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Developmental Biology

Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64302
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

Summary

Aqui, descrevemos uma técnica simples destinada à geração eficiente de camundongos geneticamente modificados chamada CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Este método fornece reagentes de edição por eletroporação em embriões a uma eficiência próxima de 100%. Este protocolo é eficaz para mutações pontuais, pequenas inserções genômicas e deleções em embriões de mamíferos.

Abstract

Com eficiência, precisão e facilidade excepcionais, o sistema CRISPR/Cas9 melhorou significativamente a edição do genoma em experimentos de cultura de células e animais de laboratório. Ao gerar modelos animais, a eletroporação de zigotos oferece maior eficiência, simplicidade, custo e rendimento como uma alternativa ao método padrão-ouro de microinjeção. A eletroporação também é mais suave, com maior viabilidade, e fornece de forma confiável as ribonucleoproteínas (RNPs) Cas9/RNA de guia única (sgRNA) nos zigotos de linhagens comuns de camundongos de laboratório (por exemplo, C57BL/6J e C57BL/6N) que se aproximam de 100% de eficiência de entrega. Esta técnica permite a inserção/deleção (indels) mutações, mutações pontuais, a deleção de genes inteiros ou éxons, e pequenas inserções na faixa de 100-200 pb para inserir LoxP ou tags curtas como FLAG, HA ou V5. Embora constantemente aprimorados, aqui apresentamos o estado atual do CRISPR-EZ em um protocolo que inclui a produção de sgRNA através da transcrição in vitro, processamento embrionário , montagem de RNP, eletroporação e genotipagem de embriões pré-implantação. Um pesquisador de nível de pós-graduação com experiência mínima na manipulação de embriões pode obter embriões geneticamente editados em menos de 1 semana usando este protocolo. Aqui, oferecemos um método simples, de baixo custo, eficiente e de alta capacidade que pode ser usado com embriões de camundongos.

Introduction

A edição do genoma em camundongos vivos foi consideravelmente simplificada e tornou-se acessível e mais acessível desde o surgimento da edição CRISPR 1,2,3. Tentativas iniciais de edição animal utilizaram microinjeção para entregar mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 em embriões em estágio pronuclear 4,5,6. Embora a microinjeção seja bastante eficaz, a quantidade de prática necessária para dominá-la totalmente pode não ser apropriada para estagiários e estudantes e também requer equipamentos caros que um laboratório modestamente financiado não pode pagar. A microinjeção é normalmente realizada por técnicos especializados em instalações transgênicas com horários e preços de serviços que limitam a taxa para muitos pesquisadores. Uma abordagem mais acessível é a da eletroporação, que tem se mostrado bastante eficaz para a entrega de mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 em embriões em estágio pronuclear7. Outras melhorias nas estratégias de edição e entrega do genoma CRISPR sugeriram que RNPs pré-montados já envolvidos com sgRNAs podem ser um meio eficaz para reduzir o mosaicismo8.

A lógica por trás do desenvolvimento e uso deste protocolo foi ignorar muitas das limitações e obstáculos associados à microinjeção. Como o nome indica, um método fácil, interno e econômico que pudesse determinar rapidamente se os projetos de sgRNA não testados valeriam a pena usar durante um experimento de microinjeção seria uma etapa de controle de qualidade de primeira passagem muito conveniente (Figura 1). Embora esse método não possa substituir a microinjeção por estratégias mais complexas, como a introdução de longas sequências de DNA de doadores para resultados baseados em recombinação, é ideal para estratégias menos complexas, como pequenas deleções ou inserções e genes de marcação. Este método é apropriado para pesquisadores com habilidades básicas de manipulação de embriões que têm necessidades simples de edição, gostariam de testar sua hipótese dentro do período de tempo de desenvolvimento pré-implantacional ou preferem testar sgRNAs em embriões antes de agendar uma consulta com um especialista em microinjeção. Aqui, os reagentes de edição são entregues transitoriamente em embriões de estágio pronuclear como RNPs Cas9/sgRNA via eletroporação (uma série de pulsos elétricos) para maximizar a eficiência enquanto diminui o mosaicismo8. Usando um método de genotipagem embrionária, os resultados da edição estão disponíveis em aproximadamente 1 semana9, reduzindo assim a necessidade de várias aplicações de microinjeção a um custo significativamente reduzido.

A eficácia desse método atinge o pico no estágio embrionário pró-nuclear, quando o embrião ainda não fundiu os pronúcleos materno e paterno ou entrou na fase S (Figura 2). A superovulação é usada para maximizar o número de zigotos, mas produz zigotos pró-nucleares e óvulos não fertilizados. Zigotos saudáveis também podem ser pré-selecionados antes da eletroporação para aumentar a eficiência geral. Como outros protocolos de eletroporação têm editado zigotos de forma eficiente sem a necessidade de incluir uma etapa semelhante7,10,11,12,13,14,15, uma etapa opcional deste protocolo é a ligeira erosão da zona pelúcida (ZP). A ZP é uma camada de glicoproteína que auxilia a ligação dos espermatozoides, a resposta do acrossoma e a fertilização em torno de embriões em estágio pró-nuclear. Em nossa experiência, descobrimos que uma erosão suave à base de ácido do ZP fornece entrega confiável de eletroporação de RNP Cas9 com apenas um impacto marginal na viabilidade.

