移植由神经元编程产生的人类多能干细胞衍生的GABA能神经元可能是神经发育障碍的潜在治疗方法。该协议描述了人类干细胞来源的GABA能神经元前体的产生和移植到新生小鼠的大脑中,允许对移植神经元进行长期研究并评估其治疗潜力。
抑制性中间神经元的数量减少或功能障碍是神经发育障碍的常见因素。因此,使用中间神经元来替代或减轻改变的神经元回路影响的细胞疗法是一种有吸引力的治疗途径。为此,需要更多关于人类干细胞衍生的GABA能神经元间样细胞(hdINs)如何随着时间的推移在宿主回路中成熟,整合和功能的知识。在神经发育障碍中,特别重要的是更好地了解移植细胞中的这些过程是否受到进化和成熟的宿主大脑的影响。本协议描述了基于转录因子 Ascl1 和 Dlx2的转基因表达从人类胚胎干细胞中快速有效地生成hdIN。这些神经元前体在 体外7天后单侧移植到新生儿2天龄小鼠的海马体中。移植的神经元分散在皮质发育不良局灶性癫痫综合征小鼠模型的同侧和对侧海马体中,并在移植后存活长达 9 个月。这种方法允许研究移植中间神经元在发育健康和患病大脑中的细胞身份、整合、功能和治疗潜力。
神经元网络的建立、成熟和完善发生在围产期和产后早期,是大脑发育的关键时间窗口1。从出生后丰富的连接性,大脑进化到对连接的微调,一直延伸到青春期2。因此,在这些时期表达的基因的改变,以及外部因素或侮辱,定义了个体对多种神经发育障碍的易感性。认知和运动功能的损害随着时间的推移而发展,药物治疗受到限制,大多数针对具有严重副作用风险的症状。
γ-氨基丁酸 (GABA) 能抑制功能障碍已被证明是各种神经发育障碍3 的根本原因的主要原因,例如脆性 X 综合征、安格曼综合征、癫痫、精神分裂症和自闭症。GABA 是中枢神经系统的主要抑制递质,有助于维持兴奋性/抑制性 (E/I) 平衡、神经元放电的同步和计算。GABA能中间神经元是神经元的异质群体,在更复杂的大脑区域4和进化5,6中具有越来越多的功能复杂性。考虑到人脑有限的内源性再生能力以及中间神经元功能障碍在几种神经系统疾病中的影响,GABA能中间神经元的移植可能是一种有前途的治疗途径。沿着这条线,与啮齿动物同种异体神经元前体或其他地方使用的其他来源相比,人类干细胞衍生的GABA能神经元间样细胞(hdINs)似乎是为此目的最具转化性和可行性的来源7。从不同细胞来源产生GABA能神经元的方案可用8,9,10,11,12,13,但需要更多关于hdIN如何随着时间的推移在发育中的病理大脑中成熟,整合和功能的知识。一些研究已经确定了在皮质模式期间活跃的基因的改变,建立了神经元连接14,并调整了生理E / I平衡15。新生儿将hdINs移植到具有相应遗传扰动的小鼠模型中,使我们能够跟踪宿主和移植物之间的相互作用,这是确定潜在治疗策略所必需的知识。
免疫调节通常用于异种移植,以避免触发宿主免疫反应和排斥反应16。然而,免疫抑制药物(如环孢素A)的给药在长期给药后引起肾毒性,由于需要每天腹膜内注射以达到稳定的全身浓度,因此是劳动密集型的,引起动物应激17,并且具有可与病理相互作用的脱靶效应18。此外,损害免疫系统已被证明会改变行为表型19,并改变相应的神经解剖区域20。在出生后第一周进行移植已被证明可以适应移植的细胞21,22,而其他人则报告了初始存活率,然后在出生后第一个月内排斥移植物23,24。
该协议描述了从hdIN生成到新生小鼠细胞移植的程序,导致长期移植物存活,并允许研究生理和病理发育过程中移植的人中间神经元的神经元特异性,突触整合,功能和治疗潜力。
本协议描述了一种稳健,快速,简单且广泛可及的体 外 生成hdIN前体的方法,并将其用作神经发育障碍临床前模型中的早期介入细胞疗法。
