Fluorescens livstid makrokamera för biomedicinska tillämpningar
Summary
Detta dokument beskriver användningen av en ny, snabb optisk kamera för makroskopisk fotoluminiscenslivstidsavbildning av långa sönderfallsemitterande prover. Integrations-, bildförvärvs- och analysprocedurerna beskrivs, tillsammans med förberedelse och karakterisering av sensormaterialen för avbildning och tillämpning av kameran vid studier av biologiska prover.
Abstract
Denna artikel presenterar en ny fotoluminiscensavlivningskamera utformad för att kartlägga koncentrationen av molekylärt syre (O2) i olika fosforescerande prover, allt från fasta tillståndet, O2-känsliga beläggningar till levande djurvävnadsprover färgade med lösligaO2-känsliga sonder. I synnerhet användes den nanopartikelbaserade nära infraröda sonden NanO2-IR, som är exciterbar med en 625 nm ljusemitterande diod (LED) och avger vid 760 nm. Bildsystemet är baserat på Timepix3-kameran (Tpx3Cam) och den optomekaniska adaptern, som också rymmer en bildförstärkare. O2-fosforescenslivstidsavbildningsmikroskopi (PLIM) krävs vanligtvis för olika studier, men nuvarande plattformar har begränsningar i deras noggrannhet, allmänna flexibilitet och användbarhet.
Systemet som presenteras här är en snabb och mycket känslig kamera, som bygger på en integrerad optisk sensor och avläsningschipmodul, Tpx3Cam. Det har visat sig producera högintensiva fosforescenssignaler och stabila livstidsvärden från ytfärgade tarmvävnadsprover eller intraluminalt färgade fragment av tjocktarmen och möjliggör detaljerad kartläggning av vävnad O2-nivåer på cirka 20 s eller mindre. Inledande experiment på avbildning av hypoxi i ympade tumörer hos medvetslösa djur presenteras också. Vi beskriver också hur kameran kan konfigureras om för användning med O2-känsliga material baserat på Pt-porfyrinfärgämnen med hjälp av en 390 nm LED för excitationen och ett bandpass 650 nm filter för emission. Sammantaget visade sig PLIM-kameran producera exakta kvantitativa mätningar av livstidsvärden för de använda sonderna och respektive tvådimensionella kartoröver O2-koncentrationen. Det är också användbart för metabolisk avbildning av ex vivo-vävnadsmodeller och levande djur.
Introduction
O 2 är en av de viktigaste miljöparametrarna för levande system, och kunskap om fördelningen av O 2 och dess dynamik är viktig för många biologiska studier 1,2,3. Bedömningen av vävnadens syresättning med hjälp av fosforescerande sonder 4,5,6,7,8 och PLIM 9,10,11,12,13 blir allt populärare inom biologisk och medicinsk forskning 3,9,14,15,16, 17,18,19. Detta beror på att PLIM, till skillnad från fluorescens- eller fosforescensintensitetsmätningar, inte påverkas av yttre faktorer som sondkoncentration, fotoblekning, excitationsintensitet, optisk inriktning, spridning och autofluorescens.
Nuvarande O2 PLIM-plattformar begränsas dock av deras känslighet, bildinsamlingshastighet, noggrannhet och allmänna användbarhet. Tidskorrelerad single photon counting (TCSPC), i kombination med en rasterskanningsprocedur, används ofta i PLIM- och fluorescenslivstidsbildmikroskopi (FLIM) enheter20,21,22. Men eftersom PLIM kräver en lång pixeluppehållstid (i millisekundområdet) är tiden för bildförvärv mycket längre än vad som krävs för FLIM-applikationer20,22,23. Andra tekniker, såsom gated CCD / CMOS-kameror, saknar enkel fotonkänslighet och har låga bildhastigheter20,24,25,26. Dessutom används de befintliga PLIM-systemen oftast i mikroskopiskt format, medan makroskopiska system är mindre vanliga27.
Den TCSPC-baserade PLIM-makrokameran28 inrättades för att övervinna många av dessa begränsningar. Utformningen av kameran underlättades kraftigt av användningen av en ny optomekanisk adapter, Cricket, som har följande: i) två C-monterade adaptrar, som ger enkel koppling av kameramodulen på baksidan och objektivlinsen på framsidan; ii) ett inre hölje för en bildförstärkare och ett eluttag för den senare på Crickets utsida; iii) Ett inre utrymme bakom adaptern på framsidan av C-fattningen där ett standardfilter för 25 mm utsläpp kan placeras framför förstärkaren. och iv) en inbyggd ljuskollimeringsoptik med ringregulatorer, som möjliggör optisk inriktning / fokusering mellan linsen och kameran för att producera skarpa bilder på kamerachipet.
