Summary
Questo protocollo descrive il processo di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) in cellule simili alle microglia per la sperimentazione in vitro . Includiamo anche una procedura dettagliata per generare sinaptosomi umani da motoneuroni inferiori derivati da iPSC che possono essere utilizzati come substrato per saggi di fagocitosi in vitro utilizzando sistemi di imaging di cellule vive.
Abstract
Le microglia sono le cellule immunitarie residenti di origine mieloide che mantengono l'omeostasi nel microambiente cerebrale e sono diventate un attore chiave in molteplici malattie neurologiche. Lo studio della microglia umana in salute e malattia rappresenta una sfida a causa della fornitura estremamente limitata di cellule umane. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da individui umani possono essere utilizzate per aggirare questa barriera. Qui, viene dimostrato come differenziare le iPSC umane in cellule simili alla microglia (iMG) per la sperimentazione in vitro . Queste iMG mostrano le proprietà attese e fisiologiche della microglia, compresa la morfologia simile alla microglia, l'espressione di marcatori appropriati e la fagocitosi attiva. Inoltre, viene fornita la documentazione per l'isolamento e l'etichettatura dei substrati di sinaptosomi derivati da motoneuroni inferiori derivati da iPSC umani (i3LMN). Un test di imaging longitudinale a cellule vive viene utilizzato per monitorare l'inghiottimento dei sinaptosomi umani marcati con un colorante sensibile al pH, consentendo indagini sulla capacità fagocitaria di iMG. I protocolli qui descritti sono ampiamente applicabili a diversi campi che stanno studiando la biologia della microglia umana e il contributo della microglia alle malattie.
Introduction
Le microglia sono le cellule immunitarie residenti nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo del SNC. Le microglia sono anche importanti nel cervello adulto per mantenere l'omeostasi e rispondere attivamente ai traumi e ai processi patologici. Evidenze cumulative mostrano che le microglia sono fattori chiave per la patogenesi di molteplici malattie neuroevolutive e neurodegenerative 1,2. Sebbene le attuali conoscenze sulla biologia microgliale siano state prevalentemente derivate da modelli murini, studi recenti hanno chiarito importanti differenze tra microglia murina, sottolineando la necessità di sviluppare tecnologie per studiare la genetica e le funzioni biologiche della microglia umana 3,4. L'isolamento della microglia dal tessuto primario sezionato può modificare gravemente le proprietà della microglia5, potenzialmente confondendo i risultati acquisiti con tali cellule. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di differenziare le iPSC umane in iMG, fornendo così un sistema di coltura cellulare per studiare la microglia umana in condizioni basali. Inoltre, un test di fagocitosi che utilizza un sistema modello completamente umano è incluso nel presente documento come mezzo per studiare la funzionalità delle iMG, sia come misura di controllo della qualità che per valutare la disfunzione di iMG nel contesto della malattia.
Protocolli multipli per la differenziazione delle microglia dalle iPSC sono recentemente emersi in letteratura 6,7,8,9,10. I potenziali svantaggi di alcuni protocolli includono lunghi o prolungati periodi di differenziazione, l'aggiunta di più fattori di crescita e/o procedure sperimentali complesse 6,9,10. Qui viene dimostrato un metodo di differenziazione "user-friendly" che ricapitola aspetti dell'ontogenesi della microglia attraverso la differenziazione di iPSCs in cellule precursori denominate precursori primitivi dei macrofagi (PMP)7,11. I PMP vengono generati come descritto in precedenza, con alcune ottimizzazioni presentate qui12. I PMP imitano i macrofagi derivati dal sacco vitellino indipendenti da MYB, che danno origine alla microglia durante lo sviluppo embrionale invadendo il cervello prima della chiusura della barriera emato-encefalica13. Per differenziare terminalmente i PMP in iMG, abbiamo utilizzato un metodo di monocoltura veloce e semplificato basato sui protocolli di Haenseler et al. e Brownjohn et al., con alcune modifiche per generare un efficiente metodo di differenziazione della microglia in cui le iMG esprimono robustamente marcatori arricchiti di microglia 7,8. Questo metodo di differenziazione può essere riprodotto in laboratori con esperienza nella coltura di iPSC e con obiettivi di ricerca volti a studiare la biologia delle microglia utilizzando un sistema modello umano.
Le microglia derivate da iPSC rappresentano una fonte biologicamente rilevante di microglia umana per la sperimentazione in vitro e sono uno strumento importante per studiare le funzioni canoniche microgliali, compresa la fagocitosi. Le microglia sono i fagociti professionali del cervello e del SNC, dove eliminano i detriti cellulari, le proteine aggregate e la mielina degradata14. Le microglia funzionano anche nel rimodellamento sinaptico inghiottendo le sinapsi e nella difesa contro le infezioni esterne attraverso la fagocitosi dei patogeni15,16. In questo protocollo, la fagocitosi da parte di iMG viene valutata utilizzando sinaptosomi umani come materiale per l'inghiottimento di iMG. A tal fine, viene descritta una descrizione per isolare i sinaptosomi derivati da i3LMN umani. I sinaptosomi umani derivati da i3LMN sono marcati con un colorante sensibile al pH che consente la quantificazione dei sinaptosomi localizzati all'interno di compartimenti acidi durante l'elaborazione e la degradazione dei fagosomi in vitro. Viene mostrato un test di fagocitosi utilizzando la microscopia a cellule vive per monitorare il processo dinamico di inghiottimento della microglia in tempo reale. Questo test funzionale stabilisce una base per studiare possibili difetti nella fagocitosi microgliale in salute e malattia utilizzando un sistema umano completo.
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Protocol
NOTA: Tutti i reagenti utilizzati in questo protocollo devono essere sterili e tutte le fasi devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza in condizioni sterili. Tutte le linee iPSC, così come i mezzi di manutenzione e differenziazione, sono descritti nella Tabella dei Materiali. Il metodo di differenziazione delle microglia illustrato di seguito si basasui protocolli 7,8,12 precedentemente pubblicati con nuove modifiche qui descritte.
1. Differenziazione delle microglia
NOTA: una panoramica del protocollo è riepilogata nella Figura 1.
- Coltura di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)
NOTA: Ulteriori dettagli che descrivono le tecniche di coltura iPSC sono disponibili altrove17.- Scongelamento e manutenzione
- Preparare il terreno iPSC, aliquote del terreno e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Scongelare le aliquote per una notte a 4 °C e utilizzarle per un massimo di 1 settimana. Lasciare il fluido a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima dell'uso.
