрыска образца. Масштабная линейка = 1 мм для всех трех изображений. Сокращения: SPRi = поверхностно-плазмонно-резонансная томография; ПЗС-матрица = устройство с зарядовой связью; ROI = регионы интереса; EVs = внеклеточные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Эксперименты SPRi по впрыску EV на биочип . (A) Эксперимент по захвату на мультиплексированном биочипе, показывающий сигналы отражательной способности различных лигандов. Здесь отношение сигнал/шум для различных лигандов было очень хорошим (и особенно на точках антиCD41), поскольку отклик отрицательного контроля был незначительным. (B) Эксперимент по адсорбции электромобилей на голом биочипе. Сенсорограмма, представляющая кондиционирование чипа двумя промывками буфера и очисткой OG (1), впрыском образца EV (2) и сигналом отражательной способности после взаимодействия EV (3). На этом биочипе не было отрицательного контроля, но сигнал отражательной способности (его кинетика, стабильность после впрыска) был высоким, а это означает, что эти EV могли адсорбироваться и оставаться стабильными на золотом чипе. Сокращения: EV = внеклеточный везикула; OG = октилглюкозид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Атомно-силовая микроскопия
- Используйте контактный режим для сканирования биочипа на воздухе и режим количественной визуализации для сканирования биочипа в жидких условиях.
- Выровняйте биочип в верхней части маски на предметном стекле (разработанном в лаборатории), чтобы определить положение соответствующих микропятен на биочипе (рис. 6A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Маска содержит отметки пятен, которые соответствуют положениям пятен лигандов в соответствии с используемым споттером. Эта маска состоит из предметного стекла, на котором два перпендикулярных клина позволяют разместить чип. Кроме того, предметное стекло отмечено 16 фетровыми точками, соответствующими локализации пятна на чипе, что позволяет путем прозрачности определять местонахождение пятен и сканировать нужную область. - Расположение наконечника:
- Используйте ПЗС-камеру поверх АСМ, чтобы локализовать консоль в нужном месте, которое необходимо сканировать. Чтобы следовать этому протоколу, используйте треугольные консоли длиной 200 мкм, шириной 28 мкм и постоянной пружины 0,08 Н/м.
- Выровняйте лазер в верхней части кантилевера в положении, обеспечивающем оптимальный отклик в механизме управления обратной связью.
- Сканирование:
- После контакта с поверхностью биочипа начните сбор данных АСМ в контактном режиме или в режиме количественной визуализации от трех до пяти больших областей (обычно 10 × 10 мкм²) до небольших участков (1 x 1 мкм²).
ПРИМЕЧАНИЕ: Представление различных областей, которые могут быть отсканированы, показано на рисунке 6D. Убедитесь, что характеристика АСМ является репрезентативной для всего пятна мм² и что достаточное количество электромобилей визуализируется с хорошим разрешением для надежного анализа (минимум 300 электромобилей подсчитывается и анализируется для каждого состояния), а также выполняйте метрологические и морфологические измерения.
- После контакта с поверхностью биочипа начните сбор данных АСМ в контактном режиме или в режиме количественной визуализации от трех до пяти больших областей (обычно 10 × 10 мкм²) до небольших участков (1 x 1 мкм²).
- Обработка изображений AFM:
- Обработайте изображения AFM с помощью программного обеспечения для обработки данных JPK, сначала выбрав канал высоты.
- Выберите полиномиальную подгонку , которую нужно вычесть из каждой строки, чтобы получить выпрямленные линии развертки.
- Выберите порог высоты на золотых зернах, чтобы устранить шероховатость поверхности. В упомянутом программном обеспечении (см. Таблицу материалов) в модуле экстракции зерна отметьте зерна, используя пороговое значение высоты в 8,5 нм. После того, как зерна были отфильтрованы, появляется количество зерен .
