Fluorescens levetid makro imager til biomedicinske applikationer
Summary
Dette papir beskriver brugen af et nyt, hurtigt optisk kamera til makroskopisk fotoluminescens levetidsbilleddannelse af prøver med lang henfaldsemission. Integrations-, billedoptagelses- og analyseprocedurerne beskrives sammen med forberedelsen og karakteriseringen af sensormaterialerne til billeddannelse og anvendelse af billeddanneren til undersøgelse af biologiske prøver.
Abstract
Dette papir præsenterer et nyt fotoluminescenslevetidskamera designet til at kortlægge koncentrationen af molekylært ilt (O2) i forskellige fosforescerende prøver, der spænder fra faststof, O2-følsomme belægninger til levende animalske vævsprøver farvet med opløseligeO2-følsomme sonder. Især blev den nanopartikelbaserede nær-infrarøde sonde NanO2-IR, som er spændende med en 625 nm lysemitterende diode (LED) og udsender ved 760 nm, brugt. Billedbehandlingssystemet er baseret på Timepix3-kameraet (Tpx3Cam) og den optomekaniske adapter, som også huser en billedforstærker. O2 phosphorescens levetid billeddannelse mikroskopi (PLIM) er almindeligt påkrævet for forskellige undersøgelser, men nuværende platforme har begrænsninger i deres nøjagtighed, generelle fleksibilitet og brugervenlighed.
Systemet, der præsenteres her, er et hurtigt og meget følsomt kamera, der er bygget på en integreret optisk sensor og udlæsningschipmodul, Tpx3Cam. Det er vist at producere højintensive phosphorescenssignaler og stabile levetidsværdier fra overfladefarvede tarmvævsprøver eller intraluminalt farvede fragmenter af tyktarmen og muliggør detaljeret kortlægning af vævO2-niveauer i ca. 20 s eller mindre. Indledende forsøg på billeddannelse af hypoxi i podede tumorer hos bevidstløse dyr præsenteres også. Vi beskriver også, hvordan kameraet kan omkonfigureres til brugmed O2-følsomme materialer baseret på Pt-porfyrinfarvestoffer ved hjælp af en 390 nm LED til excitation og et båndpas 650 nm filter til emission. Samlet set viste PLIM-kameraet sig at producere nøjagtige kvantitative målinger af levetidsværdier for de anvendte sonder og respektive todimensionelle kort overO2-koncentrationen . Det er også nyttigt til metabolisk billeddannelse af ex vivo vævsmodeller og levende dyr.
Introduction
O 2 er et af de vigtigste miljøparametre for levende systemer, og viden om fordelingen af O 2 og dens dynamik er vigtig for mange biologiske undersøgelser 1,2,3. Vurderingen af vævets iltning ved hjælp af fosforescerende sonder 4,5,6,7,8 og PLIM 9,10,11,12,13 vinder popularitet inden for biologisk og medicinsk forskning 3,9,14,15,16, 17,18,19. Dette skyldes, at PLIM, i modsætning til fluorescens- eller phosphorescensintensitetsmålinger, ikke påvirkes af eksterne faktorer såsom sondekoncentration, fotoblegning, excitationsintensitet, optisk justering, spredning og autofluorescens.
Imidlertid er nuværende O2 PLIM-platforme begrænset af deres følsomhed, billedoptagelseshastighed, nøjagtighed og generelle brugervenlighed. Tidskorreleret enkeltfotontælling (TCSPC) kombineret med en rasterscanningsprocedure bruges ofte i PLIM- og FLIM-enheder (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) 20,21,22. Men da PLIM kræver en lang pixelopholdstid (i millisekundområdet), er tiden for billedoptagelse meget længere end hvad der kræves til FLIM-applikationer20,22,23. Andre teknikker, såsom gated CCD / CMOS-kameraer, mangler enkelt fotonfølsomhed og har lave billedhastigheder20,24,25,26. Desuden anvendes de eksisterende PLIM-systemer mest i mikroskopisk format, mens makroskopiske systemer er mindre almindelige27.
Det TCSPC-baserede PLIM macro imager28 blev oprettet for at overvinde mange af disse begrænsninger. Kameraets design blev i høj grad lettet ved brug af en ny optomekanisk adapter, Cricket, som har følgende: i) to C-mount-adaptere, som giver nem kobling af kameramodulet på bagsiden og objektivobjektiv på forsiden; ii) et indvendigt hus til en billedforstærker og en stikkontakt til sidstnævnte på ydersiden af cricket; iii) et indvendigt rum bag C-monteringsadapteren på forsiden, hvor et standard 25 mm emissionsfilter kan anbringes foran forstærkeren og iv) en indbygget lyskolliderende optik med ringregulatorer, som tillader optisk justering / fokusering mellem linsen og kameraet for at producere skarpe billeder på kamerachippen.