尽管神经发育障碍的一些特征性表型出现在青春期或成年期,但在早期发育期间已经存在病理生理改变。出于这个原因,早期干预对于在症状或临床表现之前的关键大脑发育时期采取行动来实现有益效果是非常必要的。未来,基因筛查和生物标志物的开发将提供预防性或症状前治疗,为这些患者带来改变游戏规则。因此,hdIN前体在 Cntnap2 KO小鼠模型中出生后早期移植,当时神经元网络中的致痫变化可能正在进行28 ,并且在该动物模型中描述了细胞改变的时间点29。然而,重要的是要考虑年龄推断的潜在陷阱以及小鼠与人脑中某些过程的时间。
专注于程序本身,这里介绍的分化方案基于转录因子的使用,与其他地方基于小分子10,30的其他方案相比,转录因子允许快速有效地对干细胞进行编程。这种方法的一个潜在缺点可能是需要慢病毒载体,这会带来插入诱变的风险。该方案中的两个关键步骤是将抗生素和抗有丝分裂剂添加到培养基中,以选择表达转录因子的细胞并消除增殖细胞,分别避免畸胎瘤形成的风险。尽管本研究中仅测试了hdIN前体,但预计该程序对于其他细胞来源和编程/分化方案是可行的。然而,其他神经元亚型和/或模型应得到验证。
hdIN前体的移植年龄为7 DIV,是根据(i)增殖细胞的缺失决定的,通过对Ki67的免疫反应性进行评估,(ii)以及先前报道的多能性基因(如POU5F1)表达减少的观察以及该时间点8的神经元标记MAP2和中间神经元标记GAD1的出现.然而,描述该方案的原始工作在DOX戒断后14 DIV进行了移植9。这就提出了一个问题,即母亲饮用水中的DOX是否可以通过乳汁到达移植到哺乳幼崽大脑中的细胞,或者7 DIV的DOX诱导是否足以确定GABA能命运。尽管Yang等人确定14天的DOX足以在体外产生稳定的神经元细胞9,但Gonzalez-Ramos等人8已经在7 DIV检测到GAD1基因表达,表明Ascl1和Dlx2对GAD67的下游激活已经在这个时间点发生。因此,图案化从 7 DIV 开始,并且可能不太依赖于 DOX 处理。此外,啮齿动物和人类的证据表明母乳中存在DOX 31,32,这里介绍的结果表明,移植的hdINs在2周和2个月PT时对Ascl1具有免疫反应性,在9个月PT时对中间神经元标志物具有免疫反应性。在移植人群中,除了PV和SST阳性神经元外,还发现了较低数量的中间神经元亚群的其他标记物,例如钙视黄蛋白(CR)和钙结合素(CB)。
该程序的一个具有挑战性的方面是协调分化和幼崽年龄的时间。通常,小鼠在建立交配笼后需要 21 天妊娠,尽管有时会有所不同。在成年啮齿动物中进行细胞移植时,当一切都可以仔细计划和安排时,这种情况不会发生。然而,这可以通过设置两到三个间隔为2天的交配笼或两到三个间隔为2天的分化批次来轻松缓解。
尽管本研究中使用的小鼠既没有免疫缺陷也没有免疫抑制,但移植的细胞在体内存活了长达9个月,并且在P14或2个月PT时都没有观察到针对异种细胞或局部炎症的免疫反应标志物。 移植异种细胞的免疫排斥被触发针对MHC /肽,移植排斥的关键细胞介质是T淋巴细胞和小胶质细胞33,34.因此,探索了对T细胞标志物以及反应性小胶质细胞的免疫反应性。在P14或2个月时,通过反应性小胶质细胞的水平或WT小鼠中T淋巴细胞的存在,没有检测到宿主组织中移植细胞的免疫排斥迹象。此外,根据评估的星形胶质增生和炎性细胞因子的水平,未观察到局部炎症。这一结果可能部分取决于新生儿免疫耐受性35,36,37,由其他细胞身份,位置和动物模型35,38观察到。Englund等人确定了移植细胞在迁移和成熟方面的区域差异,包括观察相邻白质中的移植细胞35。
最后,与其他移植到成年啮齿动物中的研究相比,观察到海马体内移植细胞的更大分散,其中hdIN仍作为移植的核心25。这种分散也与Yang等人之前观察到的结果不同9,在这种情况下,可以通过移植时细胞的年龄来解释。
The authors have nothing to disclose.