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно грубая золотая подложка (RMS ~ 3 нм) и наличие химических и лигандных слоев требуют, чтобы порог был установлен на уровне 8,5 нм. - Чтобы извлечь несколько свойств отмеченных зерен, таких как высота, объем и диаметр, откройте изображение в указанном программном обеспечении и выберите « Обработка данных | Зерновые | Отметка по порогу.
- Выберите зернистость фильтра в функции свойств. Когда появится новое окно, выберите следующие параметры: Значение = максимум z-max, Поверхность = проецируемая поверхность A0. Затем выберите критерии A И B.
- Открытая раздача зерна; В появившемся окне выберите значение (максимум), объем (базовый: ноль) и границу (длина). Обратите внимание на появившуюся таблицу (в .txt формате), в которой представлены три столбца со значениями высоты, объема и диаметра для всех зерен, обнаруженных при установленном пороге на изображение.
- Исходя из высоты h и диаметра D, вычислите радиус кривизны Rc каждого электромобиля с помощью уравнения (1)8, а затем вычислите объем V, используя уравнение (2):
(1)
(2) - Из V вычислите эффективный диаметр d eff каждого EV (диаметр сферы с одинаковым объемом), используя уравнение (3):
(3) - Построение графиков, показывающих размеры (измеренная высота, измеренный диаметр и вычисленный эффективный диаметр) электромобилей, при этом каждая подсчитанная частица представлена точкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, в конце характеристики платформа NBA позволяет коррелировать сигнал биодетекции, а затем фенотипирование с числами и размерами подмножеств EV.
(1)
(2)
(3)
Рисунок 6: Характеристика биочипа с помощью АСМ. После эксперимента SPRi чип либо фиксировали и сушили, либо поддерживали в жидкости для определения характеристик АСМ. (A) Обработанное предметное стекло (с двумя перпендикулярными позиционирующими клиньями, обозначенными буквой «w» на рисунке), представляющее собой маску, соответствующую локализации 16 микрочипов биочипов. Благодаря освещенности и прозрачности, после установки для характеристики АСМ предметное стекло позволяет разместить наконечник АСМ в нужном месте для его характеристики. (B) Биочип, установленный на предметном стекле «маски» и под каплей буфера для сканирования в жидких условиях. (C) SPRi-изображение 16 микрочипов. (D) Один микрочип, визуализированный с помощью оптической микроскопии после иммунозахвата биофункционализированных калибровочных наночастиц диаметром 920 нм. Белые квадраты указывают на выборку различных областей, сканируемых АСМ в каждой интересующей точке, чтобы сделать характеристику АСМ надежной. Масштабные линейки = (C) 1 мм, (D) 500 мкм. Сокращения: АСМ = атомно-силовая микроскопия; SPRi = поверхностно-плазмонно-резонансная томография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Рамановская спектроскопия
ПРИМЕЧАНИЕ: Для рамановской спектроскопии замените предметное стекло, используемое в качестве подложки, на предметное стекло CaF2, которое имеет пренебрежимо малую комбинационную сигнатуру.
- Оптические условия для приобретения:
- Установите следующие условия для рамановского микроскопа: объектив микроскопа: 50x; длина волны лазера: 532 нм; мощность лазера: 10 мВт; время экспозиции: 500 мс; количество накоплений: 140; спектральный диапазон: от 450 см−1 до 3 200 см−1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование слишком большой мощности и/или слишком длительное время сбора данных может привести к повреждению образца, о чем свидетельствуют нестабильные спектры с течением времени. Начните с небольшого количества энергии и увеличьте ее, если сигнал слишком слабый. Можно использовать более высокие длины волн лазера (633 нм, 785 нм) для уменьшения флуоресценции, вредной для рамановских измерений. Однако интенсивность уменьшается с четвертой степенью длины волны, и следует учитывать спектральную чувствительность камеры.
- Установите следующие условия для рамановского микроскопа: объектив микроскопа: 50x; длина волны лазера: 532 нм; мощность лазера: 10 мВт; время экспозиции: 500 мс; количество накоплений: 140; спектральный диапазон: от 450 см−1 до 3 200 см−1.
