Macro Imager de vida útil de fluorescencia para aplicaciones biomédicas
Summary
Este artículo describe el uso de un nuevo y rápido generador de imágenes ópticas para la obtención de imágenes macroscópicas de la vida útil de la fotoluminiscencia de muestras que emiten descomposición larga. Se describen los procedimientos de integración, adquisición de imágenes y análisis, junto con la preparación y caracterización de los materiales del sensor para la obtención de imágenes y la aplicación del generador de imágenes en el estudio de muestras biológicas.
Abstract
Este artículo presenta un nuevo generador de imágenes de vida útil de fotoluminiscencia diseñado para mapear la concentración de oxígeno molecular (O2) en diferentes muestras fosforescentes que van desde recubrimientos de estado sólido sensibles al O2 hasta muestras de tejido animal vivo teñidas con sondas solubles sensibles alO2. En particular, se utilizó la sonda de infrarrojo cercano basada en nanopartículas NanO2-IR, que es excitable con un diodo emisor de luz (LED) de 625 nm y emite a 760 nm. El sistema de imágenes se basa en la cámara Timepix3 (Tpx3Cam) y el adaptador optomecánico, que también alberga un intensificador de imagen. La microscopía de imágenes de por vida de fosforescencia (PLIM) deO2 se requiere comúnmente para varios estudios, pero las plataformas actuales tienen limitaciones en su precisión, flexibilidad general y facilidad de uso.
El sistema presentado aquí es un generador de imágenes rápido y altamente sensible, que se basa en un sensor óptico integrado y un módulo de chip de lectura, Tpx3Cam. Se ha demostrado que produce señales de fosforescencia de alta intensidad y valores estables de vida útil a partir de muestras de tejido intestinal teñido superficialmente o fragmentos teñidos intraluminalmente del intestino grueso y permite el mapeo detallado de los niveles deO2 tisular en aproximadamente 20 s o menos. También se presentan experimentos iniciales sobre la imagen de hipoxia en tumores injertados en animales inconscientes. También describimos cómo se puede reconfigurar el generador de imágenes para su uso con materiales sensibles alO2 basados en colorantes de porfirina Pt utilizando un LED de 390 nm para la excitación y un filtro de paso de banda de 650 nm para la emisión. En general, se encontró que el generador de imágenes PLIM produce mediciones cuantitativas precisas de los valores de vida útil para las sondas utilizadas y los respectivos mapas bidimensionales de la concentración deO2 . También es útil para la obtención de imágenes metabólicas de modelos de tejidos ex vivo y animales vivos.
Introduction
El O2 es uno de los parámetros ambientales clave para los sistemas vivos, y el conocimiento de la distribución delO2 y su dinámica es importante para muchos estudios biológicos 1,2,3. La evaluación de la oxigenación tisular por medio de sondas fosforescentes 4,5,6,7,8 y PLIM 9,10,11,12,13 están ganando popularidad en la investigación biológica y médica 3,9,14,15,16, 17,18,19. Esto se debe a que PLIM, a diferencia de las mediciones de intensidad de fluorescencia o fosforescencia, no se ve afectado por factores externos como la concentración de la sonda, el fotoblanqueo, la intensidad de excitación, la alineación óptica, la dispersión y la autofluorescencia.
Sin embargo, las plataformas actuales de O2 PLIM están limitadas por su sensibilidad, velocidad de adquisición de imágenes, precisión y usabilidad general. El conteo de fotones únicos correlacionados en el tiempo (TCSPC), combinado con un procedimiento de escaneo ráster, se utiliza con frecuencia en dispositivos PLIM y microscopía de imágenes de fluorescencia (FLIM)20,21,22. Sin embargo, dado que PLIM requiere un largo tiempo de permanencia en píxeles (en el rango de milisegundos), el tiempo de adquisición de imágenes es mucho más largo que el requerido para las aplicaciones FLIM20,22,23. Otras técnicas, como las cámaras CCD/CMOS cerradas, carecen de sensibilidad de fotón único y tienen bajas velocidades de cuadro20,24,25,26. Además, los sistemas PLIM existentes se utilizan principalmente en formato microscópico, mientras que los sistemas macroscópicos son menos comunes27.
