Fluorescence Lifetime Macro Imager para aplicações biomédicas

Summary

Este artigo descreve o uso de um novo imageador óptico rápido para a imagem macroscópica da vida útil da fotoluminescência de amostras emissoras de decaimento longo. Os procedimentos de integração, aquisição e análise das imagens são descritos, juntamente com a preparação e caracterização dos materiais sensores para a aquisição de imagens e a aplicação do imageador no estudo de amostras biológicas.

Abstract

Este trabalho apresenta um novo imageador de vida útil de fotoluminescência projetado para mapear a concentração de oxigênio molecular (O 2) em diferentes amostras fosforescentes, desde revestimentos sensíveis ao estado sólido do tipo O 2 até amostras de tecido animal vivo coradas com sondas solúveis sensíveis ao O₂. Em particular, a sonda de infravermelho próximo NanO2-IR, baseada em nanopartículas, que é excitável com um diodo emissor de luz (LED) de 625 nm e emite a 760 nm, foi usada. O sistema de imagem é baseado na câmera Timepix3 (Tpx3Cam) e no adaptador optomecânico, que também abriga um intensificador de imagem. A microscopia de imagem ao longo da vida da fosforescência (PLIM) do O₂ é comumente necessária para vários estudos, mas as plataformas atuais têm limitações em sua precisão, flexibilidade geral e usabilidade.

O sistema apresentado aqui é um imager rápido e altamente sensível, que é construído sobre um sensor óptico integrado e módulo de chip de leitura, Tpx3Cam. É mostrado para produzir sinais de fosforescência de alta intensidade e valores estáveis de vida a partir de amostras de tecido intestinal corados superficialmente ou fragmentos intraluminalmente corados do intestino grosso e permite o mapeamento detalhado dos níveis de tecido O₂ em cerca de 20 s ou menos. Experimentos iniciais sobre a imagem de hipóxia em tumores enxertados em animais inconscientes também são apresentados. Também descrevemos como o imageador pode ser reconfigurado para uso com materiais sensíveis ao O₂ baseados em corantes Pt-porfirina usando um LED de 390 nm para a excitação e um filtro passa-banda de 650 nm para emissão. Em geral, o imageador PLIM produziu medidas quantitativas precisas dos valores de vida útil das sondas usadas e respectivos mapas bidimensionais da concentração de O₂ . Também é útil para a obtenção de imagens metabólicas de modelos teciduais ex vivo e animais vivos.

Introduction

O 2 é um dos principais parâmetros ambientais para sistemas vivos, e o conhecimento da distribuição do O 2 e sua dinâmica é importante para muitos estudos biológicos _1,2,3. A avaliação da oxigenação tecidual por meio de sondas fosforescentes 4,5,6,7,8 e PLIM 9,10,11,12,13 vem ganhando popularidade nas pesquisas biológicas e médicas 3,9,14,15,16^{, 17,18,19}. Isso ocorre porque o PLIM, ao contrário das medidas de fluorescência ou intensidade de fosforescência, não é afetado por fatores externos, como concentração de sonda, fotobranqueamento, intensidade de excitação, alinhamento óptico, espalhamento e autofluorescência.

No entanto, as plataformas PLIM O₂ atuais são limitadas por sua sensibilidade, velocidade de aquisição de imagem, precisão e usabilidade geral. A contagem de fótons únicos correlacionada ao tempo (TCSPC), combinada com um procedimento de varredura raster, é frequentemente usada em dispositivos de PLIM e fluorescência de microscopia de imagem de tempo de vida (FLIM)^20,21,22. No entanto, como o PLIM requer um longo tempo de permanência de pixels (na faixa de milissegundos), o tempo de aquisição da imagem é muito maior do que o necessário para aplicações FLIM^20,22,23. Outras técnicas, como câmeras CCD/CMOS fechadas, não possuem sensibilidade a fótons únicos e apresentam baixas taxas de quadros^20,24,25,26. Além disso, os sistemas PLIM existentes são mais utilizados no formato microscópico, enquanto os sistemas macroscópicos são menos comuns²⁷.

O imageador de macro PLIM²⁸ baseado em TCSPC foi configurado para superar muitas dessas limitações. O design do imageador foi muito facilitado pelo uso de um novo adaptador optomecânico, Cricket, que tem o seguinte: i) dois adaptadores C-mount, que fornecem fácil acoplamento do módulo da câmera no lado traseiro e lente objetiva no lado frontal; ii) uma carcaça interna para um intensificador de imagem e uma tomada para este último no lado externo do Grilo; iii) um espaço interno atrás do adaptador de montagem em C frontal, onde um filtro de emissão padrão de 25 mm pode ser alojado na frente do intensificador; e iv) uma óptica de colima de luz integrada com reguladores de anel, que permitem o alinhamento/focalização óptico entre a lente e a câmera para produzir imagens nítidas no chip da câmera.

No imageador montado, o módulo da câmera é acoplado à parte traseira do adaptador Cricket, que também abriga um intensificador de imagem composto por um fotocátodo seguido por uma placa de microcanal (MCP), um amplificador e um cintilador rápido, fósforo P47. Um filtro de emissão de 760 nm ± 50 nm é instalado dentro do Cricket, e uma lente objetiva, NMV-50M11”, é conectada ao adaptador de montagem C frontal lateral. Finalmente, a lente e a câmera estão alinhadas opticamente com reguladores de anel.