- Rivestire i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti aggiungendo 1 mL di 10 μg/mL di laminina 521 diluita in DPBS contenente calcio e magnesio18. Conservare le piastre in un'incubatrice a 37 °C e al 5% di CO 2 per almeno2 ore o preferibilmente durante la notte. Una volta diluita, conservare la laminina a 4 °C per 3 mesi.
- Preparare 10 mM di soluzione madre di inibitore della chinasi Rho chinasi Y27632 (inibitore ROCK) diluendo in acqua sterile. Produrre aliquote monouso della soluzione inibitrice di ROCK e conservarle a -20 °C per un massimo di 1 anno.
- Preparare 0,5 mM EDTA diluendo la soluzione madre di 0,5 M EDTA in DPBS.
- Per scongelare un flaconcino di iPSC congelate, porre il flaconcino a bagnomaria a 37 °C fino a quando non è per lo più scongelato. Trasferire immediatamente il contenuto del flaconcino in un tubo conico da 15 mL contenente 4 mL di mezzo iPSC. Centrifugare a 500 × g per 1 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo 1 mL di mezzo iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK lentamente contro la parete del tubo per evitare il disturbo delle colonie.
- Aggiungere 1,5 mL di mezzo iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK a ciascuno dei pozzetti rivestiti e trasferire le colonie risospese goccia a goccia ai pozzetti contenenti il mezzo.
NOTA: Utilizzare 5-7 gocce dal punto 1.1.1.6 per il mantenimento della coltura, ma regolare la densità di semina ottimale per ogni linea iPSC. - Distribuire uniformemente le celle nei pozzetti mescolando manualmente la piastra da un lato all'altro e da dietro a davanti. Posizionare le celle in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2. Il giorno successivo, sostituire completamente il terreno aggiungendo un nuovo mezzo iPSC senza inibitore ROCK.
- Per il mantenimento, cambiare il mezzo ogni giorno fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza.
NOTA: Le celle possono essere mantenute senza cambiare il terreno per 2 giorni se il mezzo iPSC utilizzato consente un programma di alimentazione flessibile. Si consiglia di limitare questo a una volta per passaggio e solo se le cellule sono meno del 50% confluenti.
- Emicranico
- Aspirare il mezzo e lavare le cellule con 1 mL di DPBS (senza calcio e magnesio).
- Per rimuovere le cellule, aggiungere 1 mL di 0,5 mM EDTA e incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente fino a quando i bordi delle colonie cellulari si sollevano dalla superficie del pozzetto. Lavare nuovamente le celle con DPBS e aggiungere 1 mL di mezzo iPSC.
- Dissociare le colonie cellulari raschiandole delicatamente usando un sollevatore cellulare. Raschiare ogni area del pozzo solo una volta per evitare di disturbare le colonie.
NOTA: Metodi alternativi per rimuovere le colonie dal pozzo possono essere trovati altrove17. - Utilizzando una punta per pipetta da 1 ml, raccogliere le cellule e trasferirle goccia a goccia in rapporto 1:6 (cellule e mezzo) in pozzetti prepatinati (come indicato al punto 1.1.1.2) contenenti 1,5 mL di mezzo iPSC.
- Scongelamento e manutenzione
- Differenziazione iPSC in cellule simili alla microglia (iMG)
NOTA: Le piccole molecole e i fattori di crescita sono disciolti in albumina sierica bovina allo 0,1% filtrata sterile in DPBS a una concentrazione di riserva 1.000 volte superiore alla concentrazione finale. Si raccomanda di differenziare le iPSC in iMG durante i primi passaggi. Si consiglia il cariotipo di routine delle linee iPSC.- Preparare la soluzione di rivestimento standard
- Scongelare la soluzione madre di un reagente di rivestimento della matrice extracellulare su ghiaccio a 4 °C durante la notte.
- Prechill tubi per microcentrifuga e punte di pipette filtranti a 4 °C.
- Aliquot 250 μL del reagente di rivestimento concentrato della matrice extracellulare in ciascuna provetta e posto immediatamente su ghiaccio. Conservare le aliquote a -20 °C.
- Per preparare la soluzione di rivestimento, scongelare una delle aliquote del reagente di rivestimento della matrice extracellulare sul ghiaccio a 4 °C durante la notte.
- Aggiungere 50 ml di DMEM-F12 ghiacciato ottimizzato per la crescita di cellule staminali embrionali umane e pluripotenti indotte (indicato come DMEM-F12) in un tubo conico prerefrigerato e tenerlo in ghiaccio.
- Raffreddare una punta di pipetta da 1 mL pipettando più volte DMEM-F12 ghiacciato su e giù, quindi utilizzare immediatamente la punta della pipetta per trasferire 250 μL del reagente di rivestimento della matrice extracellulare nel tubo conico contenente il mezzo DMEM-F12.
NOTA: La soluzione di rivestimento standard può essere conservata per 2 settimane a 4 °C.
- Formazione del corpo embrioide (EB)
- Preparare il terreno EB che può essere mantenuto a 4 °C per un massimo di 4 giorni.
- Una volta che le iPSC hanno raggiunto l'80% di confluenza, dissociare le colonie lavando con 1 mL di DPBS e aggiungendo 1 mL di un reagente di dissociazione per 2 minuti a 37 °C. Rimuovere le colonie utilizzando un sollevatore di cellule raschiando più volte per creare una sospensione a cella singola. Raccogliere le cellule e trasferire tutto in un tubo conico da 15 mL contenente 9 mL di DPBS.
- Centrifugare le cellule a 500 × g per 1 minuto, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di mezzo EB. Prendere 10 μL di cellule e diluire 1:1 con Trypan blue. Contare le cellule con un ematocitometro e, in base al numero di cellule, diluire lo stock cellulare fino a una diluizione finale di 10.000 cellule per 100 μL. Per le celle di placcatura, aggiungere 100 μL delle celle diluite per pozzetto in una piastra a bassa aderenza, a fondo arrotondato, a 96 pozzetti.
NOTA: Generalmente, 48 pozzetti della piastra a 96 pozzetti possono essere ottenuti da ciascun pozzo confluente all'80% di iPSC. - Centrifugare la piastra a 125 × g per 3 minuti e incubare a 37 °C e 5% CO2 per 4 giorni. Eseguire un cambio medio-medio il giorno 2 utilizzando una pipetta multicanale e raccogliendo delicatamente 50 μL di vecchio fluido, quindi aggiungendo 50 μL di terreno EB fresco.