El generador de imágenes macro PLIM28 basado en TCSPC se creó para superar muchas de estas limitaciones. El diseño del generador de imágenes se vio facilitado en gran medida por el uso de un nuevo adaptador optomecánico, Cricket, que tiene lo siguiente: i) dos adaptadores de montura C, que proporcionan un fácil acoplamiento del módulo de la cámara en la parte posterior y la lente del objetivo en la parte frontal; ii) una carcasa interna para un intensificador de imagen y una toma de corriente para este último en el lado exterior del Cricket; iii) un espacio interno detrás del adaptador frontal de montura C donde se puede alojar un filtro de emisión estándar de 25 mm delante del intensificador; y iv) una óptica de colisión de luz incorporada con reguladores de anillo, que permiten la alineación / enfoque óptico entre la lente y la cámara para producir imágenes nítidas en el chip de la cámara.
En el generador de imágenes ensamblado, el módulo de la cámara está acoplado a la parte posterior del adaptador Cricket, que también alberga un intensificador de imagen que consiste en un fotocátodo seguido de una placa de microcanal (MCP), un amplificador y un centelleador rápido, fósforo P47. Un filtro de emisión de 760 nm ± 50 nm está instalado dentro del Cricket, y una lente objetiva, NMV-50M11”, está conectada al adaptador frontal de montura C. Finalmente, la lente y la cámara están alineadas ópticamente con reguladores de anillo.
El papel del intensificador es detectar fotones entrantes y convertirlos en ráfagas rápidas de luz en el chip de la cámara, que se registran y utilizan para generar decaimientos de emisión e imágenes de por vida. El módulo de cámara comprende una matriz avanzada de sensores ópticos basados en TCSPC (256 píxeles x 256 píxeles) y un chip de lectura de nueva generación 29,30,31,32,33, que permiten el registro simultáneo de la hora de llegada (TOA) y el tiempo sobre umbral (TOT) de ráfagas de fotones en cada píxel del chip de imagen con una resolución de tiempo de 1,6 ns y una velocidad de lectura de 80 Mpixel/s.
En esta configuración, la cámara con el intensificador tiene sensibilidad de fotón único. Está basado en datos y se basa en el sistema de lectura rápida del detector de píxeles (SPIDR)34. La resolución espacial del generador de imágenes se caracterizó previamente con sensores fosforescentes planos deO2 y una máscara de placa de resolución. La función de respuesta del instrumento (IRF) se midió mediante la obtención de imágenes de un sensor fluorescente plano bajo la misma configuración que se utilizó para todas las demás mediciones. La vida útil del tinte de alrededor de 2,6 ns fue lo suficientemente corta como para ser utilizado para la medición IRF en modo PLIM. El generador de imágenes puede obtener imágenes de objetos de hasta 18 mm x 18 mm de tamaño con resoluciones espaciales y temporales de 39,4 μm y 30,6 ns (ancho completo a la mitad como máximo), respectivamente28.
Los siguientes protocolos describen el ensamblaje del macrogenerador de imágenes y su posterior uso para mapear la concentración de O2 en muestras biológicas teñidas con la sonda de O2 en el infrarrojo cercano previamente caracterizada,NanO2-IR 35. La sonda es una sonda de detección deO2 brillante, fotoestable y permeable a las células basada en colorante benzoporfirina (PtBP) de platino (II). Es excitable a 625 nm, emite a 760 nm y proporciona una respuesta óptica robusta al O2 en el rango fisiológico (0%-21% o 0-210 μM deO2). También se ha demostrado que el generador de imágenes caracteriza diferentes materiales de sensores basados en colorantes de porfirina Pt (II). En general, el generador de imágenes es compacto y flexible, similar a una cámara fotográfica común. En la configuración actual, el generador de imágenes es apropiado para diferentes aplicaciones PLIM de campo amplio. La sustitución del LED con una fuente láser rápida mejorará aún más el rendimiento del generador de imágenes y podría permitir aplicaciones FLIM de nanosegundos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos anteriores ofrecen una descripción detallada del montaje del nuevo generador de imágenes y su funcionamiento en el modo FLIM/PLIM de microsegundos. La cámara Tpx3Cam de nueva generación basada en TCSPC, acoplada por medio del adaptador optomecánico Cricket con el intensificador de imagen, el filtro de emisión y la lente macro, produce un módulo óptico estable, compacto y flexible que es fácil de operar. Se demostró que el generador de imágenes funciona bien con una variedad de muestras diferente…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Se agradece el apoyo financiero para este trabajo de la Science Foundation Ireland, las subvenciones SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 y 18/SP/3522, y Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland).
Materials
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
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