Determinação da Cinética de Ativação In Vitro e Celular para Aptamers de RNA Fluorogênico

Madeline M. Mumbleau; Madeline R. Meyer; Ming C. Hammond

doi:10.3791/64367

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Artigo de método

Determinação da Cinética de Ativação In Vitro e Celular para Aptamers de RNA Fluorogênico

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DOI:

10.3791/64367

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9 de agosto de 2022

Madeline M. Mumbleau^*¹ , Madeline R. Meyer^*¹ , Ming C. Hammond¹

¹Department of Chemistry and Henry Eyring Center for Cell & Genome Science, University of Utah

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O protocolo apresenta dois métodos para determinar a cinética dos aptâmeros de RNA fluorogênico Espinafre2 e Brócolis. O primeiro método descreve como medir a cinética do aptâmero fluorogênico in vitro com um leitor de placas, enquanto o segundo método detalha a medição da cinética do aptâmero fluorogênico nas células por citometria de fluxo.

Resumo

Aptâmeros de RNA fluorogênicos têm sido aplicados em células vivas para marcar e visualizar RNAs, relatar a expressão gênica e ativar biossensores fluorescentes que detectam níveis de metabólitos e moléculas de sinalização. Para estudar as mudanças dinâmicas em cada um desses sistemas, é desejável obter medições em tempo real, mas a precisão das medições depende da cinética da reação fluorogênica ser mais rápida do que a frequência de amostragem. Aqui, descrevemos métodos para determinar a cinética de ativação in vitro e celular para aptâmeros de RNA fluorogênicos usando um leitor de placas equipado com um injetor de amostra e um citômetro de fluxo, respectivamente. Mostramos que a cinética in vitro para a ativação por fluorescência dos aptâmeros Espinafre2 e Brócolis pode ser modelada como reações de associação bifásica e tem diferentes constantes de taxa de fase rápida de 0,56 s−1 e 0,35 s⁻¹, respectivamente. Além disso, mostramos que a cinética celular para a ativação por fluorescência do Espinafre2 em Escherichia coli, que é ainda mais limitada pela difusão do corante nas bactérias Gram-negativas, ainda é suficientemente rápida para permitir uma frequência de amostragem precisa na escala de tempo minuto. Esses métodos para analisar a cinética de ativação por fluorescência são aplicáveis a outros aptâmeros de RNA fluorogênicos que foram desenvolvidos.

Introdução

Reações fluorogênicas são reações químicas que geram um sinal de fluorescência. Os aptâmeros de RNA fluorogênicos normalmente desempenham essa função ligando um corante de molécula pequena para aumentar seu rendimento quântico de fluorescência (Figura 1A)¹. Diferentes sistemas de aptâmeros de RNA fluorogênicos foram desenvolvidos e consistem em sequências específicas de aptâmeros de RNA e os ligantes corantes correspondentes¹. Aptâmeros de RNA fluorogênicos têm sido anexados a transcritos de RNA como etiquetas fluorescentes que permitem a imagem de células vivas de mRNAs e^<....