Sebrafisk larver som en modell for å evaluere potensielle radiosensibilisatorer eller beskyttere

Summary

Sebrafisken har nylig blitt utnyttet som en modell for å validere potensielle strålingsmodifikatorer. Denne protokollen beskriver de detaljerte trinnene for å bruke sebrafiskembryoer til strålingsbaserte screeningeksperimenter og noen observasjonsmetoder for å evaluere effekten av ulike behandlinger og stråling.

Abstract

Sebrafisk er mye brukt i flere typer forskning fordi de er en av de lett vedlikeholdte virveldyrmodellene og viser flere funksjoner i et unikt og praktisk modellsystem. Siden svært proliferative celler er mer utsatt for strålingsindusert DNA-skade, er sebrafiskembryoer en frontlinje in vivo-modell i strålingsforskning. I tillegg projiserer denne modellen effekten av stråling og ulike medikamenter i løpet av kort tid, sammen med store biologiske hendelser og tilhørende responser. Flere kreftstudier har brukt sebrafisk, og denne protokollen er basert på bruk av strålemodifikatorer i sammenheng med strålebehandling og kreft. Denne metoden kan lett brukes til å validere effekten av forskjellige legemidler på bestrålte og kontrollembryoer (ikke-bestrålt), og dermed identifisere stoffer som radiosensibiliserende eller beskyttende stoffer. Selv om denne metoden brukes i de fleste narkotikascreeningseksperimenter, er detaljene i forsøket og toksisitetsvurderingen med bakgrunn av røntgenstrålingseksponering begrenset eller bare kort adressert, noe som gjør det vanskelig å utføre. Denne protokollen løser dette problemet og diskuterer prosedyren og toksisitetsevalueringen med en detaljert illustrasjon. Prosedyren beskriver en enkel tilnærming for bruk av sebrafiskembryoer til strålestudier og strålebasert legemiddelscreening med stor pålitelighet og reproduserbarhet.

Introduction

Sebrafisk (Danio rerio) er en velkjent dyremodell som har vært mye brukt i forskning de siste 3 tiårene. Det er en liten ferskvannsfisk som er lett å oppdrette og avle under laboratorieforhold. Sebrafisken har vært mye brukt i ulike utviklings- og toksikologiske studier 1,2,3,4,5,6,7,8. Sebrafisken har høy fruktbarhet og kort embryonal generasjon; Embryoene er egnet for å spore forskjellige utviklingsstadier, er visuelt gjennomsiktige og er mottagelige for varianter av genetisk manipulasjon og screeningsplattformer^med høy gjennomstrømning 9,10,11,12,13,14. Dessuten gir sebrafisken in toto og levende bildebehandling for hvilken dens utviklingsprosess og forskjellige deformiteter i nærvær av forskjellige giftige stoffer eller faktorer lett kan studeres ved hjelp av stereo eller fluorescerende mikroskopi 7,15,16.

Strålebehandling er en av de viktigste terapeutiske modusene som brukes i behandling av kreft 17,18,19,20,21,22,23,24. Imidlertid krever kreftstrålebehandling potensielle radioprotektorer for å beskytte normale friske celler mot å dø mens de dreper ondartede celler eller beskytter menneskers helse under behandling som involverer høyenergistrålinger 25,26,27,28,29. Omvendt blir potente radiosensibilisatorer også undersøkt for å øke effektiviteten av stråling for å drepe ondartede celler, spesielt i målrettede og presisjonsterapier^30,31,32,33. Derfor, for å validere potente radioprotektorer og sensibilisatorer, er en modell egnet for semi-high-throughput medikamentscreening og målbart utstilling av strålingseffekter svært etterspurt. Flere tilgjengelige modeller brukes i strålestudier og er involvert i narkotikascreeningsforsøk. Imidlertid er høyere vertebrater og til og med den mest brukte in vivo-modellen, mus, uegnet for storskala legemiddelscreening fordi det er tidkrevende, kostbart og utfordrende å designe slike screeningseksperimenter med disse modellene. På samme måte er cellekulturmodeller ideelle for varianter av narkotikascreeningseksperimenter med høy gjennomstrømning^34,35. Imidlertid er eksperimenter som involverer cellekultur ikke alltid pragmatiske, svært reproduserbare eller pålitelige, da celler i kultur kan markert endre deres oppførsel i henhold til vekstbetingelsene og kinetikken. Også varianter av celletyper viser differensiell strålingssensibilisering. Spesielt representerer 2D- og 3D-cellekultursystemer ikke hele organismescenariet, og dermed kan de oppnådde resultatene ikke rekapitulere det faktiske nivået av radiotoksisitet^36,37. I denne forbindelse gir sebrafisken flere fordeler ved screening for nye radiosensibilisatorer og radioprotektorer. Den enkle håndteringen, stor clutchstørrelse, kort levetid, rask embryonal utvikling, embryogjennomsiktighet og liten kroppsstørrelse gjør sebrafisken til en egnet modell for storskala legemiddelscreening. På grunn av de ovennevnte fordelene kan eksperimenter lett gjentas på kort tid, og effekten kan lett observeres under et dissekerende mikroskop i flerbrønnsplater. Derfor blir sebrafisken stadig mer populær i narkotikascreeningsforskning som involverer strålingsstudier^38,39.