NOTA: Il giorno 4, le iPSC formeranno strutture cellulari sferiche denominate EB come descritto nella sezione dei risultati. Il processo di differenziazione EB può essere esteso fino a 7 giorni, se necessario.
- Generazione di precursori primitivi dei macrofagi (PMP)
- Preparare il terreno base PMP, filtrare sterile e conservarlo a 4 °C per un massimo di 1 mese.
- Rivestire i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti aggiungendo 1 ml di soluzione di rivestimento Matrigel ghiacciata e incubare a 37 °C e 5% di CO 2 per almeno2 ore o preferibilmente durante la notte.
- Il giorno 4 della differenziazione EB, trasferire gli EB nei pozzetti rivestiti Matrigel raccogliendo gli EB con 1 mL di punte per pipette (usando una pipetta). Pipettare su e giù una o due volte per rimuovere gli EB dal pozzo. Tenere la piastra a 6 pozzetti con un angolo inclinato per consentire agli EB di depositarsi sul bordo del pozzo.
NOTA: nove o dieci EB possono essere placcati per pozzetto rivestito. - Una volta che tutti gli EB si sono sistemati, pipettare delicatamente e rimuovere il vecchio mezzo utilizzando una punta di pipetta da 1 mL mantenendo gli EB sul bordo del pozzetto. Aggiungere 3 ml di terreno completo PMP appena preparato a ciascun pozzetto. Distribuire uniformemente le celle nei pozzetti mescolando manualmente la piastra da un lato all'altro e da dietro a davanti. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.
- Non disturbare la piastra per 7 giorni per consentire agli EB di attaccarsi al fondo del pozzo. Dopo tale periodo, eseguire una modifica semi-media utilizzando il mezzo completo PMP.
NOTA: A questo punto, la maggior parte degli EB deve essere attaccata alla piastra. Qualsiasi EB galleggiante può essere rimosso. - Dopo 5-7 giorni, ispezionare gli EB al microscopio a campo luminoso con ingrandimento 4x per assicurarsi che siano attaccati al fondo dei pozzetti. Modificare il supporto come descritto al punto 1.2.3.5. Il giorno 21, eseguire un cambio completo del mezzo con 3 ml di terreno completo PMP.
NOTA: I progenitori mieloidi che galleggiano nel mezzo possono essere evidenti a questo punto. Queste celle devono essere scartate durante il cambio del mezzo. - Il giorno 28, cercare celle rotonde denominate PMP nel surnatante e raccogliere il mezzo contenente i PMP utilizzando una pipetta da 10 ml e un pipettatore automatico. Fare attenzione a non disturbare gli EB. Trasferire i PMP e il mezzo in un tubo conico da 15 mL e procedere come descritto al punto 1.2.4.
NOTA: Di solito i PMP della stessa linea iPSC possono essere raccolti da cinque pozzetti di una piastra a 6 pozzetti e raggruppati insieme in un singolo tubo conico da 15 ml. - Aggiungere 3 ml di PMP fresco completo per un'ulteriore manutenzione degli EB. Poiché i PMP emergono continuamente dagli EB per più di 3 mesi, raccoglierli ogni 4-7 giorni (non consentire al mezzo di cambiare colore in un tono giallo) come descritto nei passaggi 1.2.3.7 e 1.2.3.8.
NOTA: Sebbene i PMP possano essere raccolti per diversi mesi, possono cambiare il loro fenotipo nel tempo.
- Differenziazione rispetto alle iMG
- Preparare il terreno base iMG (Table of Materials), filtrare sterile e conservarlo a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
- Una volta raccolti i PMP in una provetta conica da 15 ml, centrifugarli a 200 × g per 4 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere i PMP utilizzando 1-2 mL di mezzo basale iMG. Contare le cellule utilizzando un emocitometro prendendo una piccola aliquota e diluendo 1:1 con Trypan blue.
NOTA: 0,5-1,5 × 106 PMP sono normalmente ottenuti ogni settimana a seconda della linea iPSC e dell'età della cultura EB. - Centrifugare nuovamente il resto delle cellule a 200 × g per 4 minuti. Diluire i PMP alla concentrazione desiderata in modo tale che le cellule siano placcate ad una densità di ~105/cm2 su piastre trattate con colture cellulari utilizzando il mezzo completo iMG appena preparato. Eseguire un cambio medio-medio utilizzando il mezzo completo iMG appena preparato ogni 3-4 giorni per 10-12 giorni per consentire la differenziazione terminale.
NOTA: A questo punto, le cellule dovrebbero acquisire morfologia simile alla microglia. Per confermare l'impegno delle PMP nel destino delle microglia, viene eseguita un'analisi di immunofluorescenza per corroborare l'espressione di marcatori arricchiti di microglia come il recettore purinergico P2RY12 e la proteina transmembrana 119 (TMEM119)9. - Per preservare la salute e la vitalità cellulare, eseguire tutti gli esperimenti tra i giorni 10 e 12 della differenziazione iMG.
- Preparare la soluzione di rivestimento standard
2. Saggio di fagocitosi utilizzando sinaptosomi umani derivati da motoneuroni
- Differenziazione mediata dal fattore di trascrizione dei motoneuroni inferiori derivati da iPSC (i3LMN)
NOTA: Per il processo di differenziazione è stata utilizzata una linea WTC11 con inserimento stabile della cassetta del fattore di trascrizione inducibile hNIL contenente i fattori di trascrizione neurogenina-2 (NGN2), isol-1 (ISL1) e LIM homeobox 3 (LHX3) nel locus Safe Harbor CLYBL17. La linea iPSC è stata mantenuta come descritto al punto 1.1.1, ma con le condizioni di rivestimento descritte nella fase 1.2.1. Qualsiasi reagente di rivestimento della matrice extracellulare può essere utilizzato per la coltura di iPSC che verranno utilizzate per la differenziazione neuronale poiché la laminina 521 non è richiesta. Tutti i fluidi sono equilibrati a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima dell'uso.- Rivestire i piatti di 10 cm con 5 ml di soluzione di rivestimento standard come descritto al punto 1.2.1.
NOTA: Qui, sono stati utilizzati 3-4 piatti da 10 cm per differenziazione. - Preparare il mezzo Induction Base, filtrare sterilemente e conservarlo a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
- Preparare il mezzo Neuron, filtrare sterilemente e conservarlo a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Preparare il tampone borato mescolando 100 mM di acido borico, 25 mM di tetraborato di sodio e 75 mM di cloruro di sodio in acqua sterile. Regolare il pH a 8,5 e filtrarlo sterilemente.
