Larve di pesce zebra come modello per valutare potenziali radiosensibilizzanti o protettori

Summary

Il pesce zebra è stato recentemente sfruttato come modello per convalidare potenziali modificatori di radiazioni. Il presente protocollo descrive i passaggi dettagliati per utilizzare embrioni di zebrafish per esperimenti di screening basati su radiazioni e alcuni approcci osservazionali per valutare l’effetto di diversi trattamenti e radiazioni.

Abstract

Il pesce zebra è ampiamente utilizzato in diversi tipi di ricerca perché è uno dei modelli di vertebrati di facile manutenzione e presenta diverse caratteristiche di un sistema modello unico e conveniente. Poiché le cellule altamente proliferative sono più suscettibili ai danni al DNA indotti dalle radiazioni, gli embrioni di zebrafish sono un modello in vivo di prima linea nella ricerca sulle radiazioni. Inoltre, questo modello proietta l’effetto delle radiazioni e di diversi farmaci in un breve lasso di tempo, insieme ai principali eventi biologici e alle risposte associate. Diversi studi sul cancro hanno utilizzato il pesce zebra e questo protocollo si basa sull’uso di modificatori di radiazioni nel contesto della radioterapia e del cancro. Questo metodo può essere facilmente utilizzato per convalidare gli effetti di diversi farmaci su embrioni irradiati e di controllo (non irradiati), identificando così i farmaci come farmaci radiosensibilizzanti o protettivi. Sebbene questa metodologia sia utilizzata nella maggior parte degli esperimenti di screening farmacologico, i dettagli dell’esperimento e la valutazione della tossicità con lo sfondo dell’esposizione alle radiazioni a raggi X sono limitati o solo brevemente affrontati, rendendone difficile l’esecuzione. Questo protocollo affronta questo problema e discute la procedura e la valutazione della tossicità con un’illustrazione dettagliata. La procedura descrive un approccio semplice per l’utilizzo di embrioni di zebrafish per studi di radioterapia e screening farmacologico basato su radiazioni con molta affidabilità e riproducibilità.

Introduction

Il pesce zebra (Danio rerio) è un noto modello animale che è stato ampiamente utilizzato nella ricerca negli ultimi 3 decenni. È un piccolo pesce d’acqua dolce facile da allevare e allevare in condizioni di laboratorio. Il pesce zebra è stato ampiamente utilizzato per vari studi sullo sviluppo e tossicologici 1,2,3,4,5,6,7,8. Il pesce zebra ha un’elevata fecondità e una breve generazione embrionale; Gli embrioni sono adatti a seguire le diverse fasi di sviluppo, sono visivamente trasparenti e sono suscettibili di manipolazioni genetiche e piattaforme di screening ad alto rendimento 9,10,11,12,13,14. Inoltre, il pesce zebra fornisce immagini in toto e dal vivo per le quali il suo processo di sviluppo e le diverse deformità in presenza di varie sostanze o fattori tossici possono essere facilmente studiati utilizzando la microscopia stereoscopica o fluorescente 7,15,16.

La radioterapia è una delle principali modalità terapeutiche utilizzate nel trattamento del cancro 17,18,19,20,21,22,23,24. Tuttavia, la radioterapia del cancro richiede potenziali radioprotettori per proteggere le cellule sane normali dalla morte mentre uccidono le cellule maligne o salvaguardare la salute umana durante la terapia che coinvolge radiazioni ad alta energia 25,26,27,28,29. Al contrario, potenti radiosensibilizzanti sono anche in fase di studio per aumentare l’efficienza delle radiazioni nell’uccidere le cellule maligne, specialmente nelle terapie mirate e di precisione^30,31,32,33. Pertanto, per convalidare potenti radioprotettori e sensibilizzanti, è molto richiesto un modello adatto per lo screening di farmaci a semi-alto rendimento e che mostri in modo misurabile gli effetti delle radiazioni. Diversi modelli disponibili sono utilizzati negli studi sulle radiazioni e coinvolti negli esperimenti di screening farmacologico. Tuttavia, i vertebrati superiori e anche il modello in vivo più comunemente usato, i topi, non sono adatti per lo screening farmacologico su larga scala perché è dispendioso in termini di tempo, costoso e impegnativo progettare tali esperimenti di screening con questi modelli. Allo stesso modo, i modelli di coltura cellulare sono ideali per varietà di esperimenti di screening farmacologico ad alto rendimento^34,35. Tuttavia, gli esperimenti che coinvolgono la coltura cellulare non sono sempre pragmatici, altamente riproducibili o affidabili poiché le cellule in coltura possono cambiare notevolmente il loro comportamento in base alle condizioni di crescita e alla cinetica. Inoltre, varietà di tipi cellulari mostrano una sensibilizzazione differenziale alle radiazioni. In particolare, i sistemi di coltura cellulare 2D e 3D non rappresentano lo scenario dell’intero organismo e, pertanto, i risultati ottenuti potrebbero non ricapitolare l’effettivo livello di radiotossicità^36,37. A questo proposito, il pesce zebra offre diversi vantaggi nello screening di nuovi radiosensibilizzanti e radioprotettori. La facilità d’uso, le grandi dimensioni della covata, la breve durata della vita, il rapido sviluppo embrionale, la trasparenza dell’embrione e le piccole dimensioni del corpo rendono il pesce zebra un modello adatto per lo screening farmacologico su larga scala. Grazie ai vantaggi di cui sopra, gli esperimenti possono essere facilmente ripetuti in breve tempo e l’effetto può essere osservato facilmente al microscopio da dissezione in piastre a più pozzetti. Quindi, il pesce zebra sta guadagnando popolarità nella ricerca sullo screening dei farmaci che coinvolge studi sulle radiazioni^38,39.

