Zebra balığı son zamanlarda potansiyel radyasyon değiştiricilerini doğrulamak için bir model olarak kullanılmıştır. Mevcut protokol, radyasyona dayalı tarama deneyleri için zebra balığı embriyolarını kullanmanın ayrıntılı adımlarını ve farklı tedavilerin ve radyasyonun etkisini değerlendirmek için bazı gözlemsel yaklaşımları açıklamaktadır.
Zebra balıkları, bakımı kolay omurgalı modellerinden biri oldukları ve benzersiz ve kullanışlı bir model sisteminin çeşitli özelliklerini sergiledikleri için çeşitli araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Yüksek oranda proliferatif hücreler radyasyona bağlı DNA hasarına karşı daha duyarlı olduklarından, zebra balığı embriyoları radyasyon araştırmalarında in vivo modelde ön saflarda yer almaktadır. Ayrıca bu model, radyasyon ve farklı ilaçların etkisini, büyük biyolojik olaylar ve ilişkili tepkilerle birlikte kısa sürede yansıtmaktadır. Birkaç kanser çalışması zebra balığı kullanmıştır ve bu protokol, radyoterapi ve kanser bağlamında radyasyon değiştiricilerin kullanımına dayanmaktadır. Bu yöntem, farklı ilaçların ışınlanmış ve kontrol (ışınlanmamış) embriyolar üzerindeki etkilerini doğrulamak için kolayca kullanılabilir, böylece ilaçları radyo duyarlılaştırıcı veya koruyucu ilaçlar olarak tanımlar. Bu metodoloji çoğu ilaç tarama deneyinde kullanılmasına rağmen, deneyin ayrıntıları ve X-ışını radyasyonuna maruz kalmanın arka planı ile toksisite değerlendirmesi sınırlıdır veya sadece kısaca ele alınmaktadır, bu da gerçekleştirilmesini zorlaştırmaktadır. Bu protokol bu sorunu ele alır ve prosedür ve toksisite değerlendirmesini ayrıntılı bir örnekle tartışır. Prosedür, zebra balığı embriyolarının radyasyon çalışmaları ve radyasyona dayalı ilaç taraması için çok güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde kullanılması için basit bir yaklaşımı açıklamaktadır.
Zebra balığı (Danio rerio), son 3 yılda araştırmalarda yaygın olarak kullanılan iyi bilinen bir hayvan modelidir. Laboratuvar koşullarında yetiştirilmesi ve üremesi kolay olan küçük bir tatlı su balığıdır. Zebra balığı, çeşitli gelişimsel ve toksikolojik çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3,4,5,6,7,8. Zebra balığı yüksek doğurganlığa ve kısa embriyonik üretime sahiptir; Embriyolar farklı gelişim aşamalarını izlemek için uygundur, görsel olarak şeffaftır ve genetik manipülasyon çeşitlerine ve yüksek verimli tarama platformlarınauygundur 9,10,11,12,13,14. Ayrıca, zebra balığı, gelişim sürecinin ve çeşitli toksik maddelerin veya faktörlerin varlığında farklı deformitelerin stereo veya floresan mikroskopi 7,15,16 kullanılarak kolayca incelenebildiği toto ve canlı görüntüleme sağlar.