- Una volta che le iPSC hanno raggiunto l'80% di confluenza, lavare le cellule con DPBS e rimuovere le colonie aggiungendo 0,5 mM di EDTA.
NOTA: Due pozzetti sono generalmente sufficienti per ogni piatto di 10 cm. - Incubare le cellule per 4-5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere l'EDTA e aggiungere 3 ml di DMEM/F12 con HEPES a ciascun pozzetto.
- Raschiare le cellule usando un sollevatore di celle e utilizzare una pipetta da 10 ml per rimuovere le cellule dal fondo del pozzetto pipettando delicatamente su e giù 2-3 volte.
- Raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 3 minuti.
- Risospendere le cellule in 3 mL di mezzo iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK e contarle utilizzando un emocitometro.
- Piastra 1,5 × 106 iPSC in un piatto prerivestito da 10 cm con 12 mL di terreno iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK.
- Il giorno successivo, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con DPBS. Aggiungere 12 ml di mezzo di induzione completa appena preparato per indurre l'espressione dei fattori di trascrizione.
- Il giorno 2, rivestire piatti di 10 cm con 5 ml di soluzione di rivestimento neuronale preparata con volumi uguali di 0,1 mg / ml di poli-D-lisina e 1 mg / ml di poli-L-ornitina diluita in tampone borato. Incubare per una notte a 37 °C e 5% di CO2.
- Il giorno 3, lavare i piatti rivestiti con acqua sterile 3x, aspirare completamente l'acqua e lasciare asciugare i piatti inclinando le piastre e lasciandole parzialmente scoperte all'interno di un armadio di biosicurezza per almeno 1 ora a temperatura ambiente.
- Una volta che le stoviglie sono completamente asciutte, ricoprirle con 6 ml di terreno di induzione completa integrato con 15 μg/ml di laminina e 40 μM di BrdU per almeno 1 ora a 37 °C e 5% di CO2.
NOTA: Il trattamento con BrdU è raccomandato per eliminare le cellule mitoticamente attive e quindi per migliorare la purezza delle colture neuronali. Gli effetti di BrdU sulla salute neuronale sono minimi. - Trattare le cellule differenzianti con 3 ml di reagente di dissociazione per piatto da 10 cm e incubare per 3-4 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 6 mL di DPBS nella piastra senza rimuovere il reagente di dissociazione e pipettare le cellule in soluzione su e giù 4-5 volte con una pipetta da 10 mL per dissociare le cellule.
- Raccogliere la sospensione cellulare e farla passare attraverso un filtro cellulare da 40 μm in un tubo conico da 50 ml. Aggiungere 1 mL di base a induzione per risciacquare il colino.
- Centrifugare le cellule a 300 × g per 5 minuti. Aspirare il mezzo e risospendere le cellule in 3 mL di mezzo di induzione completa contenente 40 μM BrdU.
- Contare le cellule con un emocitometro. Placcare circa 2,5 × 10 6 celle per piatto da 10 cm in piatti prepatinati diluendo le celle in6 ml di mezzo di induzione completa contenente 40 μM di BrdU senza rimuovere la soluzione di rivestimento aggiunta al punto 2.1.14.
- Il giorno 4, aspirare il fluido, lavare le celle 1x con DPBS e aggiungere un nuovo mezzo di induzione completa contenente 40 μM di BrdU.
- Il giorno 6, aspirare il substrato, lavare le cellule 1x con DPBS e aggiungere Neuron medium integrato con 1 μg / mL di laminina.
- Al giorno 9, cambiare 1/3del terreno sostituendolo con Neuron medium fresco integrato con 1 μg/mL di laminina.
- Mantenere i 3 LMN per altri 25 giorni eseguendo cambiamenti di mezzo medio con Neuron medium integrato con 1 μg/mL fresco di laminina ogni3-4giorni.
NOTA: In questo momento, i3LMN dovrebbero presentare una morfologia neuronale con processi lunghi. I neuroni tendono anche a formare grumi o gruppi di cellule. Una descrizione più dettagliata di come convalidare la differenziazione di i3LMN può essere trovata altrove17.
- Rivestire i piatti di 10 cm con 5 ml di soluzione di rivestimento standard come descritto al punto 1.2.1.
- Purificazione ed etichettatura dei sinaptosomi
NOTA: Mantenere condizioni sterili ed eseguire tutte le fasi all'interno di un armadio di biosicurezza.- Lavare i3 LMN due volte con DPBS.
- Aggiungere 2 ml di reagente di lisi cellulare ghiacciato per l'isolamento dei sinaptosomi, incubare sul ghiaccio per 2 minuti e raschiare saldamente i neuroni.
- Trasferire il lisato in più microtubi da 2 mL (~1,5 mL di lisato per provetta) e centrifugare a 1.200 × g per 10 minuti a 4 °C.
NOTA: Mantenere i tubi sul ghiaccio durante questa procedura. - Raccogliere il surnatante (scartare il pellet) e centrifugare a 15.000 × g per 20 minuti a 4 °C. Salvare e risospendere il pellet contenente i sinaptosomi con un volume simile (come il lisato originale) del 5% di DMSO in DPBS.
NOTA: I sinaptosomi possono essere immediatamente marcati con un fluoroforo o conservati a -80 °C per un uso futuro. - Eseguire un test proteico dell'acido bicinconinico (BCA) per tutte le provette per valutare la resa totale di proteine nella preparazione del sinaptosoma.
NOTA: Possono essere utilizzati altri test per misurare la concentrazione proteica. La resa proteica totale ottenuta da diversi preparati è stata inclusa nella tabella 1 come riferimento. Si raccomanda di eseguire l'analisi western blot della preparazione del sinaptosoma per confermare la presenza di proteine presinaptiche e postsinaptiche. Qui, il marcatore presinaptico, sinaptofisina (SYP), e il marcatore postsinaptico, la proteina di densità postsinaptica 95 (PSD95) sono stati scelti per l'analisi western blotting come descritto in precedenza19. - Preparare una soluzione di bicarbonato di sodio 100 mM in acqua, regolare il pH a 8,5 e filtrare sterile.
- Solubilizzare 1 mg di polvere liofilizzata del colorante pH sensibile utilizzato in 150 μL di DMSO. Fabbricare aliquote monouso e conservarle a -80 °C.