Observamos taxas de entrega de RNP de até 100% de eficiência via eletroporação em cepas de camundongos que são comumente utilizadas em pesquisas como C57BL/6J e C57BL/6N 9,16. Grupos independentes também desenvolveram procedimentos baseados em eletroporação com eficiências maiores ou correspondentes à microinjeção 11,12,13,14,15,17, com protocolos de eletroporação funcionando bem em ratos 18,19, suínos 20,21,22 e vacas 23 , por isso, sugerimos que os leitores comparem os protocolos para encontrar as condições que melhor se adequam às suas necessidades experimentais e de equipamento. O sistema descrito aqui usa materiais e equipamentos comuns, exigindo apenas habilidades básicas de manipulação de embriões. Esta técnica é eficaz para uma série de estratégias de edição, tornando este método amplamente acessível à comunidade de pesquisa.

Projetar RNAs de guia pequeno ideais (sgRNAs) é essencial para uma edição eficiente. Recomendamos o rastreamento de duas a três estratégias de sgRNA por local-alvo diretamente em embriões de camundongos, especialmente se a geração de linhagem de camundongo for desejada. Uma vez projetados, métodos livres de clonagem, como a transcrição in vitro (IVT) para produzir sgRNAs de alta qualidade, são recomendados3. Os RNPs e sgRNAs são misturados com 30-50 embriões processados em estágio pronuclear e expostos a uma série de pulsos elétricos para primeiro permeabilizar temporariamente o ZP e a membrana celular, com pulsos subsequentes para manter os poros abertos e eletroforese os RNPs através do zigoto24. Após otimização, descobrimos que seis pulsos de 3 ms a 30 V para embriões a granel (~50) foram ótimos para a eficácia e viabilidade da edição, proporcionando uma entrega de RNP Cas9/sgRNA altamente eficiente 9,16,25. Eventos de edição em morula de camundongo individual podem ser confirmados usando uma variedade de estratégias de validação comuns para edição CRISPR, como polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), digestão de endonuclease T7 e sequenciamento de Sanger da região de interesse26.

O método atual é mais apropriado para esquemas de edição simples (Figura 3), como inserção/exclusão (indels), exclusões de tamanho exonário na ordem de 500-2000 pb e a entrega de mutações pontuais e pequenas inserções, como tags C- ou N-Terminal (por exemplo, FLAG, HA ou V5)9,16,27. O potencial para a edição complexa do genoma, como grandes inserções de tags fluorescentes ou alelos condicionais, permanece incerto e é o foco atual das próximas melhorias.

Este método é facilmente dominado e pode ser usado para testar rapidamente sgRNAs em embriões de camundongos cultivados em 1 semana9 (Figura 1). Apresentado neste trabalho é um protocolo de seis etapas, que inclui 1) desenho de sgRNA; 2) síntese de sgRNA; 3) superovulação e acasalamento; 4) cultura, coleta e processamento de embriões; 5) Montagem e eletroporação da RNP; 6) cultura embrionária e genotipagem. Informações sobre todos os materiais utilizados são fornecidas (Tabela de Materiais). Como controle positivo, os reagentes para edição do locus tirosinase (Tyr) 9,16 foram incluídos na Tabela Suplementar 1.

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Protocol

Todos os cuidados e uso de animais ao longo deste protocolo aderiram às políticas da Lei de Bem-Estar Animal do Guia ILAR para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e seguiram as diretrizes e políticas da AVMA para eutanásia e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Pensilvânia (IACUC). O protocolo de cuidado e uso de animais foi revisado e aprovado pela IACUC da Universidade da Pensilvânia para este projeto. Por uma questão de conformidade e cautela, por favor, procure todas as autorizações necessárias antes de tentar este protocolo.

1. sgRNA e oligo design opcional do doador

  1. Projeto de sgRNA
    1. Selecione sgRNAs candidatos de qualquer algoritmo on-line amplamente utilizado, como Sequence Scan for CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 ou CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. Como cada plataforma é única, leia atentamente as instruções do usuário para projetar sgRNAs ideais. Para experimentos in/del, selecione dois a três sgRNAs para testar. Para deleções, os sgRNAs que flanqueiam a região alvo são sugeridos, por exemplo, dois sgRNAs a montante do alvo e dois sgRNAs a jusante do alvo.
      NOTA: Embora vários algoritmos de sgRNA on-line considerem os alvos fora dos alvos para evitar projetos de sgRNA defeituosos, a ferramenta BLAST do NCBI é útil para confirmar a qualidade das sequências de sgRNA selecionadas.
    2. Inserir 19-20 nucleotídeos (nt) determinados a partir da etapa anterior (1.1.1) na região variável do oligo sgRNA (Tabela Suplementar 1) e comprar sgRNA sintetizado como oligos de DNA personalizados.
      NOTA: A purificação de PAGE não é necessária.
  2. (Opcional) Projeto de oligo doador para knock-in mediado por reparo dirigido por homologia (HDR).
    1. Projetar o oligodesoxinucleotídeo de fita simples apropriado (ssODN) com base no resultado experimental desejado (mutação pontual precisa, inserção de loxP, inserção de etiqueta pequena, etc.), mantendo o comprimento total de 100-200 nt com braços de homologia de 50 nt ou mais flanqueando a região central.
    2. Para garantir maior eficiência de knock-in, projete o sgRNA para ser complementar ao ssODN30 e substitua a sequência de motivos adjacentes do protoespaçador (PAM) por uma mutação silenciosa para evitar o corte recorrente pela enzima Cas9.
    3. Ordene ssODN usando a opção oligo personalizada.