Radyoterapi, kanser tedavisinde kullanılan başlıca terapötik modlardan biridir 17,18,19,20,21,22,23,24. Bununla birlikte, kanser radyoterapisi, kötü huylu hücreleri öldürürken normal sağlıklı hücrelerin ölmesini önlemek veya yüksek enerjili radyasyonlar içeren tedavi sırasında insan sağlığını korumak için potansiyel radyoprotektörler gerektirir 25,26,27,28,29. Tersine, özellikle hedefli ve hassas tedavilerde kötü huylu hücreleri öldürmek için radyasyonun etkinliğini artırmak için güçlü radyosensitizörler de araştırılmaktadır30,31,32,33. Bu nedenle, güçlü radyoprotektörleri ve hassaslaştırıcıları doğrulamak için, yarı yüksek verimli ilaç taraması için uygun ve ölçülebilir radyasyon etkileri sergileyen bir model şiddetle talep edilmektedir. Radyasyon çalışmalarında mevcut birkaç model kullanılır ve ilaç tarama deneylerinde yer alır. Bununla birlikte, daha yüksek omurgalılar ve hatta en yaygın olarak kullanılan in vivo model olan fareler, büyük ölçekli ilaç taraması için uygun değildir, çünkü bu modellerle bu tür tarama deneylerini tasarlamak zaman alıcı, maliyetli ve zordur. Benzer şekilde, hücre kültürü modelleri, yüksek verimli ilaç tarama deneylerinin çeşitleri için idealdir34,35. Bununla birlikte, hücre kültürünü içeren deneyler her zaman pragmatik, yüksek oranda tekrarlanabilir veya güvenilir değildir, çünkü kültürdeki hücreler büyüme koşullarına ve kinetiğine göre davranışlarını önemli ölçüde değiştirebilir. Ayrıca, hücre tiplerinin çeşitleri diferansiyel radyasyon duyarlılığı gösterir. Özellikle, 2D ve 3D hücre kültürü sistemleri tüm organizma senaryosunu temsil etmez ve bu nedenle elde edilen sonuçlar gerçek radyotoksisiteseviyesini özetlemeyebilir 36,37. Bu bağlamda, zebra balığı yeni radyosensitizörler ve radyoprotektörler için taramada çeşitli avantajlar sağlar. Kullanım kolaylığı, büyük kavrama boyutu, kısa ömür, hızlı embriyonik gelişim, embriyo şeffaflığı ve küçük vücut boyutu, zebra balığını büyük ölçekli ilaç taraması için uygun bir model haline getirir. Yukarıdaki avantajlardan dolayı, deneyler kısa sürede kolayca tekrarlanabilir ve etki, çok kuyulu plakalarda diseksiyon mikroskobu altında kolayca gözlemlenebilir. Bu nedenle, zebra balığı, radyasyon çalışmalarını içeren ilaç tarama araştırmalarında popülerlik kazanmaktadır38,39.
Zebra balığının iyi niyetli bir model olarak radyasyon değiştiricileri tarama potansiyeli çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir40,41,42,43,44,45. Zebra balığı modelinde nanopartikül DF1, amifostin (WR-2721), DNA onarım proteinleri KU80 ve ATM gibi potansiyel radyo değiştiricilerin ve nakledilen hematopoietik kök hücrelerin radyoprotektif etkisi ve flavopiridol ve AG1478 gibi radyoduyarlılaştırıcıların etkileri bildirilmiştir 19,41,42,43,44,45,46 . Aynı sistem kullanılarak, DF-1’in (fulleren nanopartikül) radyoprotektif etkisi hem sistemik hem de organa özgü seviyelerde değerlendirildi ve ayrıca zebra balığı embriyolarının radyoprotektör taraması için kullanımı daha da araştırıldı47. Son zamanlarda, Kelulut balının zebra balığı embriyolarında bir radyoprotektör olduğu bildirildi ve embriyo sağkalımını arttırdığı ve organa özgü hasarı, hücresel DNA hasarını ve apoptozu önlediği bulundu48.
Benzer şekilde, Hantzsch reaksiyonu yoluyla üretilen polimerlerin radyoprotektif etkileri, yüksek verimli bir taramada zebra balığı embriyoları üzerinde kontrol edildi ve koruma esas olarak hücrelerin DNA hasarındankorunmasıyla sağlandı 49. Önceki çalışmalardan birinde, lipofilik statin fluvastatin, bu yaklaşımla zebra balığı modeli kullanılarak potansiyel bir radyosensitizör olarak bulundu50. Benzer şekilde, altın nanopartiküller ideal bir radyosensitizör olarak kabul edilir ve birçok çalışmada kullanılmıştır51,52.
