生物医学アプリケーション向けの蛍光寿命マクロイメージャ
Summary
この論文では、長い崩壊発光サンプルの巨視的なフォトルミネッセンスライフタイムイメージングのための新しい高速光学イメージャーの使用について説明します。統合、画像取得、および分析手順、およびイメージング用のセンサー材料の準備と特性評価、および生物学的サンプルの研究におけるイメージャーの適用について説明します。
Abstract
この論文では、固体のO 2感受性コーティングから可溶性O2感受性プローブで染色された生きた動物組織サンプルまで、さまざまなリン光サンプル中の分子状酸素(O2)濃度をマッピングするように設計された新しいフォトルミネッセンスライフタイムイメージャーを紹介します。特に、625nmの発光ダイオード(LED)で励起可能で760nmで発光するナノ粒子ベースの近赤外プローブNanO2-IRを用いた。イメージングシステムは、Timepix3カメラ(Tpx3Cam)と、イメージインテンシファイアも収容するオプトメカニカルアダプターに基づいています。O2リン光寿命イメージング顕微鏡(PLIM)は、様々な研究に一般的に必要とされるが、現在のプラットフォームは、その精度、一般的な柔軟性、およびユーザビリティにおいて限界を有する。
ここで紹介するシステムは、統合された光学センサーと読み出しチップモジュールであるTpx3Cam上に構築された、高速で高感度のイメージャーです。表面染色された腸組織サンプルまたは大腸の管腔内染色断片から高強度のリン光シグナルおよび安定した寿命値を生成することが示され、約20秒以下で組織O2 レベルの詳細なマッピングを可能にする。無意識の動物の移植腫瘍における低酸素症のイメージングに関する最初の実験も提示されています。また、励起用の390 nm LEDと発光用のバンドパス650 nmフィルターを使用して、Pt-ポルフィリン色素に基づくO2感応材料で使用するためにイメージャを再構成する方法についても説明します。全体として、PLIMイメージャは、使用されたプローブの寿命値およびO2 濃度のそれぞれの2次元マップの正確な定量的測定値を生成することが見出された。また、 ex vivo 組織モデルや生きた動物の代謝イメージングにも有用です。
Introduction
O 2は生命システムにとって重要な環境パラメータの1つであり、O 2の分布とそのダイナミクスに関する知識は多くの生物学的研究にとって重要です1,2,3。リン光プローブ4,5,6,7,8およびPLIM9,10,11,12,13による組織酸素化の評価は、生物学的および医学的研究3,9,14,15,16において人気を集めている。 17、18、19。これは、PLIMが蛍光や燐光強度の測定とは異なり、プローブ濃度、光退色、励起強度、光学アライメント、散乱、自家蛍光などの外的要因の影響を受けないためです。
しかしながら、現在のO2 PLIMプラットフォームは、それらの感度、画像取得速度、精度、および一般的なユーザビリティによって制限される。ラスタースキャン手順と組み合わせた時間相関単一光子計数(TCSPC)は、PLIMおよび蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)デバイス20、21、22で頻繁に使用されます。しかしながら、PLIMは長いピクセル滞留時間(ミリ秒の範囲)を必要とするので、画像取得の時間は、FLIMアプリケーション20、22、23に必要とされる時間よりもはるかに長い。ゲート付きCCD / CMOSカメラなどの他の技術は、単一光子感度に欠け、フレームレートが低い20,24,25,26です。さらに、既存のPLIMシステムは主に微視的フォーマットで使用されていますが、巨視的システムはあまり一般的ではありません27。
TCSPCベースのPLIMマクロイメージャ28 は、これらの制限の多くを克服するためにセットアップされた。イメージャーの設計は、次の新しいオプトメカニカルアダプターCricketを使用することで大幅に容易になりました:i)背面のカメラモジュールと前面の対物レンズを簡単に結合できる2つのCマウントアダプター。ii)イメージインテンシファイア用の内部ハウジングと、クリケットの外側にある後者用の電源ソケット。iii)前面Cマウントアダプターの後ろの内部スペースで、標準の25mmエミッションフィルターをインテンシファイアの前に収納できます。iv)リングレギュレーターを備えた内蔵の光コリメート光学系により、レンズとカメラ間の光学的位置合わせ/焦点合わせが可能になり、カメラチップ上に鮮明な画像が生成されます。