Potensialet til sebrafisk som en bonafide modell for å skjerme strålingsmodifikatorer har blitt demonstrert i ulike studier 40,41,42,43,44,45. Den radiobeskyttende effekten av potensielle radiomodifikatorer, som nanopartikkel DF1, amifostin (WR-2721), DNA-reparasjonsproteiner KU80 og ATM, og transplanterte hematopoietiske stamceller, og effekten av radiosensibilisatorer, som flavopiridol og AG1478, i sebrafiskmodellen er rapportert 19,41,42,43,44,45,46 . Ved hjelp av det samme systemet ble den radioprotektive effekten av DF-1 (fullerene nanopartikkel) vurdert både på systemisk og organspesifikt nivå, og også bruken av sebrafiskembryoer for radioprotektorscreening ble videre utforsket⁴⁷. Nylig ble Kelulut-honningen rapportert som en radiobeskytter i sebrafiskembryoer og ble funnet å øke embryooverlevelsen og forhindre organspesifikk skade, cellulær DNA-skade og apoptose⁴⁸.

På samme måte ble de radioprotektive effektene av polymerer generert via Hantzschs reaksjon kontrollert på sebrafiskembryoer i en høy gjennomstrømningsscreening, og beskyttelsen ble hovedsakelig gitt ved å beskytte celler mot DNA-skade⁴⁹. I en av de tidligere studiene ble det lipofile statinfluvastatinet funnet som en potensiell radiosensibilisator ved bruk av sebrafiskmodellen med denne tilnærmingen⁵⁰. Tilsvarende anses gull nanopartikler å være en ideell radiosensibilisator og har blitt brukt i mange studier^51,52.

Den embryonale utviklingen i sebrafisk innebærer spaltning i de første 3 timene hvor en encellet zygote deler seg for å danne 2 celler, 4 celler, 8 celler, 16 celler, 32 celler og 64 celler som lett identifiseres med et stereomikroskop. Deretter oppnår den blastulastadiet med 128 celler (2,25 timer etter befruktning, hpf), hvor cellene dobles hvert 15. minutt og fortsetter gjennom følgende stadier: 256 celler (2,5 hpf), 512 celler (2,75 hpf) og når 1000+ celler på bare 3 timer (figur 1). Ved 4 timer oppnår egget kuletrinnet, etterfulgt av dannelsen av en kuppelform i embryonalmassen 7,53,54. Gastruleringen i sebrafisk starter fra 5,25 hpf⁵⁴, hvor den når skjoldstadiet. Skjoldet indikerer tydelig den raske konvergensbevegelsen av cellene til den ene siden av kimringen (figur 1) og er en fremtredende og distinkt fase av gastrulaterende embryoer som lett kan identifiseres^53,54. Selv om strålingseksponering for embryoer kan gjøres på et hvilket som helst stadium av utviklingen, kan strålingseksponering under gastrulering ha tydeligere morfologiske endringer som muliggjør bedre avlesninger av strålingsinduserte toksisiteter⁵⁵; På samme måte kan administrasjon av legemidler til embryoer startes så tidlig som 2 HPF⁵⁴.

Protocol

Denne studien ble gjennomført med forhåndsgodkjenning fra og etter retningslinjene fra Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar. Alt vedlikehold og avl av sebrafisk ble utført ved et omgivende fiskekulturanlegg ved 28,5 °C, og embryoene ble opprettholdt i en biologisk oksygenbehov (BOD) inkubator ved en temperatur på 28,5 °C. Her ble sebrafiskens AB-stamme brukt, og iscenesettelsen ble utført i henhold til Kimmel et al.54. Røntgenstråling ble gitt v…

Representative Results

Den generelle utformingen av protokollen er vist i figur 2. Effekten av stråling og karakteriseringen på en doseavhengig måte ble evaluert med følgende analyser. Vurdering av røntgenindusert toksisitetVed hjelp av et stereomikroskop ble følgende abnormiteter vurdert og karakterisert etter medikamentell behandling og / eller stråling. I henhold til OECDs retningslinjer 61, for toksisitetsevaluering hos fisk, ble fire sto…

Discussion

Sebrafisk brukes som verdifulle modeller i mange studier, inkludert flere typer kreftforskning. Denne modellen gir en nyttig plattform for storskala narkotikascreening^67,68. Som enhver annen toksisitetsevalueringsmetode er den kvantitative evalueringen av de store biologiske endringene ved stråling og / eller medikamentell behandling den mest avgjørende delen av denne protokollen. I slike studier må overlevelse ikke være det eneste kriteriet for å observere …

Materials

6 Well plates	Corning	CLS3335	Polystyrene
B.O.D Incubator	Oswald	JRIC-10
Calcium Chloride	Fisher Scientific	10101-41-4
Dissecting Microscope	Zeiss	Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTE	Polycarbonate
Glass petriplates	Borosil	3165A75	Glass
GraphpadPrism	GraphPad Software, Inc.		Version 5.01
Kline concavity slides	Himedia	GW092-1PK	Glass
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Methylene blue hydrate	Sigma-Aldrich	66720-100G
Parafilm	Tarsons	380020	Paraffin film
Pasteur pipettes	Himedia	PW1212-1X500NO	Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTI	Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTD	Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTL	Polycarbonate
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet	SRL	1949181
Stereo Microscope Leica M205FA	Leica	Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray	Precision X-Ray	X-RAD 225XL