该项目由瑞典研究委员会(批准号:2016-02605,MA)、瑞典脑基金会F02021-0369(MA)、克拉福德基金会(MA)和欧盟地平线2020计划(H2020-MSCA-ITN-2016)资助,在Marie Skłodowska-Curie创新培训网络项目Training4CRM No. 722779(M.K.)下。我们非常感谢Josep Maria Canals实验室(巴塞罗那大学干细胞和再生医学实验室)的Andrés Miguez的帮助,教授P2新生小鼠的立体定位细胞移植,以及德克萨斯大学奥斯汀分校的小组负责人Mackenzie Howard的建议和初步坐标。我们感谢Susanne Geres协助动物护理和Ling Cao帮助处理组织,以及以某种方式为研究做出贡献的学生,特别是Diana Hatamian。最后,用于说明本文的一些图形是用 BioRender.com 创建的。
30 G needle | B Braun | 4656300 | |
33 G needle for Hamilton syringe | Hamilton | 7762-06 | |
4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors) |
Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL | |||
Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
Anti-Galectin 3 (Goat) | R&D systems | AF1197 | 1:500 |
Anti-GFAP (Guiena Pig) | Synaptic systems | 173004 | 1:500 |
Anti-Iba1 (Rabbit) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
Anti-IL1 (Goat) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
Anti-Ki67 (Rabbit) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
Anti-MAP2 (Chicken) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
Avidin/Biotin Blocking Kit | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | Animal model |
Biotinylated Horse anti-Mouse | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
C57BL/6J | Janvier Labs | Animal model | |
Centrifuge | For 15 mL tubes | ||
Confocal microscope | Nikon | Confocal A1RHD microscope | |
Costar 6-well Clear TC-treated | Corning | 3516 | |
Cy3 Stretavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µM |
DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
Digital Stereotax | KOPF | Model 940 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Use for the N2 medium |
DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
Epifluorescence microscope | Olympus | BX51 Microscope | |
Ethanol | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
FUW-rTA | Addgene | 20342 | Lentiviral vector |
FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | Lentiviral vector |
FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral vector |
H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | Human embryonic stem cell line under a MTA agreement |
H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
Hamilton Syringe | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
HBSS | Gibco | 14175095 | No calcium, No magnesium – Transplantation medium |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
Incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
Manual cell counter | VWR | 720-1984 | |
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free | Corning | 354277 | For the coating |
Methanol | Merck Millipore | 1060091000 | |
Microscope Coverslips 24 x 60 mm | Thermo Scientific | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
Microscope Slides | VWR | 631-1551 | |
Microscope Software | Olympus | CellSens | |
Mounting media | Merck | 10981 | PVA-Dabco |
Mouse adaptor to stereotax | RWD | 68030 | |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Kit Basal Medium and 5X Supplement – Stem cell culture medium |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Pertex | HistoLab | 811 | |
Pipet Filler | |||
Play-Doh | |||
Puromycin (Dihydrochloride) | Gibco | A1113803 | |
Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | For immunocytochemistry |
Serum | Thermo Fisher | Goat, Donkey, Horse | |
Sterile pipette tips | For volumes 0.1-1000 µL | ||
Sterile serological pipettes | 5, 10, 25 mL | ||
Sterile water Braun | B Braun | 3626873 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | For 0.5% Sucrose solution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
Tubes | Sarstedt | 15 ml, Eppendorf 1.5 mL | |
Tweezer | VWR | ||
Ultra pure water | MilliQ Water System | ||
Xylene | VWR | 28973.363 | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |