Macro-imageur à vie de fluorescence pour applications biomédicales

Summary

Cet article décrit l’utilisation d’un nouvel imageur optique rapide pour l’imagerie macroscopique à vie par photoluminescence d’échantillons émettant de longues désintégrations. Les procédures d’intégration, d’acquisition d’images et d’analyse sont décrites, ainsi que la préparation et la caractérisation des matériaux du capteur pour l’imagerie et l’application de l’imageur dans l’étude d’échantillons biologiques.

Abstract

Cet article présente un nouvel imageur à durée de vie par photoluminescence conçu pour cartographier la concentration d’oxygène moléculaire (_O2) dans différents échantillons phosphorescents allant des revêtements sensibles à l’état solide à l’O 2 aux échantillons de tissus animaux vivants colorés avec des sondes solubles sensibles à l’O₂. En particulier, la sonde proche infrarouge à base de nanoparticules NanO2-IR, qui est excitable avec une diode électroluminescente (LED) de 625 nm et émet à 760 nm, a été utilisée. Le système d’imagerie est basé sur la caméra Timepix3 (Tpx3Cam) et l’adaptateur opto-mécanique, qui abrite également un intensificateur d’image. La microscopie d’imagerie à vie par phosphorescence O₂ (PLIM) est couramment requise pour diverses études, mais les plates-formes actuelles ont des limites dans leur précision, leur flexibilité générale et leur facilité d’utilisation.

Le système présenté ici est un imageur rapide et très sensible, construit sur un capteur optique intégré et un module de puce de lecture, Tpx3Cam. Il est démontré qu’il produit des signaux de phosphorescence de haute intensité et des valeurs de vie stables à partir d’échantillons de tissus intestinaux colorés en surface ou de fragments du gros intestin colorés par voie intraluminale et permet la cartographie détaillée des niveaux de tissu O₂ en environ 20 s ou moins. Des expériences initiales sur l’imagerie de l’hypoxie dans les tumeurs greffées chez des animaux inconscients sont également présentées. Nous décrivons également comment l’imageur peut être reconfiguré pour une utilisation avec des matériaux sensibles à l’O2 à base de colorants Pt-porphyrine à l’aide d’une LED de 390 nm pour l’excitation et d’un filtre passe-bande de 650 nm pour l’émission. Dans l’ensemble, on a constaté que l’imageur PLIM produisait des mesures quantitatives précises des valeurs de durée de vie des sondes utilisées et des cartes bidimensionnelles respectives de la concentration d’O2. Il est également utile pour l’imagerie métabolique de modèles tissulaires ex vivo et d’animaux vivants.

Introduction

O2 est l’un des paramètres environnementaux clés pour les systèmes vivants, et la connaissance de la distribution de_O2 et de sa dynamique est importante pour de nombreuses études biologiques 1,2,3. L’évaluation de l’oxygénation des tissus au moyen des sondes phosphorescentes 4,5,6,7,8 et PLIM 9,10,11,12,13 gagne en popularité dans la recherche biologique et médicale 3,9,14,15,16^{, 17,18,19}. En effet, le PLIM, contrairement aux mesures de fluorescence ou d’intensité de phosphorescence, n’est pas affecté par des facteurs externes tels que la concentration de la sonde, le photoblanchiment, l’intensité de l’excitation, l’alignement optique, la diffusion et l’autofluorescence.

Cependant, les plates-formes PLIM O₂ actuelles sont limitées par leur sensibilité, leur vitesse d’acquisition d’images, leur précision et leur facilité d’utilisation générale. Le comptage monophotonique corrélé dans le temps (TCSPC), combiné à une procédure de balayage raster, est fréquemment utilisé dans les dispositifs PLIM et FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy)^20,21,22. Cependant, comme PLIM nécessite un long temps de séjour des pixels (de l’ordre de la milliseconde), le temps d’acquisition de l’image est beaucoup plus long que ce qui est requis pour les applications FLIM^20,22,23. D’autres techniques, telles que les caméras CCD/CMOS fermées, manquent de sensibilité à un seul photon et ont de faibles fréquences d’images^20,24,25,26. De plus, les systèmes PLIM existants sont principalement utilisés au format microscopique, tandis que les systèmes macroscopiques sont moins courants²⁷.

L’imageur de macro PLIM²⁸ basé sur TCSPC a été configuré pour surmonter bon nombre de ces limitations. La conception de l’imageur a été grandement facilitée par l’utilisation d’un nouvel adaptateur opto-mécanique, Cricket, qui a les éléments suivants: i) deux adaptateurs à monture C, qui permettent un couplage facile du module de caméra à l’arrière et de l’objectif de l’objectif à l’avant; ii) un boîtier interne pour un intensificateur d’image et une prise de courant pour ce dernier sur la face extérieure du grillon; iii) un espace interne derrière l’adaptateur à monture C de la face avant où un filtre d’émission standard de 25 mm peut être logé devant l’intensificateur; et iv) une optique de collimature lumineuse intégrée avec des régulateurs annulaires, qui permettent l’alignement optique / mise au point entre l’objectif et la caméra pour produire des images nettes sur la puce de l’appareil photo.

Dans l’imageur assemblé, le module de caméra est couplé à l’arrière de l’adaptateur Cricket, qui abrite également un intensificateur d’image composé d’une photocathode suivie d’une plaque à microcanaux (MCP), d’un amplificateur et d’un scintillateur rapide, le phosphore P47. Un filtre d’émission de 760 nm ± 50 nm est installé à l’intérieur du Cricket, et un objectif d’objectif, NMV-50M11”, est fixé à l’adaptateur de monture C de la face avant. Enfin, l’objectif et la caméra sont alignés optiquement avec des régulateurs annulaires.

Le rôle de l’intensificateur est de détecter les photons entrants et de les convertir en rafales de lumière rapides sur la puce de la caméra, qui sont enregistrées et utilisées pour générer des désintégrations d’émission et des images à vie. Le module de caméra comprend un réseau avancé de capteurs optiques basés sur TCSPC (256 pixels x 256 pixels) et une puce de lecture de nouvelle génération 29,30,31,32,33, qui permettent l’enregistrement simultané de l’heure d’arrivée (TOA) et du temps au-delà du seuil (TOT) des sursauts de photons à chaque pixel de la puce d’imagerie avec une résolution temporelle de ^1,6 ns et un taux de lecture de 80 Mpixel / s.

Dans cette configuration, la caméra avec l’intensificateur a une sensibilité à photon unique. Il est axé sur les données et basé sur le système de lecture rapide du détecteur de pixels (SPIDR)³⁴. La résolution spatiale de l’imageur était auparavant caractérisée par des capteurs O₂ phosphorescents planaires et un masque de plaque de résolution. La fonction de réponse de l’instrument (IRF) a été mesurée par l’imagerie d’un capteur fluorescent planaire sous les mêmes réglages que ceux utilisés pour toutes les autres mesures. La durée de vie du colorant d’environ 2,6 ns était suffisamment courte pour qu’il puisse être utilisé pour la mesure IRF en mode PLIM. L’imageur peut imager des objets d’une taille maximale de 18 mm x 18 mm avec des résolutions spatiales et temporelles de 39,4 μm et 30,6 ns (pleine largeur à la moitié maximum), respectivement²⁸.

Les protocoles suivants décrivent l’assemblage du macroimageur et son utilisation ultérieure pour cartographier la concentration d’O2 dans des échantillons biologiques colorés avec la sonde O₂ proche infrarouge précédemment caractérisée,_NanO2-IR ³⁵. La sonde est une sonde de détection O₂ brillante, photostable, perméable aux cellules, à base de colorant benzoporphyrine (PtBP) en platine (II). Il est excitable à 625 nm, émet à 760 nm et fournit une réponse optique robuste à_O2 dans la gamme physiologique (0%-21% ou 0-210 μM de O₂). Il est également démontré que l’imageur caractérise différents matériaux de capteur à base de colorants à porphyrine Pt(II). Dans l’ensemble, l’imageur est compact et flexible, similaire à un appareil photo commun. Dans la configuration actuelle, l’imageur est adapté à différentes applications PLIM grand champ. Le remplacement de la LED par une source laser rapide améliorera encore les performances de l’imageur et pourrait potentiellement permettre des applications FLIM nanosecondes.

Protocol

Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées en vertu d’autorisations délivrées par l’Autorité de réglementation des produits de santé (HPRA, Irlande) conformément à la directive du Conseil des Communautés européennes (2010/63/UE) et ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’University College Cork. 1. Préparation de l’échantillon Coloration avec la sonde d’échantillons de tissus vivan…

Representative Results

Pour les applications d’imagerie ex vivo , des fragments de tissus intestinaux ont été colorés par l’application topique de la sonde NanO2-IR sur la face sérossale du tissu. Pour une coloration plus profonde, 1 μL de la sonde a été injecté dans la lumière. Dans ce dernier cas, la paroi intestinale de 0,2 à 0,25 mm d’épaisseur protégeait la sonde de la caméra. Les deux procédés de coloration sont illustrés à la figure 2A. L’intensi…

Discussion

Les protocoles ci-dessus donnent une description détaillée de l’assemblage du nouvel imageur et de son fonctionnement en mode FLIM/PLIM à la microseconde. La caméra Tpx3Cam de nouvelle génération basée sur TCSPC, couplée au moyen de l’adaptateur opto-mécanique Cricket avec l’intensificateur d’image, le filtre d’émission et la macro-lentille, produit un module optique stable, compact et flexible facile à utiliser. L’imageur s’est avéré performant avec une gamme d’échantillons et de tâches an…

Materials

627 nm LED	Parts Express		Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.
760 ± 50 nm emission filter	Edmund Optics	84-788	Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.
Balb/c mice	Envigo, UK	Balb/c
Black box	Thorlabs	XE25C9/M
Cricket Adapter	Photonis	Cricket-2
CT26 cells	ATCC	CT26.WT	https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM	Sigma-Aldrich	D0697	Other media can also be used
ImageJ Software	ImageJ		Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen	Photonis	PP0360EF
Mini dishes	Sarstedt	83.3900.300	35 mm diameter
Mylar plastic film, 75 micron	RS Ireland	785-0795	Othe plastic substrates can also be used
NanO2-IR	home-made	n/a	The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab.
NMV-50M11” 50 mm lens	Navitar		Other lenses compatibel with C-mount adators can be used
Optical breadboard	Thorlabs	MB1836
Petri Dishes	Sarstedt	82.1472.001	92 mm diameter
Power Supply	Tenma	72-10495
Pulse Generator	Tenma	TGP110
Sophy	Amsterdam Scientific Instruments	n/z	Provided by ASI together with the Tpx3Cam
Tpx3Cam	Amsterdam Scientific Instruments	TPXCAM
Tri2 Software	University of Oxford	n/a	Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation Stage	Thorlabs	LT3