- Centrifugare i sinaptosomi a 15.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
- Diluire fino a 1 mg di sinaptosomi in 100 μL di soluzione di bicarbonato di sodio 100 mM.
- Per etichettare i sinaptosomi, aggiungere 1 μL del colorante ricostituito sensibile al pH per 1 mg di sinaptosomi e coprire la reazione con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Agitare a temperatura ambiente per 2 ore utilizzando uno scuotitubo.
- Aggiungere 1 mL di DPBS alla provetta e centrifugare i sinaptosomi marcati a 15.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante ed effettuare quattro lavaggi supplementari come descritto al punto 2.2.11.
- Dopo il lavaggio finale e la centrifuga, rimuovere il surnatante il più possibile senza disturbare il pellet e risospendere i sinaptosomi marcati con DMSO al 5% in DPBS ad un volume per la concentrazione desiderata (0,7 μg / μL utilizzati qui). Preparare aliquote monouso e conservare a -80 °C. Assicurati di evitare l'esposizione alla luce ai sinaptosomi etichettati.
- Saggio di fagocitosi su cellule vive
- Piastra 20-30 × 10 4 PMP in piastre da 96 pozzetti in 100 μL di mezzo completo iMG e seguire il processo di differenziazione per 10 giorni come indicato al punto 1.2.4.
- Il giorno del test, preparare la soluzione di colorazione nucleare aggiungendo 1 goccia di una macchia nucleare per cellule vive in 2 ml di mezzo basale iMG.
- Rimuovere 40 μL di mezzo per pozzetto della piastra a 96 pozzetti e aggiungere 10 μL della soluzione di colorazione nucleare utilizzando una pipetta multicanale. Incubare la piastra a 37 °C e 5% CO 2 per2 ore.
- Scongelare i sinaptosomi etichettati sul ghiaccio e sonicare delicatamente usando un sonicatore ad acqua per 1 minuto. Trasferire immediatamente i sinaptosomi al ghiaccio. Diluire i sinaptosomi marcati nel mezzo completo iMG con un rapporto di 1 μL di sinaptosomi per 50 μL di terreno.
NOTA: La concentrazione del sinaptosoma dipende dal saggio e può richiedere un'ottimizzazione. Per mantenere una percentuale relativamente bassa (cioè lo 0,1% o meno) di DMSO nel mezzo, si consiglia di non aggiungere più di 2 μL di sinaptosomi per pozzetto. - Come controllo negativo, pretrattare alcuni dei pozzetti con citocalasina D per inibire la polimerizzazione dell'actina e quindi la fagocitosi. Preparare una soluzione di 60 μM di citocalasina D nel mezzo completo iMG. Aggiungere 10 μL di questa soluzione in ciascun pozzetto per una concentrazione finale di 10 μM e incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 30 min.
- Togliere la piastra dall'incubatore e incubare a 10 °C per 10 minuti. Mantenere la piastra su ghiaccio e aggiungere 50 μL di terreno contenente sinaptosomi preparati come descritto al punto 2.3.4.
- Centrifugare la piastra a 270 × g per 3 minuti a 10 °C e mantenere la piastra su ghiaccio fino all'acquisizione dell'imaging.
- Acquisizione e analisi delle immagini
- Inserire la piastra in un lettore di imaging a cellule vive e selezionare i pozzetti da analizzare.
- Selezionare un obiettivo 20x .
- Regolare la messa a fuoco, l'intensità del diodo a emissione luminosa (LED), il tempo di integrazione e il guadagno dei canali brightfield e blu (4',6-diamidino-2-fenilindolo [DAPI]). La fluorescenza del sinaptosoma dovrebbe essere trascurabile al momento iniziale. Per mettere a fuoco il canale rosso (RFP), utilizzare il canale campo luminoso come riferimento. Il tempo e il guadagno di integrazione possono variare tra gli esperimenti; utilizzare queste impostazioni iniziali per il canale rosso: LED: 4, tempo di integrazione: 250 e guadagno: 5.
- Selezionare il numero di singole tessere da acquisire in un montaggio per pozzetto (acquisire 16 tessere al centro del pozzo, visualizzando così circa il 5% dell'area totale del pozzo). Impostare la temperatura su 37 °C e l'intervallo di tempo desiderato per l'imaging.
NOTA: Le immagini sono state acquisite ogni 1 - 2 ore per un massimo di 16 ore in questo studio. - Aprire il software di analisi.
- Apri l'esperimento che contiene le immagini. Fare clic sull'icona Riduzione dati.
- Nel menu, selezionate Cucitura immagini in Elaborazione immagini per creare un'immagine completa dalle singole porzioni 4 x 4 nel montaggio con i parametri descritti nella Tabella 2.
- Una volta create le immagini cucite, definire una soglia di intensità utilizzando i canali DAPI e RFP per queste immagini. Apri un'immagine e fai clic su Analizza; In Analisi selezionare Analisi cellulare e in Canale di rilevamento selezionare un'immagine cucita nei canali DAPI o RFP. Vai alla scheda Maschera primaria e conteggio e stabilisci un valore di soglia e valori di dimensione dell'oggetto che selezionano correttamente i nuclei cellulari nel canale DAPI o il segnale del sinaptosoma nel canale RFP. Ripeti il processo con immagini diverse fino a quando i parametri che possono essere applicati all'intero esperimento non vengono ottimizzati.
NOTA: i valori suggeriti sono riportati nella Tabella 2. - Per contare il numero di nuclei, vai al menu Riduzione dati e, in Analisi immagine, seleziona Analisi cellulare. Vai alla scheda Maschera primaria e conteggio e in Canale, seleziona le immagini cucite DAPI e usa i parametri descritti nella Tabella 2.
- Vai alla scheda Metriche calcolate e seleziona Conteggio celle. Per ottenere l'area del segnale del sinaptosoma, vai al menu Riduzione dati e in Analisi, seleziona Analisi cellulare.
- Vai alla scheda Maschera primaria e conteggio e in Canale, seleziona Immagini cucite RFP e usa i parametri dettagliati nella Tabella 2.
- Vai alla scheda Metriche calcolate e seleziona Area somma oggetti. Nella scheda Riduzione dati , fare clic su OK e consentire al software di analizzare tutte le immagini acquisite.