Zebra balıklarındaki embriyonik gelişim, tek hücreli bir zigotun stereomikroskopla kolayca tanımlanabilen 2 hücre, 4 hücre, 8 hücre, 16 hücre, 32 hücre ve 64 hücre oluşturmak üzere bölündüğü ilk 3 saatte bölünmeyi içerir. Daha sonra, hücrelerin her 15 dakikada bir ikiye katlandığı ve aşağıdaki aşamalardan geçtiği 128 hücre (döllenme sonrası 2.25 saat, hpf) ile blastula aşamasına ulaşır: 256 hücre (2.5 hpf), 512 hücre (2.75 hpf) ve sadece 3 saatte 1.000+ hücreye ulaşır (Şekil 1). 4 saatte, yumurta küre aşamasına ulaşır, ardındanembriyonik kütle 7,53,54’te bir kubbe şekli oluşur. Zebra balığında gastrulasyon, kalkan aşamasına ulaştığı 5.25 hpf54’ten başlar. Kalkan, hücrelerin germ halkasının bir tarafına hızlı yakınsama hareketini açıkça gösterir (Şekil 1) ve kolayca tanımlanabilen gastrülasyon embriyolarının belirgin ve belirgin bir aşamasıdır53,54. Embriyolara radyasyona maruz kalma, gelişimlerinin herhangi bir aşamasında yapılabilse de, gastrulasyon sırasında radyasyona maruz kalma, radyasyonun neden olduğu toksisitelerin daha iyi okunmasını kolaylaştıran daha belirgin morfolojik değişikliklere sahip olabilir55; Benzer şekilde, embriyolara ilaç uygulaması 2 HPF54 gibi erken bir tarihte başlatılabilir.
Zebra balığı, çeşitli kanser araştırmaları da dahil olmak üzere birçok çalışmada değerli modeller olarak kullanılmaktadır. Bu model, büyük ölçekli uyuşturucu taraması için yararlı bir platform sağlar67,68. Diğer tüm toksisite değerlendirme yöntemleri gibi, radyasyon ve/veya ilaç tedavisi ile ilgili önemli biyolojik değişikliklerin nicel olarak değerlendirilmesi bu protokolün en önemli parçasıdır. Bu tür çalışmalarda, tok…
The authors have nothing to disclose.
SS’nin laboratuvarı ve RKS’nin laboratuvarı, Hindistan’daki DBT ve SERB’den gelen hibelerle finanse edilmektedir. APM, Hindistan Hükümeti ICMR bursunun bir alıcısıdır. DP, Hindistan Hükümeti CSIR bursunun bir alıcısıdır. BM, Hindistan Hükümeti DST-Inspire bursunun bir alıcısıdır. Şekil 2 , Biorender (https://biorender.com) kullanılarak oluşturulmuştur.
6 Well plates | Corning | CLS3335 | Polystyrene |
B.O.D Incubator | Oswald | JRIC-10 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | 10101-41-4 | |
Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTE | Polycarbonate |
Glass petriplates | Borosil | 3165A75 | Glass |
GraphpadPrism | GraphPad Software, Inc. | Version 5.01 | |
Kline concavity slides | Himedia | GW092-1PK | Glass |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Methylene blue hydrate | Sigma-Aldrich | 66720-100G | |
Parafilm | Tarsons | 380020 | Paraffin film |
Pasteur pipettes | Himedia | PW1212-1X500NO | Polyethylene plastic |
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTI | Polycarbonate |
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTD | Polycarbonate |
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTL | Polycarbonate |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
Sodium hydroxide pellet | SRL | 1949181 | |
Stereo Microscope Leica M205FA | Leica | Model/PN MDG35/10 450 125 | |
X-Rad 225 Precision X-Ray | Precision X-Ray | X-RAD 225XL |