I den monterade kameran är kameramodulen kopplad till baksidan av Cricket-adaptern, som också rymmer en bildförstärkare bestående av en fotokatod följt av en mikrokanalplatta (MCP), en förstärkare och en snabb scintillator, P47-fosfor. Ett 760 nm ± 50 nm emissionsfilter är monterat inuti Cricket, och en objektivlins, NMV-50M11”, är fäst på framsidan C-mount adapter. Slutligen är linsen och kameran optiskt inriktade mot ringregulatorer.
Förstärkarens roll är att upptäcka inkommande fotoner och omvandla dem till snabba ljusutbrott på kamerachipet, som registreras och används för att generera emissionsförfall och livstidsbilder. Kameramodulen består av en avancerad TCSPC-baserad optisk sensoruppsättning (256 pixlar x 256 pixlar) och en ny generation avläsningschip 29,30,31,32,33, som möjliggör samtidig inspelning av ankomsttid (TOA) och tid över tröskel (TOT) för fotonskurar vid varje pixel i bildchipet med en tidsupplösning på 1,6 ns och en avläsningshastighet på 80 Mpixel/s.
I denna konfiguration har kameran med förstärkaren enfotonkänslighet. Den är datadriven och baserad på SPIDR-systemet (speedy pixel detector readout)34. Kamerans rumsliga upplösning karakteriserades tidigare med plana fosforescerande O2-sensorer och en upplösningsplattmask. Instrumentets responsfunktion (IRF) mättes genom avbildning av en plan fluorescerande sensor under samma inställningar som används för alla andra mätningar. Färgämnets livslängd på cirka 2,6 ns var tillräckligt kort för att det skulle kunna användas för IRF-mätning i PLIM-läge. Kameran kan avbilda objekt upp till 18 mm x 18 mm i storlek med rumsliga och tidsmässiga upplösningar på 39,4 μm och 30,6 ns (full bredd vid halvmaximalt), respektive28.
Följande protokoll beskriver sammansättningen av makrokameran och dess efterföljande användning för kartläggning avO2-koncentrationen i biologiska prover färgade med den tidigare karakteriserade nära infraröda O2-sonden, NanO2-IR 35. Sonden är en ljusstark, fotostabil, cellgenomsläpplig O2-avkännande sond baserad på platina (II) bensoporfyrin (PtBP) färgämne. Det är retbart vid 625 nm, avger vid 760 nm och ger ett robust optiskt svar påO2 i det fysiologiska området (0% -21% eller 0-210 μM avO2). Kameran demonstreras också karakterisera olika sensormaterial baserat på Pt(II)-porfyrinfärgämnen. Sammantaget är kameran kompakt och flexibel, liknar en vanlig fotografisk kamera. I den aktuella inställningen är kameran lämplig för olika widefield PLIM-applikationer. Att ersätta lysdioden med en snabb laserkälla kommer att ytterligare förbättra kamerans prestanda och kan potentiellt möjliggöra nanosekund FLIM-applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovanstående protokoll ger en detaljerad beskrivning av sammansättningen av den nya kameran och dess funktion i mikrosekund FLIM / PLIM-läge. Den TCSPC-baserade nya generationens Tpx3Cam-kamera, kopplad med hjälp av den optomekaniska adaptern Cricket med bildförstärkare, emissionsfilter och makrolins, ger en stabil, kompakt och flexibel optisk modul som är enkel att använda. Avbildaren visade sig fungera bra med en rad olika prover och analytiska uppgifter, som inkluderade karakterisering av fosforescerande materi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ekonomiskt stöd för detta arbete från Science Foundation Ireland, bidrag SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 och 18/SP/3522, och Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) tas tacksamt emot.
Materials
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
Referências
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
- Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
- Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors – IMCS. , 71-72 (2018).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- O’Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
- Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
- Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
- Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
- Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
- Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
- Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
- Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
- Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
- Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
- Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
- Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
- Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging – Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).
- Becker, W., König, K. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).
- Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
- Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
- Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
- Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
- Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. . Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).
- Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
- Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
- Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
- Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
- Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
- Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
- Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
- Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
- Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
- Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
- Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. Fluorescence lifetime imaging. Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).