Il potenziale del pesce zebra come modello in buona fede per lo screening dei modificatori delle radiazioni è stato dimostrato in vari studi 40,41,42,43,44,45. L’effetto radioprotettivo di potenziali radiomodificatori, come la nanoparticella DF1, l’amifostina (WR-2721), le proteine di riparazione del DNA KU80 e ATM e le cellule staminali ematopoietiche trapiantate, e gli effetti dei radiosensibilizzanti, come flavopiridol e AG1478, nel modello di zebrafish sono stati riportati 19,41,42,43,44,45,46 . Utilizzando lo stesso sistema, è stato valutato l’effetto radioprotettivo di DF-1 (nanoparticella di fullerene) sia a livello sistemico che organo-specifico, ed è stato ulteriormente esplorato anche l’uso di embrioni di pesce zebra per lo screening radioprotettore⁴⁷. Recentemente, il miele di Kelulut è stato segnalato come radioprotettore negli embrioni di zebrafish ed è stato scoperto che aumenta la sopravvivenza dell’embrione e previene il danno organo-specifico, il danno al DNA cellulare e l’apoptosi⁴⁸.

Allo stesso modo, gli effetti radioprotettivi dei polimeri generati tramite la reazione di Hantzsch sono stati verificati su embrioni di zebrafish in uno screening ad alto rendimento e la protezione è stata conferita principalmente proteggendo le cellule dai danni al DNA⁴⁹. In uno degli studi precedenti, la statina lipofila fluvastatina è stata trovata come potenziale radiosensibilizzante utilizzando il modello del pesce zebra con questo approccio⁵⁰. Allo stesso modo, le nanoparticelle d’oro sono considerate un radiosensibilizzante ideale e sono state utilizzate in molti studi^51,52.

Lo sviluppo embrionale nel pesce zebra comporta la scissione nelle prime 3 ore in cui uno zigote unicellulare si divide per formare 2 cellule, 4 cellule, 8 cellule, 16 cellule, 32 cellule e 64 cellule che sono facilmente identificabili con uno stereomicroscopio. Quindi, raggiunge lo stadio di blastula con 128 cellule (2,25 h post-fecondazione, hpf), dove le cellule raddoppiano ogni 15 minuti e procedono attraverso queste seguenti fasi: 256 cellule (2,5 hpf), 512 cellule (2,75 hpf) e raggiungendo 1.000+ cellule in sole 3 ore (Figura 1). A 4 ore, l’uovo raggiunge lo stadio di sfera, seguito dalla formazione di una forma a cupola nella massa embrionale 7,53,54. La gastrulazione nel pesce zebra parte da 5,25 hpf⁵⁴, dove raggiunge lo stadio di scudo. Lo scudo indica chiaramente il rapido movimento di convergenza delle cellule su un lato dell’anello germinale (Figura 1) ed è una fase prominente e distinta degli embrioni gastrulanti che può essere facilmente identificata^53,54. Sebbene l’esposizione alle radiazioni agli embrioni possa essere effettuata in qualsiasi fase del loro sviluppo, l’esposizione alle radiazioni durante la gastrulazione potrebbe avere cambiamenti morfologici più distinti che facilitano una migliore lettura delle tossicità indotte dalle radiazioni⁵⁵; Allo stesso modo, la somministrazione di farmaci agli embrioni può essere iniziata già a partire da 2 HPF⁵⁴.

Protocol

Il presente studio è stato condotto con la previa approvazione e seguendo le linee guida dell’Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar. Tutti gli interventi di mantenimento e riproduzione del pesce zebra sono stati condotti in un impianto di coltura a temperatura ambiente a 28,5 °C e gli embrioni sono stati mantenuti in un’incubatrice a domanda biologica di ossigeno (BOD) a una temperatura di 28,5 °C. In questo caso, è stato utilizzato il ceppo AB del pesce zebra e la stadiazio…

Representative Results

Il layout generale del protocollo è illustrato nella Figura 2. L’effetto delle radiazioni e la caratterizzazione in modo dose-dipendente sono stati valutati con le seguenti analisi. Valutazione delle tossicità indotte dai raggi XUtilizzando uno stereomicroscopio, le seguenti anomalie sono state valutate e caratterizzate dopo il trattamento farmacologico e/o la radioterapia. Secondo le linee guida dell’OCSE 61, per la valutaz…

Discussion

I pesci zebra sono usati come modelli preziosi in molti studi, tra cui diversi tipi di ricerca sul cancro. Questo modello fornisce un’utile piattaforma per lo screening dei farmaci su larga scala^67,68. Come qualsiasi altro metodo di valutazione della tossicità, la valutazione quantitativa dei principali cambiamenti biologici in seguito a radiazioni e/o trattamento farmacologico è la parte più cruciale di questo protocollo. In questo tipo di studi, la sopravviv…

Materials

6 Well plates	Corning	CLS3335	Polystyrene
B.O.D Incubator	Oswald	JRIC-10
Calcium Chloride	Fisher Scientific	10101-41-4
Dissecting Microscope	Zeiss	Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTE	Polycarbonate
Glass petriplates	Borosil	3165A75	Glass
GraphpadPrism	GraphPad Software, Inc.		Version 5.01
Kline concavity slides	Himedia	GW092-1PK	Glass
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Methylene blue hydrate	Sigma-Aldrich	66720-100G
Parafilm	Tarsons	380020	Paraffin film
Pasteur pipettes	Himedia	PW1212-1X500NO	Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTI	Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTD	Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTL	Polycarbonate
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet	SRL	1949181
Stereo Microscope Leica M205FA	Leica	Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray	Precision X-Ray	X-RAD 225XL