I det samlede kamera er kameramodulet koblet til bagsiden af Cricket-adapteren, som også huser en billedforstærker bestående af en fotokatode efterfulgt af en mikrokanalplade (MCP), en forstærker og en hurtig scintillator, P47-fosfor. Et 760 nm ± 50 nm emissionsfilter er monteret inde i Cricket, og en objektivlinse, NMV-50M11”, er fastgjort til C-mount-adapteren på forsiden. Endelig er linsen og kameraet justeret optisk med ringregulatorer.
Forstærkerens rolle er at detektere indkommende fotoner og omdanne dem til hurtige lysudbrud på kamerachippen, som registreres og bruges til at generere emissionshenfald og levetidsbilleder. Kameramodulet består af et avanceret TCSPC-baseret optisk sensorarray (256 pixels x 256 pixels) og en ny generation af udlæsningschip 29,30,31,32,33, som muliggør samtidig registrering af ankomsttidspunktet (TOA) og tiden over tærsklen (TOT) for fotonudbrud ved hver pixel i billedchippen med en tidsopløsning på 1,6 ns og en udlæsningshastighed på 80 Mpixel/s.
I denne konfiguration har kameraet med forstærkeren enkeltfotonfølsomhed. Det er datadrevet og baseret på SPIDR-systemet (Speedy Pixel Detector Readout)34. Den rumlige opløsning af billeddanneren var tidligere karakteriseret med plane fosforescerendeO2-sensorer og en opløsningsplademaske. Instrumentresponsfunktionen (IRF) blev målt ved billeddannelse af en plan fluorescerende sensor under de samme indstillinger, som blev brugt til alle de andre målinger. Farvestoffets levetid på omkring 2,6 ns var kort nok til, at det kunne bruges til IRF-måling i PLIM-tilstand. Kameraet kan afbilde objekter på op til 18 mm x 18 mm i størrelse med rumlige og tidsmæssige opløsninger på henholdsvis 39,4 μm og 30,6 ns (fuld bredde ved halv maksimum)28.
Følgende protokoller beskriver samlingen af makrokameraet og dets efterfølgende anvendelse til kortlægning af O2-koncentrationen i biologiske prøver farvet med den tidligere karakteriserede nær-infrarødeO2-sonde, NanO2-IR35. Sonden er en lys, fotobar, cellegennemtrængelig O2-sensing sonde baseret på platin (II) benzoporphyrin (PtBP) farvestof. Det er spændende ved 625 nm, udsender ved 760 nm og giver et robust optisk respons på O2 i det fysiologiske område (0% -21% eller 0-210 μMO2). Billeddanneren er også demonstreret for at karakterisere forskellige sensormaterialer baseret på Pt(II)-porfyrinfarvestoffer. Samlet set er kameraet kompakt og fleksibelt, svarende til et almindeligt fotografisk kamera. I den nuværende opsætning er imageren velegnet til forskellige widefield PLIM-applikationer. Udskiftning af LED’en med en hurtig laserkilde vil yderligere forbedre billeddannerens ydeevne og kan potentielt muliggøre nanosekund FLIM-applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovenstående protokoller giver en detaljeret beskrivelse af samlingen af det nye kamera og dets funktion i mikrosekund FLIM/PLIM-tilstand. Det TCSPC-baserede nye generation Tpx3Cam-kamera, kombineret med den optomekaniske adapter Cricket med billedforstærkeren, emissionsfilteret og makroobjektivet, producerer et stabilt, kompakt og fleksibelt optisk modul, der er let at betjene. Billeddanneren viste sig at fungere godt med en række forskellige prøver og analytiske opgaver, som omfattede karakterisering af fosforescere…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Økonomisk støtte til dette arbejde fra Science Foundation Ireland, tilskud SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 og 18/SP/3522 og Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) anerkendes med taknemmelighed.
Materials
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
Referências
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
- Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
- Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors – IMCS. , 71-72 (2018).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- O’Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
- Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
- Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
- Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
- Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
- Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
- Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
- Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
- Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
- Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
- Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
- Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
- Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging – Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).
- Becker, W., König, K. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).
- Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
- Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
- Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
- Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
- Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. . Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).
- Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
- Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
- Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
- Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
- Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
- Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
- Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
- Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
- Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
- Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
- Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. Fluorescence lifetime imaging. Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).