2. síntese de sgRNA

  1. Geração de molde para transcrição in vitro (IVT)
    1. Para gerar o molde de DNA para o sgRNA IVT através de PCR, prepare uma reação IVT em um tubo de tira de PCR que seja livre de RNAse. (ver quadro complementar 2).
    2. Use as seguintes condições de termociclador:
      95 °C durante 2 min; 30 ciclos de 95 °C durante 2 min, 57 °C durante 10 s e 72 °C durante 10 s; em seguida, 72 °C durante 2 min
    3. Para verificar o sucesso da reação de PCR molde de DNA do sgRNA, eletroforese 5 μL do produto combinado com 1 μL de corante de carga 6x em um gel de agarose a 2% (wt/vol).
      NOTA: O tamanho previsto do produto é de 127 pb. Qualquer reação de PCR restante pode ser armazenada a -20 °C por até 5 meses.
  2. Transcrição in vitro (IVT) de sgRNA
    1. Para gerar o sgRNA, prepare a mistura de reação (T7 IVT de acordo com as instruções do fabricante) em um tubo de PCR e mexa para misturar os reagentes.
      NOTA: Consulte a Tabela Suplementar 3 para o exemplo de configuração da reação. A reação IVT é sensível à contaminação por RNase; portanto, faça todos os esforços para fornecer um ambiente livre de RNase.
    2. Para permitir que a reação se inicie e prossiga, incubar a mistura de reação IVT por >18 h a 37 °C em um termociclador ou bloco de calor.
    3. Para degradar o molde de ADN original (passo 2.1.3), introduzir 1 μL de DNase I (2 unidades por reacção) e incubar a reacção durante 20 min à temperatura ambiente (RT).
    4. Para promover a ligação do RNA às esferas de purificação magnética, combine 129 μL de etanol a 100% na reação, que agora será de 150 μL.
    5. Para ressuspender as contas de purificação, que tendem a se depositar durante o armazenamento, vortex a alíquota por pelo menos 10 s.
    6. Para purificar os sgRNAs, adicionar 100 μL dos grânulos ressuspensos (etapa 2.2.5) à reação IVT (etapa 2.2.4) e misturar suavemente pipetando para cima e para baixo 10x.
    7. Para permitir a ligação, deixe a mistura repousar em RT por 5 min.
    8. Para isolar o sgRNA dos produtos de reação não incorporados, coloque a reação no suporte magnético por 5 min no RT e espere até que uma pequena pelota se forme.
    9. Para lavar os sgRNAs, primeiro descarte cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, adicione 200 μL de etanol a 80% longe do pellet.
      NOTA: Durante a etapa de lavagem de etanol a 80% (vol/vol), é fundamental evitar perturbar o pellet por pipetagem, pois isso reduzirá consideravelmente as concentrações de sgRNA. Em vez disso, pipete suavemente o etanol a 80% para que o pellet fique submerso e remova suavemente o volume com uma pipeta.
    10. Repita o passo anterior (passo 2.2.9) e seque ao ar livre o pellet por não mais de 5-6 min ou o sgRNA será permanentemente associado às contas.
    11. Elimine o sgRNA com 20μL de água livre de nuclease pipetando o pellet 10x, incubando por 2 min at (RT) e, em seguida, colocando-o de volta no suporte magnético para separar as contas do sgRNA agora purificado.
    12. Para avaliar a qualidade e a quantidade do sgRNA, use um instrumento como um espectrofotômetro ou bioanalisador. Alternativamente, em um gel de agarose a 2%, execute 2 μL de sgRNAs, semelhante ao passo 2.1.3.
      NOTA: A qualidade é confirmada por uma única faixa clara. O restante do sgRNA pode ser usado imediatamente ou armazenado em condições de -80 °C.

3. Superovulação

  1. Para fornecer embriões suficientes para testar cada desenho de sgRNA, superovular duas a três fêmeas C57BL/6J com idade entre 3-5 semanas, conforme descrito anteriormente9. Recomenda-se a eletroporação de 20-30 embriões por sgRNA para gerar resultados suficientes para confirmar a eficácia.
    NOTA: Se a fertilização for bem sucedida, espere 10-20 embriões por acasalamento.
  2. Para induzir a ovulação, siga este cronograma de injeção hormonal:
    1. Dia 1: Administrar 5 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG) (100 μL) através de uma injeção intraperitoneal (IP) usando uma seringa de 26 G em ratas de 3-5 semanas de idade.
    2. Dia 3: Após 46-48 h de injeção de PMSG, injete 5 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG) (100 μL) através de uma injeção IP para induzir a ovulação.
    3. Para configurar a reprodução, emparelhe as fêmeas 1:1 com um macho de reprodução confiável logo após a injeção de hCG.
      NOTA: Para evitar que os hormônios se degradem e percam a atividade, realize injeções abaixo de 30 minutos de descongelamento.