- Esportare i valori Area somma oggetti e Conteggio celle per ogni punto temporale. Dividere l'area della somma degli oggetti per il conteggio delle celle per calcolare l'area normalizzata per punto temporale. Se si confrontano più trattamenti o genotipi, calcolare l'indice di fagocitosi utilizzando l'equazione (1):
(1) - Salvare i risultati e integrare i dati.
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Representative Results
Per generare iMG utilizzando questo protocollo, è importante iniziare con iPSC indifferenziate che mostrano una morfologia compatta della colonia con bordi ben definiti (Figura 2A). Le iPSC dissociate mantenute come descritto nella sezione sulla formazione di EB formeranno aggregati sferici, chiamati EB, che cresceranno di dimensioni fino al giorno 4 della differenziazione (Figura 2B). Una volta che gli EB sono stati raccolti e placcati nelle condizioni appropriate per la generazione di PMP, si attaccano alle piastre rivestite di Matrigel e uno strato di cellule si diffonderà e circonderà gli aggregati sferici (Figura 2C). Gli EB malsani si staccano dalla piastra e devono essere eliminati. Dal giorno 14 al 21 della generazione di PMP, possono emergere tipi di cellule potenzialmente diversi che fluttueranno nel mezzo; Queste celle devono essere eliminate durante i cambi di supporto12. Il giorno 28, le cellule rotonde con un grande rapporto citoplasma-nucleo appariranno in sospensione (Figura 2D), chiamate PMP. Queste cellule sono prodotte continuamente e possono essere raccolte settimanalmente durante i cambiamenti medi per un massimo di 3 mesi. Il numero di PMP raccolti ogni settimana varia e dipende dalla linea iPSC e dall'età della coltura; La resa generalmente diminuisce con il tempo. Si raccomanda vivamente di coltivare iPSC in piastre rivestite di laminina 521 anziché in Matrigel, poiché la resa di PMP è maggiore quando le iPSC sono mantenute nelle condizioni precedenti, come riportato in precedenza e in questo studio (Figura 2E)18.
Dopo che le PMP sono state esposte al mezzo iMG per 10-12 giorni, le cellule acquisiscono una morfologia simile alla microglia con un piccolo citoplasma e la presenza di processi allungati (Figura 3A). Per verificare l'identità della microglia, abbiamo eseguito la colorazione in immunofluorescenza con anticorpi contro la molecola 1 (IBA1) del marcatore mieloide ionizzato del calcio-binding adapter molecule (IBA1) e i marcatori arricchiti di microglia recettore purinergico P2RY12 e proteina transmembrana 119 (TMEM119) come descritto in precedenza20 (vedere anche la Tabella dei materiali). Tipicamente, il >95% delle cellule esprime IBA1 e circa il 90% delle cellule esprime P2RY12 e TMEM119 (Figura 3B).
Per valutare la capacità fagocitaria delle iMG, sono stati utilizzati i3sinaptosomi umani derivati da LMN marcati con un colorante sensibile al pH. Per verificare che la preparazione del sinaptosoma mantenga le proprietà strutturali canoniche, l'arricchimento del marcatore presinaptico, sinaptofisina (SYP), e del marcatore postsinaptico, la proteina di densità postsinaptica 95 (PSD95)19 è stato confermato dall'analisi Western blot (Figura 4) eseguita come descritto prima del20 (vedere anche la Tabella dei Materiali). ). I sinaptosomi marcati con un colorante sensibile al pH diventano fluorescenti dopo essere stati inghiottiti da iMG e una volta localizzati all'interno di compartimenti acidi intracellulari (cioè a basso pH).
Al punto temporale iniziale, il segnale fluorescente rosso era minimo, poiché la maggior parte dei sinaptosomi non erano ancora fagocitati. Dopo 30 minuti, un segnale fluorescente rosso è stato rilevato e aumentato ulteriormente nel tempo. Entro 10 ore, il segnale fluorescente rosso era robusto, poiché la maggior parte dei sinaptosomi era stata inghiottita ed era localizzata in compartimenti intracellulari acidi attraverso il processo di fagocitosi (Figura 5A). La citocalasina D è un inibitore della polimerizzazione dell'actina ampiamente usato per bloccare la fagocitosi. Come previsto, abbiamo osservato una forte riduzione del segnale fluorescente rosso nelle iMG trattate con citocalasina D, indicando che il segnale rilevato deriva da eventi fagocitari. Abbiamo anche notato che le iMG mostrano cambiamenti nella morfologia dopo 10 ore di fagocitosi che non sono stati rilevati nelle iMG trattate con citocalasina D, probabilmente a causa della mancanza di rimodellamento dell'actina nelle iMG trattate con citocalasina D. I cambiamenti nella morfologia della microglia sono solitamente associati allo stato di attivazione2.
Utilizzando il metodo di quantificazione automatizzato descritto, abbiamo misurato l'area totale del segnale rosso in ogni punto temporale e l'abbiamo normalizzata al numero di cellule ottenuto contando i nuclei. I risultati indicano che l'area dei sinaptosomi inghiottiti è aumentata con il tempo fino a raggiungere un plateau a 16 ore. Come previsto, l'area del segnale rosso dalle cellule trattate con citocalasina D non è aumentata nel tempo, poiché la fagocitosi è stata inibita (Figura 5B). Insieme, questi risultati indicano che le iMG sono in grado di fagocitare materiale rilevante per la malattia cerebrale e sono adatte per studi funzionali.