O papel do intensificador é detectar fótons de entrada e convertê-los em rajadas rápidas de luz no chip da câmera, que são registradas e usadas para gerar decaimentos de emissão e imagens vitalícias. O módulo da câmera é composto por um avançado conjunto de sensores ópticos baseados em TCSPC (256 pixels x 256 pixels) e um chip de leitura de nova geração 29,30,31,32,33, que permitem a gravação simultânea do tempo de chegada (TOA) e do tempo sobre o limiar (TOT) de rajadas de fótons em cada pixel do chip de imagem com uma resolução de tempo de ^1,6 ns e uma taxa de leitura de 80 Mpixel/s.

Nessa configuração, a câmera com o intensificador tem sensibilidade de fóton único. É orientado por dados e baseado no sistema de leitura rápida do detector de pixels (SPIDR)³⁴. A resolução espacial do imageador foi previamente caracterizada com sensores planares fosforescentes O₂ e uma máscara de placa de resolução. A função de resposta do instrumento (IRF) foi medida pela imagem de um sensor fluorescente planar sob as mesmas configurações usadas para todas as outras medidas. A vida útil do corante de cerca de 2,6 ns foi curta o suficiente para que ele fosse usado para a medição de IRF no modo PLIM. O imageador pode obter imagens de objetos de até 18 mm x 18 mm de tamanho com resoluções espaciais e temporais de 39,4 μm e 30,6 ns (largura total na metade do máximo), respectivamente²⁸.

Os protocolos a seguir descrevem a montagem do macroimageador e seu posterior uso para mapeamento da concentração de O 2 em amostras biológicas coradas com a sonda de infravermelho próximo O₂ previamente caracterizada, NanO2-IR³⁵. A sonda é uma sonda de detecção de O₂ brilhante, fotoestável, permeável a células, baseada no corante de platina (II) benzoporfirina (PtBP). É excitável a 625 nm, emite a 760 nm e fornece uma resposta óptica robusta ao O 2 na faixa fisiológica (0%-21% ou 0-210 μM de O₂). O imageador também demonstrou caracterizar diferentes materiais sensores baseados em corantes Pt(II)-porfirina. No geral, o imageador é compacto e flexível, semelhante a uma câmera fotográfica comum. Na configuração atual, o imageador é apropriado para diferentes aplicações PLIM de campo amplo. A substituição do LED por uma fonte de laser rápida melhorará ainda mais o desempenho do imageador e poderá potencialmente permitir aplicações FLIM de nanossegundos.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram realizados sob autorizações emitidas pela Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irlanda) de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias (2010/63/EU) e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da University College Cork. 1. Preparação da amostra Coloração com sonda de amostras de tecidos vivos ex vivoPara aplicações ex vivo , use amostras de tecido…

Representative Results

Para aplicações de imagem ex vivo , fragmentos de tecido intestinal foram corados pela aplicação tópica da sonda NanO2-IR no lado seroso do tecido. Para uma coloração mais profunda, 1 μL da sonda foi injetado no lúmen. Neste último caso, a parede intestinal de 0,2-0,25 mm de espessura protegeu a sonda da câmera. Os dois processos de coloração estão demonstrados na Figura 2A. As imagens resultantes de intensidade e PLIM estão apresentadas na…

Discussion

Os protocolos acima fornecem uma descrição detalhada da montagem do novo imageador e seu funcionamento no modo FLIM/PLIM de microssegundos. A câmera Tpx3Cam de nova geração baseada em TCSPC, acoplada por meio do adaptador optomecânico Cricket com o intensificador de imagem, filtro de emissão e macrolente, produz um módulo óptico estável, compacto e flexível que é fácil de operar. O imageador mostrou um bom desempenho com uma variedade de diferentes amostras e tarefas analíticas, que incluíram a caracteriza…

Materials

627 nm LED	Parts Express		Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.
760 ± 50 nm emission filter	Edmund Optics	84-788	Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.
Balb/c mice	Envigo, UK	Balb/c
Black box	Thorlabs	XE25C9/M
Cricket Adapter	Photonis	Cricket-2
CT26 cells	ATCC	CT26.WT	https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM	Sigma-Aldrich	D0697	Other media can also be used
ImageJ Software	ImageJ		Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen	Photonis	PP0360EF
Mini dishes	Sarstedt	83.3900.300	35 mm diameter
Mylar plastic film, 75 micron	RS Ireland	785-0795	Othe plastic substrates can also be used
NanO2-IR	home-made	n/a	The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab.
NMV-50M11” 50 mm lens	Navitar		Other lenses compatibel with C-mount adators can be used
Optical breadboard	Thorlabs	MB1836
Petri Dishes	Sarstedt	82.1472.001	92 mm diameter
Power Supply	Tenma	72-10495
Pulse Generator	Tenma	TGP110
Sophy	Amsterdam Scientific Instruments	n/z	Provided by ASI together with the Tpx3Cam
Tpx3Cam	Amsterdam Scientific Instruments	TPXCAM
Tri2 Software	University of Oxford	n/a	Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation Stage	Thorlabs	LT3