4. Recolha e processamento de embriões

  1. Coleta de embriões
    1. Para eutanasiar as fêmeas e recuperar o material necessário, conforme descrito anteriormente31, certifique-se de primeiro confirmar o método adequado de acordo com as políticas institucionais. Por exemplo, use asfixia por CO2 , luxação cervical e / ou outros métodos aprovados.
      NOTA: Normalmente, >75% das fêmeas estimuladas por hormônios exibem plugues copulatórios, indicando acasalamento bem-sucedido.
    2. Para evitar que os pelos dificultem a coleta de tecidos, coloque as fêmeas eutanasiadas de costas e pulverize etanol a 70% (vol/vol) na região do abdômen para ser aberta cirurgicamente.
      NOTA: A partir deste ponto, é aconselhável realizar as etapas cirúrgicas em um exaustor ventilado, a fim de manter um ambiente asséptico e reduzir o potencial de contaminação.
    3. Para abrir a cavidade abdominal e remover os ovidutos, corte a camada de pele/cabelo (subcutânea) com tesoura cirúrgica e localize os ovários (Figura 4), que são encontrados perto do rim e compartilham uma seção de uma almofada de gordura. Os ovidutos localizam-se proximais aos ovários (Figura 4). Remova cirurgicamente ambos os ovidutos da fêmea e coloque-os em gotículas individuais de 50 μL de meio M2+BSA (4 mg/mL BSA) (Figura 5A).
      NOTA: Instruções detalhadas para esta seção do procedimento podem ser exibidas visualmente31 ou seguidas passo a passo9 usando protocolos publicados anteriormente.
    4. Para liberar os complexos cumulus-ovócitos (CoCs) contendo oócitos (Figura 4), use pinça de dissecção para cortar a ampola do oviduto enquanto visualiza através de um estereomicroscópio.
    5. Para reduzir a quantidade de detritos (sangue, gordura, tecido), transfira e combine cada CoC para uma única gota de 50 μL de meio M2 + BSA com uma pipeta portátil ajustada para 20-30 μL para evitar o transporte de detritos.
  2. Remoção de células cumulus
    1. Para iniciar a remoção das células cumulus dos zigotos (Figura 4), transfira os CoCs com o mínimo de meios extras possível para uma gota de 100 μL M2+hialuronidase (Figura 5B) e misture suavemente pipetando os CoCs até que os embriões estejam visivelmente separados das células cumulus muito menores. Certifique-se de manter a exposição da M2 + hialuronidase aos embriões ao mínimo, pois isso pode afetar a viabilidade.
      NOTA: Pode-se pré-aquecer (37 °C) ou adicionar 50 μL adicionais de M2+hialuronidase se os embriões não estiverem se separando das células cumulus dentro de 2 min.
    2. Para diluir a hialuronidase e eliminar as células cumulus soltas dos zigotos, use uma pipeta operada pela boca para mover os zigotos para uma gota fresca de 50 μL M2 + BSA.
      NOTA: A maioria dos passos para além deste ponto requer a utilização de uma pipeta operada pela boca, salvo indicação em contrário. Embora o risco de contaminação do usuário seja baixo, o uso de um filtro de ar em linha é recomendado para manter um ambiente asséptico. Consulte os métodos descritos anteriormente para preparar e utilizar este instrumento 9,31.
    3. Usando uma pipeta bucal, passe os embriões através de pelo menos quatro a cinco gotículas de 50 μL M2+BSA para reduzir o número de células cumulus.
  3. (OPCIONAL) Afinamento da zona pelúcida com solução de tiro ácido (AT).
    1. Para corroer a zona pelúcida do embrião e reduzir os obstáculos físicos adicionais para a entrega do reagente, transferir os embriões para uma gota pré-aquecida (37 °C) de 100 μL de solução de AT em uma placa de 60 mm (Figura 5C). Observar continuamente os zigotos utilizando um estereomicroscópio até que aproximadamente 30% da zona pelúcida seja erodida9. A exposição total ao TA deve ser de 60-90 s. A exposição prolongada ao TA pode dissolver totalmente a zona pelúcida e comprometer a viabilidade embrionária.
      NOTA: Para obter instruções detalhadas e imagens desta seção do procedimento, consulte os métodos publicados anteriormente 9,16.
    2. Para diluir o TA, use uma pipeta bucal para passar os embriões através de pelo menos quatro gotículas de 50 μL de M2+BSA.
    3. Para determinar se um número apropriado de embriões foi processado, use um estereomicroscópio para contar os embriões. Dependendo do número de camundongos fêmeas usados, pode-se esperar aproximadamente 10-20 zigotos viáveis por fêmea.
      NOTA: Nesta fase, os embriões devem estar relativamente livres de detritos que impeçam a avaliação da quantidade e da qualidade. Por exemplo, se usar cinco fêmeas, o número de zigotos esperado provavelmente estaria entre 50-100, e um contador de células mecânicas seria apropriado para acompanhar os embriões. É comum perder cerca de 10% a 20% dos embriões devido à falha na fertilização ou oócitos de baixa qualidade sendo ovulados. Durante a próxima etapa, armazene brevemente os embriões em 50 μL de M2+BSA por não mais de 30 min em uma incubadora.