- Рамановская томография:
- Во-первых, наблюдайте за живыми спектрами с уменьшенным количеством накоплений (10), чтобы найти область с наилучшим отношением сигнал/шум.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сильный сигнал в высокочастотной области (2,800-3,000 см-1) может облегчить обнаружение электромобилей на поверхности с низким временем экспозиции, как показано ранее10. - После того, как ROI выбран, выберите пространственное разрешение в соответствии со временем, доступным для приобретения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пространственное разрешение ограничено дифракционным пределом (~500 нм). - Начните сбор рамановского картографирования.
- Во-первых, наблюдайте за живыми спектрами с уменьшенным количеством накоплений (10), чтобы найти область с наилучшим отношением сигнал/шум.
- Предварительная обработка данных:
- Используя интегрированную среду разработки Python (IDE) (например, Spyder), откройте файл, содержащий спектры.
- Вычтите базовую линию спектров, чтобы скорректировать интерференцию возможной флуоресценции. Например, воспользуйтесь функцией "arpls" из пакета "irfpy"23. Протестируйте различные значения параметра «lam», чтобы найти то, которое дает наилучшую базовую коррекцию (обычно от 103 до 107).
- Нормализуйте спектры, например, разделив все интенсивности спектра на его интенсивность при 2,900 см-1 или вычтя среднее значение спектра, а затем разделив его на его стандартное отклонение (нормализация стандартной нормальной вариации).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для сравнения относительного молекулярного состава электромобилей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Определение оптимальных условий рН для прививки лиганда
Различные лиганды, используемые для приготовления биочипов, тестируются в зависимости от рН и их готовности взаимодействовать с химическим слоем тиолата (рис. 3). Лиганды разбавляют в ацетатном буфере при различных значениях рН и вводят на биочип, химически функционализированный слоем C11C16. Растворы вводятся случайным образом на поверхность, и после каждой инъекции лиганда вводится моющее средство (OG при 40 мМ) для восстановления исходного уровня. Этот тест на предварительную концентрацию позволяет определить оптимальный рН для каждой пересадки лиганда. В примере, представленном на рисунке 3, рН 6 был выбран как лучший рН с точки зрения наклона и уровня прививки лиганда.
ПЗС-изображения SPRi
Изображения SPRi CCD, зарегистрированные на биочипе (голые, химически функционализированные или представляющие собой микрочипы) после введения в машину SPRi, представлены на рисунке 4. В случае биочипа, представляющего микрочипы, изображение было получено после пассивации поверхности альбумином. Дубликаты или тройки пятен систематически реализовывались на чипе, и отрицательный контроль автоматически также присутствовал на чипе. Отрицательный контроль в основном состоял из нерелевантных антител. В SPRi, когда биочип использовался без споттинга — для адсорбции на голом золоте или для непосредственной прививки EV на химически функционализированный биочип — ROI выбирались произвольно в области зондирования. В качестве примера на рисунке 4C показана рентабельность инвестиций, выбранная на голом золотом чипе перед впрыском электромобилей.
Благодаря этому ПЗС-снимку SPRi можно игнорировать определенные пятна, если такие проблемы появляются во время прививки. ПЗС-изображение SPRi также позволяет оценить однородность прививки внутри пятна, обеспечивает воспроизводимость прививки между различными пятнами одного и того же лиганда и, наконец, гарантирует, что биодетекция EV протекает на массивах, эквивалентных по плотности поверхности.