Figura 1: Schema del protocollo per differenziare le iPSC in cellule simili alle microglia. Il giorno 0, una volta che le iPSC hanno raggiunto l'80% di confluenza, le colonie vengono dissociate in singole cellule e coltivate in terreno EB per indurre la formazione di EB. Il giorno 4, gli EB vengono raccolti e placcati in mezzo PMP per indurre la generazione di PMP. Dopo 28 giorni, i PMP vengono raccolti e differenziati terminalmente in iMG utilizzando il mezzo iMG. I PMP possono essere raccolti settimanalmente per un massimo di 3 mesi. Abbreviazioni: iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte; iMGs = cellule simili a microglia; EB = corpo embrioide; PMP = precursore primitivo dei macrofagi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Morfologia cellulare valutata mediante microscopia ottica negli stadi di differenziazione da iPSC a PMP. (A) iPSC mantenute in mezzo iPSC fino alla confluenza dell'80%. (B) Un corpo embrioide dopo 4 giorni di differenziazione in mezzo EB. (C) EB attaccati a piastre rivestite e (D) PMP che emergono in sospensione dagli EB dopo 28 giorni di coltura in mezzo PMP. (E) Numero di PMP raccolti da ~48 EB alla settimana 1 (dopo 28 giorni di differenziazione PMP) e alla settimana 12. I grafici a barre mostrano la media di sei differenziazioni indipendenti (punti dati) da due diverse linee iPSC. Le statistiche sono state ottenute mediante il test di confronto multiplo di ANOVA e Šídák. Barre di scala = 1.000 μm (A), 400 μm (B-D). Abbreviazioni: iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte; iMGs = cellule simili a microglia; EB = corpo embrioide; PMP = precursore primitivo dei macrofagi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Le iMG differenziate da questo protocollo mostrano caratteristiche microglia in buona fede dopo 10 giorni di differenziazione terminale. (A) Immagine rappresentativa in campo chiaro di iMG che presentano morfologia simile alla microglia. Barra di scala = 400 μm. (B) Immagini rappresentative di immunofluorescenza di iMG che esprimono i marcatori mieloidi/microglia IBA1, P2RY12 e TMEM119. Barre della scala = 400 μm (A), 50 μm (B). Abbreviazioni: iMGs = cellule simili a microglia; IBA1 = molecola adattatore ionizzata legante il calcio 1; P2RY12 = recettore purinergico P2RY12; TMEM119 = proteina transmembrana 119; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: i3I sinaptosomi umani derivati da LMN hanno espresso marcatori sinaptici mediante analisi western blot. Analisi rappresentativa western blot di una preparazione di sinaptosoma umano derivata da i3LMN dopo 28 giorni di coltura sondata con il marcatore postsinaptico, PSD95, il marcatore presinaptico, SYP e β-tubulina. Abbreviazioni: i3LMN = motoneuroni inferiori derivati da iPSC; PSD95 = proteina di densità postsinaptica 95; SYP = sinaptofisina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Saggio di fagocitosi di iMG utilizzando sinaptosomi umani marcati con un colorante sensibile al pH e monitorati mediante imaging longitudinale a cellule vive. (A) Montaggi rappresentativi in campo chiaro e fluorescenza di iMG con colorazione nucleare (canale blu) esposti a sinaptosomi umani marcati (canale rosso) con e senza trattamento citoD nei punti temporali indicati. I montaggi sono stati creati elaborando post-acquisizione 16 tessere acquisite a 20x. Barre di scala = 400 μm. (B) Quantificazione dell'area del segnale fluorescente del sinaptosoma normalizzata al numero di cellule. I punti dati indicano la media ± SEM di tre repliche tecniche. Ogni curva mostra la quantificazione per due differenziazioni indipendenti (iMGs 1 e 2) da una linea iPSC con e senza trattamento citoD. Abbreviazioni: iMGs = cellule simili a microglia; citoD = citocalasina D. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Numero di piatti da 10 cm di DIF28 i3LMN | Proteine totali (μg) |
| 2 | 143.2 |
| 2 | 34.9 |
| 5 | 613.8 |
| 7 | 1,159 |
Tabella 1: Resa proteica totale dopo isolamento del sinaptosoma da motoneuroni inferiori derivati da iPSC a 28 giorni di differenziazione. Quantità proteica totale ottenuta da quattro differenziazioni indipendenti dopo l'estrazione dei sinaptosomi. In ogni differenziazione sono stati raccolti diversi numeri di piatti da 10 cm contenenti i3LMN. La resa proteica è stata misurata mediante il saggio delle proteine BCA. Abbreviazioni: iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte; i3LMN = motoneuroni inferiori derivati da iPSC; DIF28 = 28 giorni di differenziazione; BCA = acido bicinconinico.
| Parametri | Valore |
| Canale di registrazione | Campo luminoso, DAPI e RFP |
| Metodo di fusione | Miscela lineare |
| Ritaglia immagine cucita per rimuovere i rettangoli neri sui bordi | Quadrettato |
| Ridimensiona immagine finale | Quadrettato |
| Parametri | Valore |
| Soglia | Determinato dall'utente |
| Sfondo | Oscuro |
| Dividere gli oggetti che toccano | Quadrettato |
| Riempire i buchi nelle maschere | Quadrettato |
| Dimensione minima dell'oggetto | 7 μm |
| Max. dimensione dell'oggetto | 30 μm |
| Includi oggetti bordo primario | Quadrettato |
| Analizza l'intera immagine | Quadrettato |
| Parametri | Valore |
| Soglia | Determinato dall'utente |
| Sfondo | Oscuro |
| Dividere gli oggetti che toccano | Quadrettato |
| Riempire i buchi nelle maschere | Quadrettato |
| Dimensione minima dell'oggetto | 5 μm |
| Max. dimensione dell'oggetto | 100 μm |
| Includi oggetti bordo primario | Quadrettato |
| Analizza l'intera immagine | Quadrettato |
Tabella 2: Parametri utilizzati per l'acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati. Sono elencati i parametri suggeriti da considerare per l'acquisizione dell'imaging durante il test di fagocitosi e per l'analisi delle immagini acquisite.
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Discussion
Il protocollo di differenziazione qui descritto fornisce un metodo efficiente per ottenere cellule simili a microglia derivate da iPSC in ~ 6-8 settimane con elevata purezza e in una resa sufficiente per eseguire esperimenti di immunofluorescenza e altri test che richiedono un numero maggiore di cellule. Questo protocollo ha prodotto fino a 1 × 106 iMG in 1 settimana, il che consente l'estrazione di proteine e RNA e le corrispondenti analisi a valle (ad esempio, RNASeq, qRT-PCR, western blot, spettrometria di massa). Detto questo, una limitazione di questo protocollo è che la resa delle iMG può limitare determinate applicazioni. Ulteriori modifiche possono essere implementate per accumulare PMP da settimane diverse e mantenere una coltura omogenea in sospensione fino a quando non vengono raccolti abbastanza progenitori per procedere con il processo di differenziazione in una sola volta18. In alternativa, la differenziazione degli EB può essere aumentata utilizzando piastre di coltura cellulare di area superiore per aumentare la produzione di PMP.
Si consiglia di utilizzare iPSC coltivate in piastre rivestite di laminina 521 per avviare il processo di differenziazione. Altri reagenti di rivestimento possono ridurre il numero di PMP prodotti successivamente nel processo18. Allo stesso modo, il rivestimento delle piastre per l'adesione EB durante la generazione di PMP migliora l'attaccamento dell'EB, prolungando così la vita della coltura. La cultura EB è stata mantenuta per un massimo di 4 mesi, a quel punto, più EB si staccano e muoiono. Tuttavia, altri ricercatori riferiscono di aver coltivato EB fino a 1 anno12. Nelle nostre mani, le iMG generate da colture EB di 3 mesi mantengono proprietà funzionali simili a quelle delle iMG differenziate dalle colture giovani; Le colture più vecchie di 3 mesi non sono state utilizzate per la sperimentazione funzionale.