5. Montagem e eletroporação da RNP

  1. Montagem RNP
    1. Para montar o complexo RNP, use as tabelas de exemplo anexadas para combinar as misturas de reação apropriadas com base na estratégia de edição desejada no tampão RNP (100 mM HEPES pH 7,5, 750 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 50% glicerol e 100 mM Tris(2-carboxietil)cloridrato de fosfina [TCEP] em água livre de nuclease)
      NOTA: TCEP é um agente redutor conveniente, mas tem uma meia-vida curta em soluções aquosas; portanto, adicione TCEP imediatamente antes da montagem do complexo RNP.
      1. Para indels mediados por junção final não homóloga (NHEJ), consulte a Tabela Suplementar 4.
      2. Para edição mediada por reparo direcionado por homologia (HDR), consulte a Tabela Suplementar 5.
      3. Para deleções de engenharia usando sgRNAs pareados, consulte a Tabela Suplementar 6.
        1. Independentemente da estratégia, combine os reagentes desejados no RT em um tubo de PCR.
        2. Para permitir a formação de complexos de RNP, incubar a mistura por 10 min a 37 °C.
          NOTA: O complexo RNP pode ser armazenado no RT por até 1 h.
  2. Eletroporação
    1. Para diluir a BSA antes da eletroporação, passar os embriões através de pelo menos duas gotículas de 50 μL de meio sérico reduzido.
      NOTA: A BSA aumenta a resistência durante a eletroporação e pode danificar os zigotos.
    2. Para preparar e misturar os zigotos (etapa 4.3.2) com o complexo RNP (etapa 5.1.1.2) para eletroporação, pipetar a boca 25-30 embriões em uma gota de 10 μL de meio sérico reduzido e, em seguida, usar uma pipeta portátil para adicionar 10 μL do complexo RNP (etapa 5.1.1.2).
    3. Para diluir o glicerol viscoso do complexo RNP e homogeneizar a amostra, misture pipetando 10x ou até que a mistura não apresente mais sinais de viscosidade (padrão de redemoinho) usando um estereomicroscópio.
    4. Para preparar a amostra para inserção no eletroporador, pipetar esta mistura de 20 μL de embrião + RNP em uma cubeta de eletroporação de 0,1 cm, evitando bolhas.
    5. Para entregar os reagentes de edição no zigoto, eletroporate os embriões usando um protocolo de onda quadrada com estas condições: 30 V, 4-6 pulsos, comprimento de pulso de 3 ms e intervalos de pulso de 100.
    6. Para recuperar zigotos da cubeta, use uma pipeta de mão para entregar 50 μL de KSOM+BSA (1mg/mL BSA) no topo da cubeta para liberar os embriões que podem ter se depositado no fundo. Pipete suavemente esta mistura para fora e para uma placa de 60 mm.
    7. Repita o passo 5.2.6 pelo menos 2x-3x e combine cada descarga numa placa de 60 mm até que a maioria dos embriões esteja recuperada.
      NOTA: Uma recuperação típica é >90% dos embriões originalmente carregados. Para garantir a sobrevivência do embrião, teste a incubadora e verifique as datas de validade de todos os reagentes. Os embriões são suscetíveis a condições de cultura não ideais, como temperatura, nível de CO2 , umidade e pH.

6. Cultura de embriões e genotipagem

  1. Cultura de embriões
    1. Para cultivar zigotos para um estágio desejado, use uma pipeta bucal para transferir 20-30 zigotos para uma gota de KSOM+BSA em uma placa de cultura pré-equilibrada e mova os embriões para a gota (Figura 5D). Incubar a placa durante a noite em 5% de CO2, a 37 °C, com 95% de umidade.
      NOTA: Pré-equilibrar-se colocando uma placa de cultura preparada de 35 mm numa incubadora no dia anterior ou pelo menos 4 h antes da incubação (Figura 5D).
    2. Para promover condições ideais de crescimento, transfira apenas embriões de duas células no dia seguinte para uma gota fresca de mistura KSOM+BSA usando um estereomicroscópio e retorne à incubadora. Certifique-se de deixar ou descartar os embriões mortos ou não fertilizados.
      NOTA: Embriões em estágio pró-nuclear tipicamente crescem em mórulas após 72 h de cultura e blastocistos após 84 h.
  2. Genotipagem
    1. Para diluir os componentes do meio que podem interferir com uma reação de PCR, lave os embriões de mórula/blastocisto usando uma pipeta bucal passando por duas gotas de DPBS.
    2. Para carregar embriões únicos para lise, transfira embriões individuais para um poço de uma tira de PCR de 8 poços ajustando uma pipeta a 1 μL e, em seguida, adicione 10 μL de tampão de lise (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8,5, 2,5 mM MgCl 2, 0,1 mg/mL de gelatina, 0,45% Nonidet P-40, 0,45% Tween 20, 0,2 mg/mL de proteinase K em H2O livre de nuclease).
      NOTA: Adicione a proteinase K imediatamente antes de preparar o tampão de lise.
    3. Para lisar os embriões, programe um termociclador a 55 °C por 4 h e, em seguida, inative a proteinase K com uma incubação de 10 minutos a 95 °C.
      NOTA: Particularmente para usuários iniciantes, tente um experimento de edição no Tyr loci. Esse fluxo de trabalho foi otimizado e pode servir como um controle positivo. Se necessário, conservar os lisados embrionários a 4 °C durante 2-3 dias ou no congelador até 2 semanas antes da análise por PCR. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
    4. Para aumentar as chances de uma análise de genotipagem bem-sucedida, execute uma estratégia de nested PCR amplificando fragmentos de DNA um pouco mais longos que flanqueiam o local alvo, bem como regiões que serão usadas para amplificar um fragmento de DNA mais preciso. Siga as condições da Tabela Suplementar 7.
    5. Siga as condições do termociclador abaixo mencionadas:
      95 °C durante 2 min
      30+ ciclos: 95 °C por 2 min, 60 °C por 10 s e 72 °C por 10 s
      72 °C durante 2 min
    6. Para preparar o segundo estágio de uma estratégia de PCR aninhada, faça uma diluição 1:10 do primeiro produto de PCR (etapa 6.2.5) e carregue 2 μL deste na próxima reação de PCR (com primers projetados para estar dentro do amplificador anterior).
      NOTA: A primeira reacção de PCR deve ser diluída para reduzir o reporte de primers de flanco na segunda reacção de PCR. Prepare a PCR aninhada seguindo as etapas na Tabela Suplementar 8.
    7. Coloque a reação de PCR em um termociclador usando as seguintes condições de ciclo:
      95 °C durante 2 min
      30 ciclos: 95 °C por 2 min, 60 °C por 10 s e 72 °C por 10 s
      72 °C durante 2 min
      NOTA: Normalmente, >90% das reações de PCR são bem-sucedidas quando o tamanho do amplificador é de 500 pb ou menos.
    8. (Controle opcional) Para mutações in/del mediadas por NHEJ utilizando Tyr como controlo positivo, digerir 10 μL dos produtos de PCR aninhados a partir da fase 6.2.7 incubando a 37 °C durante 4 h utilizando 10 U de HinfI numa reacção de 20 μL (ver quadro suplementar 9). Em um gel de agarose a 2%, execute o produto digerido para avaliar a edição e use um produto de PCR não digerido como controle de carga. Execute o gel a 135 V por 30 min.
      NOTA: O uso de HinfI como uma enzima de restrição apropriada foi selecionado devido a um local de HinfI convenientemente localizado presente na região alvo do sgRNA que se prevê que seja ablado após uma edição bem-sucedida do NHEJ. Um método detalhado e os resultados foram descritos anteriormente 9,16.
    9. (Controle opcional) Para as mutações mediadas por HDR que utilizem o Tyr como controlo positivo, digerir 10 μL dos produtos de PCR aninhados a partir da fase 6.2.7, incubando a 37 °C durante 4 h utilizando 10 U de EcoRI numa reacção de 20 μL (ver quadro suplementar 10). Em um gel de agarose a 2%, execute o produto digerido para avaliar a edição e use um produto de PCR não digerido como controle de carga. Execute o gel a 135 V por 30 min.
      NOTA: A escolha do EcoRI como uma enzima de restrição diagnóstica aproveita a sequência original encontrada na região-alvo do sgRNA, onde, após o HDR bem-sucedido, o local HinfI que ocorre naturalmente é substituído por um site EcoRI e uma mutação de deslocamento de quadro é forçada que interfere com o gene Tyr. Para a análise HDR, execute as análises NHEJ (etapa 6.2.8) e HDR (etapa 6.2.9) em cada amostra, pois ambos os resultados podem ocorrer e podem ajudar a determinar o mosaicismo. Um método detalhado e os resultados foram descritos anteriormente 9,16.