Результаты SPRi
Когда ROI выбраны, базовый уровень стабилен, что означает, что образец может быть введен. На рисунке 5 показаны различные результаты, полученные на мультиплексированном биочипе, показывающие высокое отношение сигнал/шум для определенных иммуночипов (отражательная способность сигнала составляет 1,4% на антиCD41 по сравнению с ответом на отрицательный контроль 0,02%). На рисунке 5B представлены результаты адсорбции EV, полученные после впрыска образца EV на голый золотой чип. Образец N-PEV был взят из тромбоцитов. Раствор центрифугировали при 3 000 × г в течение 15 мин при 22 °С; затем надосадочную жидкость снова центрифугировали при 20 000 × г в течение 15 мин при 22 ° C. Полученную гранулу ресуспендировали в буфере. Те результаты SPRi, которые были получены на иммунозахваченных N-PEV, сравнивали с результатами вестерн-блоттинга (WB). WB выявил сильную экспрессию CD41, CD62P и CD9 в этих образцах, что подчеркивает хорошую корреляцию с результатами SPRi (дополнительный рисунок S1).
На рисунке 5B представлены результаты адсорбции EV, полученные после инъекции образца EV из первичных эпителиальных клеток молочной железы человека (HMEC) на голый золотой чип. Культуру клеток HMEC центрифугировали при 3 650 × г в течение 10 мин, а затем надосадочную жидкость снова центрифугировали при 10 000 × г в течение 30 мин при 4 °C. Полученную гранулу ресуспендировали в буфере 1x PBS для ее промывки, и центрифугирование снова проводили при 10 000 × г в течение 30 мин при 4 °C. Наконец, гранулы были суспендированы в буфере 1x PBS.
Характеристика АСМ
После экспериментов SPRi и загрузки EV на биочипы (путем адсорбции, прививки или аффинного захвата) АСМ выполняли по методологии сканирования больших сканов (10 x 10 м²), а затем (~ 10 по крайней мере) более мелких (несколько мкм²). На рисунке 7 показаны примеры крупномасштабных и мелкомасштабных АСМ-изображений электромобилей на биочипах.
Рисунок 7: АСМ-характеристика электромобилей на биочипе. Изображения, полученные в контактном режиме высушенного образца. (A) Один пример большой области сканирования для получения репрезентативного представления о рентабельности инвестиций в мм² на микросхеме. Такой результат был получен после ковалентной прививки ЭВ на химически модифицированную поверхность. (B) Еще один пример большой области сканирования, полученной после захвата EV на иммуномассивах. (C) Более пристальный взгляд на объекты для получения высокого разрешения и метрологии (по высоте и диаметру) электромобилей. (D) Более близкий вид биочипа на изображении в (A) с 3D-наклонным изображением. (E) Увеличенный вид одного большого электромобиля, адсорбированного на голом золотом биочипе в наклонном 3D-изображении. Шкала Z составляет (A, B) 30 нм и (C) 20 нм. Масштабные линейки = (A, B) 2 мкм, (C) 500 нм. Сокращения: АСМ = атомно-силовая микроскопия; EVs = внеклеточные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Анализ Gwyddion
Программное обеспечение Gwyddion использовалось для обработки данных для каждой везикулы, визуализированной на каждой партии изображений AFM. Сначала была отсканирована большая область (в диапазоне 10 x 10 мкм²), показывающая репрезентативный вид ROI в мм² на чипе. На изображении на рисунке 7А видно, что поверхность была плотно покрыта объектами. В этом случае EV (из бычьего молока) вводили в дозе 2,5 × 1010 / мл на активированный тиол-функционализированный чип. После исключения казеина из образца сывороточные надосадочные жидкости концентрировали центрифугированием при 4000 × г и 20 °C с использованием центробежных фильтрующих установок Amicon 100 кДа, а EV выделяли с использованием ультрацентрифугирования градиента сахарозы. Этот результат соответствует ковалентно привитым электромобилям на химически модифицированную поверхность. На рисунке 7B показан еще один пример большой области сканирования, полученной после захвата ЭВ на иммуномассивах. Здесь также объекты присутствовали на поверхности, но показали менее плотное покрытие, чем когда электромобили были ковалентно привиты к чипу. Более пристальный обзор, показанный на рисунке 7C, в нескольких местах ROI обеспечивает высокое разрешение и метрологию (по высоте и диаметру) электромобилей. Другой более близкий вид (рис. 7D) биочипа, показанный на рисунке 7A, с 3D-наклонным изображением, показывает объекты, которые являются везикулами, но также нитевидными (вверху слева). Действительно, в то время как иммуночипы позволяют селективно и дифференциально захватывать подмножества EV, ковалентная прививка трансплантирует все объекты со свободными аминогруппами, которые присутствуют в образце. На рисунке 7E АСМ показывает один большой EV из культуры HMEC, адсорбированный на голом золоте. Таким образом, AFM может выявлять малые и большие электромобили и измерять их, а также помогает подсчитывать количество объектов на мм², позволяя визуализировать каждый электромобиль.