Per ottimizzare lo stadio finale della differenziazione della microglia dai protocolli originali descritti sopra 7,8, abbiamo incluso 100 ng / mL di interleuchina (IL)-34,7 5 ng / mL di fattore di stimolazione delle colonie 1 (M-CSF) 10 e 50 ng / mL di fattore di crescita trasformante beta (TGF-β) nel mezzo iMG. IL-34 e M-CSF stimolano i percorsi dipendenti dal recettore CSF1 che sono cruciali per mantenere il destino e la sopravvivenza della microglia8 mentre TGF-β supporta l'omeostasi della microglia9, promuovendo così un ambiente più fisiologico per l'impegno PMP nel destino della microglia. Da notare che l'intero processo di differenziazione qui descritto viene eseguito in condizioni prive di siero, il che impedisce possibili effetti del siero sul comportamento di iMG e alterazioni nelle applicazioni a valle. Per la sperimentazione funzionale con iMG, si raccomanda di condurre esperimenti tra 10 e 12 giorni di differenziazione terminale. Le iMG sono state coltivate fino a 14 giorni con una modesta riduzione della vitalità cellulare, dopo di che la salute cellulare è significativamente compromessa.
Poiché una delle funzioni canoniche della microglia è la fagocitosi, in questo protocollo è stato incluso un test per studiare l'attività fagocitaria in vitro . Per sviluppare un sistema basato su cellule umane, sono stati utilizzati sinaptosomi derivati da LMN umani i3. La qualità della preparazione del sinaptosoma è stata valutata mediante analisi western blot dei marcatori sinaptici in questo studio. Inoltre, altre proprietà strutturali e funzionali della preparazione del sinaptosoma possono essere studiate mediante microscopia elettronica o immunocolorazione prima del test di fagocitosi. Il protocollo qui descritto per ottenere sinaptosomi umani si basa fortemente su i3LMN, che producono un numero relativamente elevato di neuroni. Tuttavia, i rendimenti neuronali saranno probabilmente inferiori quando si utilizzano altri metodi di differenziazione (cioè protocolli che richiedono cocktail di piccole molecole). In particolare, il test di fagocitosi può essere eseguito con molti altri substrati come sinaptosomi derivati dal cervello di topo, proteine aggregate o cellule morte, che possono essere etichettati con coloranti sensibili al pH per monitorare la fagocitosi in modo simile. Si propone di utilizzare coloranti sensibili al pH perché il segnale fluorescente viene emesso principalmente quando i sinaptosomi sono localizzati all'interno di compartimenti acidi durante l'elaborazione e la degradazione dei fagosomi nei lisosomi21. Questa proprietà riduce il segnale di fondo dai sinaptosomi al di fuori delle cellule e facilita l'uso di metodi automatizzati di quantificazione. Inoltre, i coloranti sensibili al pH consentono di rilevare veri eventi di fagocitosi rispetto all'aderenza del substrato o all'attracco sulla membrana cellulare.
Mentre qui si suggerisce di utilizzare ~ 35 μg di sinaptosomi per pozzetto, la quantità specifica di sinaptosomi umani e altri substrati dovrebbe essere ottimizzata, poiché le condizioni ottimali dipendono dalla linea iPSC e dalle condizioni sperimentali. Un intervallo ideale di sinaptosomi dovrebbe risultare in una dose-risposta nel test di fagocitosi. Troppi sinaptosomi possono saturare il sistema, rendendo difficile rilevare differenze significative in funzione del genotipo o del gruppo di trattamento. Troppo poco materiale si tradurrà in un segnale di uscita debole nel test. Per questo motivo, si consiglia di testare più concentrazioni di ciascun substrato per stabilire un saggio funzionante. Inoltre, è importante mantenere la % DMSO entro un intervallo di sicurezza per preservare la salute delle cellule.
In questo protocollo, la fagocitosi è stata monitorata utilizzando un sistema di imaging di cellule vive (Table of Materials) perché fornisce informazioni cinetiche sulla capacità di inghiottimento delle cellule. Anche microscopi e sistemi di imaging in grado di supportare l'imaging di cellule vive e mantenere stabili temperatura, umidità e concentrazioni di CO2 sono adatti per questo test. Tutti gli esperimenti di fagocitosi qui descritti sono stati ripresi a 37 °C con 85%-95% di umidità e 5% di CO2. Altri metodi di rilevamento come l'imaging di cellule fisse o la citometria a flusso possono anche essere utilizzati per valutare la fagocitosi utilizzando gli stessi materiali e protocolli di coltura cellulare (fino alla generazione di iMG e sinptosomi marcati) quando l'imaging di cellule vive non è fattibile o desiderato. Allo stesso modo, altri software open source possono essere utilizzati per l'analisi dei dati come ImageJ o CellProfiler; Quest'ultimo consentirà un'analisi automatizzata paragonabile al software utilizzato qui.
In sintesi, viene illustrata l'implementazione di un protocollo robusto per differenziare le cellule simili alle microglia dalle iPSC umane, superando così la limitata risorsa della microglia umana. La microglia differenziata può essere utilizzata per una varietà di applicazioni nello studio delle malattie dello sviluppo neurologico e neurodegenerative. Inoltre, è incluso un saggio di fagocitosi completamente "umanizzato", che aiuterà ulteriormente lo studio della funzione e della disfunzione della microglia nel contesto dello sviluppo umano e della malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Michael Ward per aver fornito la linea WTC11 hNIL iPSC per il differenziamento dei motoneuroni e i Jackson Laboratories per aver fornito la linea iPSC del clone KOLF2.1J WT B03 utilizzata per il differenziamento delle microglia. Ringraziamo anche Dorothy Schafer per il suo supporto durante l'implementazione dei protocolli, Anthony Giampetruzzi e John Landers per il loro aiuto con il sistema di imaging delle cellule vive, nonché Hayden Gadd per i suoi contributi tecnici durante le revisioni e Jonathan Jung per la sua collaborazione in questo studio. Questo lavoro è stato supportato dal Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience della UMASS Chan Medical School e dall'Angel Fund, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F.
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