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Representative Results

Este método gera mais de 100 μg de sgRNA (20 μL a >concentração de 6.000 ng/L) para uma montagem eficiente do RNP Cas9/sgRNA. O método de superovulação de rotina descrito aqui normalmente produz 10-20 embriões viáveis por fêmea entupida. Devido a erros de manuseio e perdas típicas associadas à manipulação embrionária, espera-se que 80% dos embriões sejam fertilizados, viáveis e em excelente condição após a eletroporação. Para ajudar os pesquisadores a executar um experimento bem-sucedido, fornecemos um exemplo de estratégia para direcionar o locus Tyr do camundongo como um controle positivo (Figura 6), incluindo desenhos de oligo (Figura 6A, Tabela Suplementar 1) e estratégias de genotipagem para eventos NHEJ e HDR (Figura 6B) (etapa 6.2). Exemplos detalhados de sucesso e resultados experimentais estão disponíveis 9,16.

Em um esforço anterior para comparar esse protocolo à microinjeção, coletivamente, mais de 30 tentativas de edição distintas envolvendo sete laboratórios distintos para gerar modelos de camundongos foram todas bem-sucedidas 9,16. Além disso, esse método foi utilizado para investigar e relatar o primeiro retrotransposon essencial no desenvolvimento de mamíferos27. Ao utilizar uma estratégia simples, como a entrega de um único sgRNA, a entrega de RNPs foi de até 100% e incluindo 100% nas cepas de camundongos C57BL/6J e C57BL/6N, com formação in/del ocorrendo em 50-100% e pequenas substituições oligo-baseadas variando de 14%-63%9,16 (Tabela 1). Ao projetar deleções genômicas, a eficácia da edição pode variar de 3% a 100%, onde os fatores contribuintes incluem localização genômica, design de sgRNA e o tamanho da deleção (Tabela 2). Por exemplo, exclusões menores que 1.000 pb são mais bem-sucedidas do que aquelas maiores que 1.000 pb 9,16.

Ao usar 60 embriões para eletroporação, este protocolo supera a microinjeção em termos de eficácia de edição, resultando em 3-4 animais fundadores em comparação com um fundador da microinjeção9. Para experimentos de knockout de genes na cepa de camundongos C57BL/6N usando sgRNA idêntico, esse método superou a microinjeção, produzindo uma média de quatro animais fundadores9 (Tabela 2). Para pequenas inserções, como a marcação V5 ou HA, ssODNs de até 162 nt foram testados com sucesso, e os esforços atualmente visam escalar até 1000-2000 nt. O sucesso desses experimentos depende em grande parte da eficácia do sgRNA usado para que os resultados do HDR sejam robustos. Quase todos os desfechos de HDR são em mosaico, mas entre 31% e 64% dos embriões apresentam alguma evidência de inserções 9,16.

Figure 1
Figura 1: Visão geral do CRISPR-EZ. Uma visão geral gráfica do fluxo de trabalho. Uma vez que uma estratégia e design tenham sido feitos, embriões editados podem ser gerados e testados em aproximadamente 1 semana. Essa figura foi modificada com a permissão de Modzelewski et al.9. e Chen et al.16. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Momento ideal para a realização do procedimento. O diagrama mostra características relevantes e pontos de tempo durante a primeira divisão celular após a fertilização. Para realizar essa abordagem, os pesquisadores recebem algumas pistas visíveis, como mudanças morfológicas, estimativas de tempo do ciclo celular e marcadores químicos frequentemente observados antes da primeira clivagem. Como o momento exato da inseminação e fertilização é desconhecido, uma recomendação sensata seria considerar a hora 0 como meia-noite. Antes que o zigoto entre na fase S é o momento ideal para entregar máquinas de edição para NHEJ ou HDR, o que se traduz na execução deste protocolo entre as 7h e as 11h da manhã. Essa figura foi modificada com a permissão de Modzelewski et al.9. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Sucesso das estratégias de edição. Estratégias simples, como um único sgRNA, resultam em um reparo in/del via NHEJ ou uma mutação de precisão quando combinado com um modelo de ssODN através do HDR. O reparo NHEJ também pode ser utilizado para deleções usando vários sgRNAs. Em geral, quanto mais simples a estratégia, mais eficaz é a CRISPR-EZ sem otimização adicional. Essa figura foi modificada com a permissão de Modzelewski et al.9. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Localização do oviduto e da ampola. Depois de isolar cirurgicamente os tecidos reprodutivos, deve-se proteger a região aplicando uma pressão suave na almofada de gordura com pinça. A almofada de gordura é uma região relativamente segura para manipular para não prejudicar os ovários/oviduto. A área no quadrado tracejado deve ser removida e colocada em uma gota de M2 para posterior dissecção. Um diagrama de desenho animado mostra a região de interesse com as estruturas anatômicas relevantes rotuladas. Essa figura foi modificada com a permissão de Modzelewski et al.9. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Sugestão de processamento e configuração da placa de cultura. Esquemas mostrando várias configurações de placas para ajudar os pesquisadores na condução do processamento de embriões e da cultura. (A) Placa de lavagem típica M2+BSA. (B) Placa de M2+hialuronidase para remoção de células cumulus. (C) Placa de solução AT opcional para desbaste de Zona. (D) Placa KSOM+BSA para cultura de embriões, com sobreposição de óleo mineral necessária para manter o pH, a umidade e a temperatura. Essa figura foi modificada com a permissão de Modzelewski et al.9. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Exemplo de genotipagem para resultados NHEJ e HDR . (A) Um diagrama de desenho animado da região em torno do gene Tyr no genoma do rato. Abaixo estão os detalhes da sequência não editada (WT) onde um local de restrição HinfI de ocorrência natural é encontrado, que está dentro do site de reconhecimento alvo do sgRNA (texto vermelho). Abaixo disso, há um dos muitos resultados possíveis após a segmentação CRISPR/Cas9 bem-sucedida, onde um "in/del" é formado. A natureza exata desta edição é difícil de prever, mas quase certamente interromperá o site HinfI. Mais abaixo está a sequência oligo do doador que altera dois pares de bases para transformar o sítio HinfI em um local de reconhecimento EcoRI. (B) Resultados representativos de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) após a edição. Exemplos de edição NHEJ (superior) e HDR (inferior) são mostrados. Essa figura foi modificada com a permissão de Modzelewski et al.9. Essa figura foi modificada com a permissão de Modzelewski et al.9. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Fenótipo e viabilidade de zigotos e camundongos editados por Tyr. Esta tabela foi adaptada com permissão de Modzelewski et al.9. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Resultados dos experimentos de CRISPR-EZ e deleção por microinjeção. Esta tabela foi adaptada com permissão de Modzelewski et al.9. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela Suplementar 1: Lista de oligos e doadores ssODN. Esta tabela foi adaptada com permissão de Modzelewski et al.9. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Modelo de DNA para a configuração da reação de sgRNA. Esta tabela foi adaptada com permissão de Modzelewski et al.9. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Configuração de transcrição in vitro . Esta tabela foi modificada com permissão de Modzelewski et al.9. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 4: Configuração do complexo RNP para formação de NHEJ. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 5: Configuração do complexo RNP para formação de HDR. Esta tabela foi adaptada com permissão de Modzelewski et al.9. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 6: Configuração do complexo RNP para deleção. Esta tabela foi modificada com permissão de Modzelewski et al.9. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 7: Configuração de PCR de genotipagem. Esta tabela foi modificada com permissão de Modzelewski et al.9. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 8: Configuração de PCR de genotipagem aninhada. Esta tabela foi modificada com permissão de Modzelewski et al.9. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 9: Configuração do resumo de restrição do HinfI. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 10: Configuração do resumo de restrição EcoRi. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Apresentamos aqui uma tecnologia de edição de genoma de camundongo direta e altamente eficiente. A eletroporação pode ser usada para gerar embriões modificados em 1-2 semanas (Figura 1) e pode produzir camundongos editados dentro de 6 semanas9. Em comparação com protocolos baseados em eletroporação desenvolvidos contemporaneamente que fornecem RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,32, o método descrito aqui é conceitualmente semelhante e oferece eficiências na mesma faixa, com apenas pequenas diferenças no desenvolvimento de reagentes e parâmetros. Portanto, sugerimos que os leitores comparem e contrastem com base nas necessidades e no acesso aos equipamentos. Como o nome indica, este protocolo foi desenvolvido com "o laboratório médio de camundongos" em mente, com apenas métodos comuns (IVT, PCR, eletroforese em gel), reagentes (consumíveis padrão de cultura de embriões e tecidos) ou equipamentos (eletroporador e cuvetes comumente usados para transfecção bacteriana), que provavelmente são acessíveis à maioria dos laboratórios interessados e capazes de coletar embriões (ou gentilmente perguntando aos laboratórios vizinhos). Pesquisadores de nível de estudante de pós-graduação com habilidades básicas de manuseio de embriões podem testar a eficiência dos sgRNAs ou realizar experimentos de produção de dados várias vezes dentro do período de tempo de desenvolvimento pré-implantacional sem a necessidade de agendar com uma instalação central. No entanto, se o objetivo desejado é gerar modelos animais sem a necessidade de microinjeção ou manipulação embrionária, métodos menos intrusivos estão disponíveis 10,32.