Были определены измеренная высота и диаметр каждого электромобиля, из которых был получен эффективный диаметр. Высота EV охватывала диапазон от 10 до 50 нм, в среднем 15 нм; измеренные диаметры EV охватывали диапазон от 50 нм до 300 нм со средним значением 100 нм. Мы заметили, что эффективный диаметр электромобилей варьировался от 30 до 300 нм, причем подавляющее большинство из них около 60 нм (рис. 8A). Эти измерения проводились в жидкости или после фиксации и сушки. На рисунке 8В видно, что результаты, полученные в этих двух условиях, были сопоставимы.
Рисунок 8: Результаты, полученные с помощью характеристики АСМ электромобилей на биочипе. (A) Метрология ЭВ в одном месте (иммуномассив против CD41), определяемая с порогом 8,5 нм и после инъекции образца ЭВ в дозе 2,5 × 1010/мл. Представлен «эффективный расчетный диаметр», при этом каждая точка соответствует частице, визуализированной на изображениях АСМ. (B) Гистограмма, полученная на основе данных в (A), показывающая распределение эффективного диаметра электромобилей. Результаты, полученные на воздухе (красным цветом: образец зафиксирован и высушен) и в жидкости (синим цветом: нефиксирован). Сокращения: АСМ = атомно-силовая микроскопия; EVs = внеклеточные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Анализ N-PEV с помощью AFM сравнивался с результатами NTA. Эти последние результаты NTA показали распределение диаметров EV от 32 нм до 650 нм, причем подавляющее большинство из них находится в диаметре от 90 до 250 нм. Таким образом, принимая во внимание, что NTA не чувствителен к малым размерам (близким к 50 нм), эти измерения АСМ показывают хорошую корреляцию с этими результатами (дополнительный рисунок S2).
Рамановские эксперименты, которые были реализованы на электромобилях, адсорбированных на голом чипе, показали обнадеживающие результаты; в частности, был получен четкий спектр электромобилей (рис. 9). Спектры комбинационного рассеяния света могут быть разделены на три различных диапазона: область «отпечатков пальцев» (ниже 1,800 см-1), которая содержит пики, образующие молекулярно-специфические паттерны, и, таким образом, является наиболее важной частью для целей идентификации; «биомолчаливая» область (1 800-2 800 см−1), которую обычно отбрасывают при изучении биологических образцов, так как она не содержит пиков; и область «высоких частот», которая в основном содержит информацию о липидах и часто является наиболее интенсивной частью спектра, но менее специфична. Спектр показывает пики, соответствующие главным образом колебаниям CH 2 (2,853 см-1, 1,444 см-1 и 130 см-1), которые связаны с липидами мембраны EV и пиком, соответствующим аминокислотефенилаланин 21. Таблицу распределения пиков комбинационного рассеяния распространенных молекул, присутствующих в электромобилях, можно найти в статье Penders et al.22.
Рисунок 9: Характеристика рамановской спектроскопии электромобилей на биочипе. Здесь образец EV был получен из культуры HMEC и восстановлен центрифугированием при 20 000 × г. (A) Пример рамановского изображения электромобилей, адсорбированных на голом биочипе (средняя интенсивность), наложенного на изображение светлого поля. (B) Пример измеренных рамановских спектров электромобилей. Пунктирные линии соответствуют идентифицированным вибрациям. α, ножницы; τ, скручивание; υ, растяжение (s, симметричное; as, асимметричное). Масштабная линейка = (A) 50 мкм. Сокращения: EVs = внеклеточные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Измерения N-PEV с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA). Электромобили были разбавлены в PBS; эксперименты проводились в трех экземплярах с использованием прибора MALVERN NS300. Средний диаметр = 137,5 нм ± 1,3 нм; диаметр моды = 104,9 нм ± 13,3 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Вестерн-блоттинг N-PEV. N-PEV (1) и (2) соответствуют двум партиям N-PEV, приготовленным из двух карманов концентрата тромбоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее широко используемыми методами идентификации ВВ являются белково-специфический иммуноблоттинг для подтверждения происхождения ВВ, ПЭМ для подтверждения их структуры и НТА для количественной оценки их количества и распределения по размерам в объемеобразца 3. Тем не менее, высокий интерес к электромобилям в (био)медицинских исследованиях и ограниченность существующих аналитических инструментов побудили научное сообщество разработать новые методы характеристики, дискриминации и количественной оценки электромобилей.
Большинство разработок сосредоточено на сочетании принципов иммуномаркировки или иммунозахвата с передовыми физическими методами обнаружения EV. Некоторые из этих подходов сосредоточены на идентификации отдельных электромобилей для получения максимально достоверных данных в масштабе нанообъектов. Другие больше озабочены предложением глобальных методов, которые являются доступными и надежными для клинического использования.
Платформа NBA, которая сочетает в себе биодетекцию EV на мультиплексированной золотой подложке и характеристику AFM, обеспечивает глубокую квалификацию нановезикул, присутствующих в сложных биологических жидкостях. Действительно, из-за селективности биочипа можно вводить сырые образцы, а также выделять вклад везикул.
Предлагаемый подход заключается в характеристике ЭВ, адсорбированных/привитых или захваченных аффинностью на грубой золотой подложке. АСМ, который обычно используется на атомарно плоских подложках, по-прежнему демонстрирует оптимальную производительность на необработанном золотом чипе, выявляя различные интерфейсы, которые являются микро/наноструктурированными.
Мультиплексный биочип, представляющий несколько точек для сканирования (до 16 до сих пор), и подход NBA для фиксированных и высушенных образцов были разработаны, чтобы сократить время, необходимое для глубокого и высокоразрешающего исследования АСМ каждого пятна. Различные испытания, проведенные в лаборатории, показали, что эта процедура (фиксация, сушка и визуализация на воздухе) не оказывает существенного влияния на метрологию электромобилей.
В этом подходе есть два основных критических шага: поиск компромисса для выбора наилучшей чувствительности чипа для всех различных трансплантированных лигандов и диссоциация EV от субстрата в конце после инъекции. Здесь была использована машина SPRi, работающая с одним единственным углом резонанса, что указывает на то, что должен быть выбран наилучший компромисс в плазмонном отклике для всех пятен лигандов. Для некоторых лигандов обнаружение будет очень чувствительным (близким к оптимальному углу); Для других обнаружение будет менее чувствительным, если значение фиксированного угла отличается от оптимального угла. Это может быть преодолено с помощью контрольно-измерительных приборов SPRi последнего поколения, которые обеспечивают до 10 различных рабочих углов.
Вторым важным этапом является диссоциация EV от субстрата после инъекции. Если диссоциация слишком высока (потому что EV присутствуют, например, только несколько специфических белков на их поверхности), впоследствии будет невозможно сканировать с помощью AFM. Такие ситуации очень редки, но когда они возникают, скорость потока и продолжительность впрыска должны быть оптимизированы для решения проблемы.