組み立てられたイメージャーでは、カメラモジュールはクリケットアダプターの裏側に結合され、光電陰極とそれに続くマイクロチャネルプレート(MCP)、増幅器、および高速シンチレーターであるP47蛍光体で構成されるイメージインテンシファイアも収容されています。クリケットの内部には760nm±50nmの発光フィルターが取り付けられ、前面のCマウントアダプターには対物レンズNMV-50M11”が取り付けられています。最後に、レンズとカメラはリングレギュレーターと光学的に位置合わせされます。
インテンシファイアの役割は、入射する光子を検出し、それらをカメラチップ上で高速の光バーストに変換することであり、それらは登録され、発光減衰と生涯画像を生成するために使用されます。カメラモジュールは、高度なTCSPCベースの光学センサーアレイ(256ピクセルx 256ピクセル)と新世代の読み出しチップ29,30,31,32,33で構成されており、1.6nsの時間分解能と80Mpixel/sの読み出し速度で、イメージングチップの各ピクセルでのフォトンバーストの到着時間(TOA)と時間超過しきい値(TOT)の同時記録を可能にします。
この構成では、インテンシファイアを備えたカメラは単一光子感度を有する。これは、データ駆動型であり、高速ピクセル検出器読み出し(SPIDR)システム34に基づいている。イメージャの空間分解能は、平面燐光O2 センサおよび分解能プレートマスクを用いて予め特徴付けられた。機器の応答関数(IRF)は、他のすべての測定に使用したのと同じ設定で平面蛍光センサーのイメージングによって測定されました。約2.6nsの色素の寿命は、PLIMモードでのIRF測定に使用するのに十分短かった。イメージャは、最大18 mm x 18 mmのサイズのオブジェクトを、それぞれ39.4 μmおよび30.6 ns(半値で全幅)の空間分解能と時間分解能でイメージングできます28。
以下のプロトコルは、マクロイメージャの組み立て、および以前に特徴付けられた近赤外O2プローブ、NanO2−IR35で染色された生物学的試料中のO2濃度をマッピングするためのその後の使用について記載している。このプローブは、白金(II)ベンゾポルフィリン(PtBP)色素をベースにした、明るく光安定性のある細胞透過性のO2センシングプローブです。それは625nmで励起性であり、760nmで放出し、生理学的範囲(0%〜21%または0〜210μMのO2)のO2に対して堅牢な光学応答を提供する。イメージャーは、Pt(II)-ポルフィリン色素に基づくさまざまなセンサー材料の特性評価も実証されています。全体として、イメージャーはコンパクトで柔軟性があり、一般的な写真カメラに似ています。現在のセットアップでは、イメージャはさまざまな広視野PLIMアプリケーションに適しています。LEDを高速レーザー光源に置き換えると、イメージャの性能がさらに向上し、ナノ秒のFLIMアプリケーションが可能になる可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記のプロトコルは、新しいイメージャのアセンブリとマイクロ秒FLIM/PLIMモードでの動作の詳細な説明を提供します。TCSPCベースの新世代Tpx3Camカメラは、イメージインテンシファイア、発光フィルター、マクロレンズを備えたオプトメカニカルアダプターCricketによって組み合わされ、操作が容易な安定したコンパクトで柔軟な光学モジュールを生成します。イメージャーは、燐光発光材料の…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アイルランド科学財団からのこの研究への財政的支援、SFI/12/RC/2276_P2、SFI/17/RC-PhD/3484および18/SP/3522、およびBreakthrough Cancer Research(Precision Oncology Ireland)は感謝の意を表します。
Materials
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
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