Muitos fatores que afetam a eficiência do Cas9 estão sendo pesquisados ativamente, como a especificidade de um alvo genômico, parâmetros de sequência de sgRNA, acessibilidade e topologia do genoma e, especialmente, tipo de célula. Portanto, projetar e testar sgRNAs é crucial para o sucesso. Este protocolo e outros métodos de eletroporação desenvolvidos de forma independente foram otimizados para fornecer RNPs de proteína/sgRNA Cas9 de forma rápida e transitória em embriões em estágio zigoto, aumentando a eficiência e minimizando o mosaicismo devido ao parto em um estágio inicial de desenvolvimento e à meia-vida curta do RNP 7,9,10,11,12,13,14,15, 16,33,34.

Para as estratégias de edição de genoma mais comuns e várias cepas de camundongos, esse método pode superar as microinjeções em termos de custo, eficiência, pequenas inserções, mutações in/del, deleções de éxons, inserções e mutações pontuais9. Com o protocolo atual, este método é ideal para a criação de mutações in/del e deleções de até 2,6 kb, o que é muito mais longo do que o comprimento típico de um éxon codificador de proteínas de 170 pb35. Exclusões longas são menos eficientes; no entanto, essa limitação não é exclusiva desse protocolo. Portanto, à medida que a edição mediada por Cas9 é aprimorada e novas variantes de proteína Cas são desenvolvidas, a natureza modular desse método permite que essas melhorias aumentem diretamente as capacidades do nosso protocolo.

Embora esse método possa executar uma variedade de edições simples, seu potencial para estratégias maiores e mais complexas, como a inserção de alelos condicionais ou tags fluorescentes, está atualmente sendo testado em nosso laboratório. SsODNs mais longos poderiam fornecer uma abordagem viável para a edição complicada do genoma e mostraram sucesso na edição de embriões baseada em microinjeção36; no entanto, ssODNs mais longos são caros de sintetizar e ainda precisam ser testados extensivamente com eletroporação37. O uso de vírus adenoassociados (AAV) para introduzir sequências de doadores de até 3,3 kb também mostrou sucesso, mas pode não ser acessível à maioria dos laboratórios25. Por enquanto, recomendamos a edição padrão do genoma de células-tronco embrionárias e a microinjeção para a engenharia complexa do genoma de camundongos.

As preocupações com os efeitos fora do alvo da Cas9 permanecem 8,38,39. Variações de Cas9 modificadas podem aumentar a especificidade do alvo, embora isso não tenha sido totalmente investigado em estudos de eletroporação de embriões de RNP. O CRISPR-EZ pode ser um método útil para a criação de modelos de mutação compostos para explorar a genética complexa. Embora as microinjeções tenham tornado possível a edição simultânea de múltiplos loci40, métodos de eletroporação como o descrito aqui tornam isso mais conveniente e eficaz.

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Disclosures

Não há declarações financeiras relevantes dos autores.

Acknowledgments

A.J.M. criou o conceito original que levou ao desenvolvimento da CRISPR-EZ e produziu as figuras. C.K.D. compilou e adaptou os protocolos internos e publicados para este manuscrito atual. A.J.M. é suportado pelo NIH (R00HD096108).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette Bio-Rad cat. no. 1652089 Electroporation
26-G, 1/2-inch needle BD cat. no. 305111 Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice JAX cat. no. 000664 Superovulation
35-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 627-160 Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish Greiner Bio-One, cat. no. 628-160 Embryo Processing
6x loading dye Thermo Fisher Scientific cat. no. R0611 sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade Sigma-Aldrich, cat. no. T1788 Embryo Processing
BSA, embryo culture grade Sigma-Aldrich cat. no. A3311 Embryo Processing and Culture
Cas9 protein Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS cat. no. 1074181 Electroporation
DNase I, RNase-free New England BioLabs, cat. no. M0303 sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free) Gibco cat. no. 14190-144 Embryo Processing
EcoRI NEB cat. no. R3101S Genotyping
EDTA, anhydrous Sigma-Aldrich cat. no. EDS-100G RNP Buffer
Ethanol Koptec cat. no. V1016 sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade Fisher, cat. no. G7-500 Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP229 RNP Buffer
Taq Polymerase Promega cat. no. M712 Genotyping
HEPES, cell culture grade Sigma-Aldrich cat. no. H4034 RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL) NEB cat. no. R0155S Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs, cat. no. E2040 sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) Millipore cat. no. 230734 Superovulation
Hyaluronidase/M2 Millipore cat. no. MR-051-F Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) Zenith Biotech cat. no. ZEKS-050 Embryo Culture
LE agarose, analytical grade BioExpress cat. no. E-3120-500 sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium Zenith Biotech cat. no. ZFM2-050 Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. no. M8266 RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil Millipore cat. no. ES-005C Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40) Sigma-Aldrich cat. no. 74385 Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade Ambion cat. no. AM9937 sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping Integrated DNA Technologies custom orders sgRNA Design
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific cat. no. 31985062 Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase New England BioLabs, cat. no. M0530 sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) Sigma-Aldrich cat. no. P9333 RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) ProspecBio cat. no. HOR-272 Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade Fisher cat. no. BP1700-100 Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube VWR cat. no. 20170-333 sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes VWR cat. no. 82006-606 sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads GE Healthcare cat. no. 65152105050250 sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich cat. no. C4706 RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade Teknova cat. no. T1085 Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade Sigma-Aldrich cat. no. P7949-500 Lysis Buffer

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Biologia do Desenvolvimento Edição 190
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