Ограничением предлагаемого метода может быть отсутствие репрезентативности корреляции между наблюдениями АСМ с мм²-площадью взаимодействий ЭВ на биочипе. Для этого необходимо сканировать различные области на месте, в том числе от больших площадей до небольших участков и в разных местах внутри пятна. В идеале сканирование должно выполняться в области ROI для хорошей корреляции между характеристикой AFM и ответом SPRi.
В других работах авторы этого исследования использовали оптическое обнаружение и цифровой подсчет отдельных электромобилей, которые основаны на интерферометрической визуализации электромобилей, захваченных на биофункционализированной кремниевой подложке. Этот метод позволяет оценить размер электромобилей из-за наблюдаемого контраста. Эта платформа, таким образом, позволила, используя обильные маркеры CD9, CD63 и CD81, мультиплексировать анализ и обнаруживать присутствие EV, экспрессирующих нейрональный маркер CD171, в спинномозговой жидкости у людей24.
Этот комбинированный подход без маркировки, поддерживаемый строгой методологией подготовки биочипа и в режиме сбора данных AFM, представляет собой метод выбора для характеристики электромобилей путем их захвата в режиме реального времени и в потоке даже в сложных и сырых образцах. Действительно, в представленном методе не требуется никаких преаналитических шагов с образцом, а также этапов маркировки или демаскирования. В литературе Ertsgaard et al. выявили различные распространенные мембранные маркеры EV с использованием интерферометрического датчика отражения одной частицы (SP-IRIS), но в статическом режиме (без потока) без измерений кинетики, и дали только оценку размера EV25.
Благодаря этой оптимизированной процедуре, позволяющей готовить реактивные, контролируемые биоинтерфейсы и пассивированные мультиплексированные биочипы, подмножества EV могут быть глубоко охарактеризованы при их введении в виде сырых образцов. Эти различные элементы делают эту платформу NBA очень актуальным методом для прямого, глубокого и разрешенного анализа EV в образцах сырой нефти.
Спектроскопия, и особенно поверхностно-усиленная рамановская спектроскопия (SERS), становится методом выбора для биохимического анализа слабо экспрессируемых биомаркеров EV. Эта стратегия позволила разработать мультиплексные анализы с чувствительностью в несколько десятков EV на мкл. Визуализация SERS в сочетании с методами сортировки (например, диэлектрофорезом) делает возможным высокопроизводительный анализ состава EV26.
В этой работе рамановские эксперименты, проведенные на золотых биочипах, также были очень обнадеживающими, поскольку был получен четкий спектр EV, что дало представление об их молекулярном составе. Будущие разработки могут также включать SERS для увеличения сигнала, поступающего от электромобилей на поверхности биочипа, и рамановскую спектроскопию с улучшенным наконечником (TERS) для получения изображений с нанометрическим разрешением, что позволит охарактеризовать один электромобиль.
Недавние разработки в лаборатории были сделаны для улучшения чувствительности биодетекции и дискриминации между подмножествами EV, которые сосуществуют в образце и потенциально взаимодействуют на одних и тех же массивах. Для повышения чувствительности эксперименты переводятся на систему SPRi, которая позволяет выбирать несколько углов для обнаружения EV в разных точках. Чтобы улучшить различение подмножеств EV, необходимо решить различные задачи: i) получение спектроскопической рамановской сигнатуры каждого подмножества EV на биочипе, ii) увеличение количества пятен, идентифицированных на биочипе (с 16 до 100), и iii) увеличение пропускной способности анализа с использованием высокоскоростного AFM (HS AFM). Кроме того, HS AFM также позволит быстро и в жидких условиях характеризовать подмножества электромобилей.
Некоторые другие моменты, на которые следует обратить внимание, заключаются в том, что если гидрофильность золотого биочипа высока, существует риск того, что пятна лигандов будут перекрываться и смешиваться друг с другом (как показано на рисунке 4B). Необходимо избегать впрыска пузырьков воздуха во время впрыска растворов под SPRi, так как это приведет к изменению отражательной способности и будет способствовать неправильному мониторингу сигнала SPRi.
При сканировании поверхностей с помощью АСМ необходимо наблюдать за изображениями, чтобы проверить, нет ли резких изменений в сумме значений или есть ли артефакты (например, повторяющееся появление объектов). Это может быть связано с загрязнением наконечника AFM; В этом случае наконечник нуждается в замене.
Есть несколько ограничений техники, которые мы наблюдали: выбранная чувствительность чипа для всех различных трансплантированных лигандов не является оптимальной для всех из них; диссоциация ЭВ от субстрата в конце инъекции; и более низкое разрешение (чем АСМ) рамановской визуализации, что не позволяет визуализировать отдельные электромобили.
Несмотря на ограничения, этот протокол имеет много существенных преимуществ по отношению к существующим методам. Сочетание методов без меток (SPRi + AFM + рамановская спектроскопия) на одной и той же подложке, а затем на одном и том же биологическом образце позволяет избежать смещения между анализами из-за субстрата и придает высокую оригинальность и достоверность анализу подмножеств EV.
Такая спроектированная аналитическая платформа может помочь в характеристике EV в различных контекстах, например, в области диагностики и бесклеточной биотерапии, а также биожидкостей из крови в клеточные супернатанты. В дополнение к квалификации EV, другие нанообъекты (например, молекулярные комплексы, синтетические наночастицы, вирусы) могут быть охарактеризованы этой мультимодальной аналитической платформой.
Несмотря на большое разнообразие методов, разработанных и реализованных в сообществе электромобилей, каждый из этих методов имеет свой собственный потенциал и различия в производительности с точки зрения динамического диапазона, точности, пропускной способности и применения для анализа конкретных параметров электромобилей26. Инновационные, сверхчувствительные и многоступенчатые подходы (разделение, отбор, спектральная сигнатура и анализ везикулярного содержимого), такие как эта мультимодальная аналитическая платформа, даже при применении к небольшим объемам на чипах (лаборатория на чипе), открывают новые перспективы в области жидкостной биопсии, биомониторинга и прецизионной медицины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Келли Обертен (Kelly Aubertin) и Фабьен Пико (Fabien Picot) из основного центра IVETh (Париж) получили признание за эксперименты по рамановской визуализации. Тьерри Бурнуф (Тайбэйский медицинский университет, Тайвань) и Зузана Крупова (из Хелинкура, Франция) получили признание за предоставление образцов EV, полученных из образцов тромбоцитов крови и бычьего молока соответственно. Работа была поддержана регионом Бургундия Франш-Конте и аспирантурой EUR EIPHI (проект NOVICE, 2021-2024). Часть этой работы была выполнена с использованием платформы CLIPP и в чистых помещениях RENATECH в FEMTO-ENGINEERING, за что мы благодарим Рабаха Зеггари.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France) | 3450 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumine antibody | Sigma | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
| Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
| Sodium acetate buffer | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
References
- Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).
- Xunian, Z., Kalluri, R. Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes. Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).
- Hartjes, T. A., et al. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
- Xing, Y., et al. Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms. Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).
- Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations. Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).
- Boireau, W., Elie-Caille, C. Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization. Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).
- Brisson, A. R., et al. Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study. Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).
- Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., Pétry, J. Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy. Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006 (2017).
- Beekman, P., et al. Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy. Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).
- Malenica, M., et al. Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids. Biomedicines. 9 (6), 603 (2021).
- Verweij, F. J., et al. The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo. Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Obeid, S., et al. NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).
- Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for «on-chip» qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).
- Ridolfi, A., et al. AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles. Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).
- Vorselen, D., et al. The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis. Nature Communications. 9 (1), 4960 (2018).
- Hardij, J., et al. Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045 (2013).
- Jorgensen, M., et al. Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920 (2013).
- Remy-Martin, F., et al. Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).
- Czamara, K., et al. Raman spectroscopy of lipids: A review. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).
- Penders, J., et al. Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers. ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).
- Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing. Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).
- Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Scientific Reports. 6, 37246 (2016).
- Ertsgaard, C. T., et al. Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles. Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
