Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Luciferaz Dönüştürülmüş İnsan T Hücrelerini Kullanarak Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Kaçakçılığını İzleme

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64390
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

Burada, T hücresi ile ilgilenen bispesifik antikorların anti-tümör etkinliğini ve mekanizmasını değerlendirmek için yapılan çalışmalarda, bispesifik antikor kaynaklı T hücresi kaçakçılığının tümörlere in vivo izlenmesini kolaylaştırmak için insan T hücrelerini lusiferaz ile dönüştürmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Abstract

T hücresini tutan bispesifik antikorlar (T-BsAbs), solid tümörler için klinik öncesi gelişim ve klinik testlerin çeşitli aşamalarındadır. Değerlik, mekansal düzenleme, alanlar arası mesafe ve Fc mutasyonları gibi faktörler, bu tedavilerin anti-tümör etkinliğini, genellikle T hücrelerinin tümörlere yönlendirilmesini etkileyerek etkiler ve bu da büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir. Burada, aktif insan T hücrelerini lusiferaz ile dönüştürmek için bir yöntem tarif ediyoruz, bu da T-BsAb terapi çalışmaları sırasında T hücrelerinin in vivo izlenmesine izin veriyor. T-BsAbs'nin T hücrelerini tümörlere yönlendirme yeteneği, tedavi sırasında birden fazla zaman noktasında kantitatif olarak değerlendirilebilir ve araştırmacıların T-BsAbs'nin anti-tümör etkinliğini ve diğer müdahaleleri tümörlerdeki T hücrelerinin kalıcılığı ile ilişkilendirmelerini sağlar. Bu yöntem, T hücresi infiltrasyonunu histolojik olarak değerlendirmek için tedavi sırasında hayvanları kurban etme ihtiyacını hafifletir ve tedavi sırasında ve sonrasında T hücresi kaçakçılığının kinetiğinin belirlenmesi için birden fazla zaman noktasında tekrarlanabilir.

Introduction

T hücresine bağlı bispesifik antikorlar (T-BsAbs), T hücrelerini bir bağlanma kolundan ve bir tümör antijenini başka bir bağlanma kolundan geçirerek poliklonal T hücrelerine yapay özgüllük sağlamak için kullanılan mühendislik antikorlarıdır. Bu teknoloji hematolojik kanserlere (CD19 hedefli blinatumomab1) başarıyla uygulanmıştır ve çok sayıda T-BsAb, çeşitli solid tümörler için preklinik ve klinik gelişim aşamasındadır2. T-BsAb'lar, poliklonal T hücrelerini majör histokompatibilite kompleksi (MHC) bağımsız bir şekilde meşgul eder ve bu nedenle insan lökosit antijenlerini (HLA'lar) aşağı regüle eden tümörler bile bu tür bir tedaviye duyarlıdır 3,4. T-BsAb'lar, T hücresinin ve tümör bağlama kollarının değerliği ve mekansal düzeni, alanlar arası mesafeler ve yarı ömrü etkileyen ve varsa efektör fonksiyonlarını indükleyebilen bir Fc alanının dahil edilmesindeki farklılıklarla düzinelerce farklı formatta geliştirilmiştir5. Laboratuvarımızdaki önceki çalışmalar, bu faktörlerin T-BsAbs'nin anti-tümör etkinliğini önemli ölçüde etkilediğini ve potens6'da 1.000 kata kadar farklılıklar olduğunu göstermiştir. Bu çalışma sayesinde, IgG-[L]-scFv formatını T-BsAbs için ideal platform olarak tanımladık (T-BsAb formatları hakkında daha fazla ayrıntı için Temsilci Sonuçlar bölümüne bakın) ve bu platformu GD2 (nöroblastom), HER2 (meme kanseri ve osteosarkom), GPA33 (kolorektal kanser), STEAP1 (Ewing Sarkomu), CD19 (B hücreli maligniteler) ve CD33 (B hücreli maligniteler)7 dahil olmak üzere hedeflere uyguladık. 8,9,10,11,12,13.

Katı tümörlerde T-BsAb tedavisinin başarılı bir şekilde uygulanmasındaki en büyük zorluklardan biri, tümörlere T hücresi kaçakçılığını sağlamak için immünosüpresif tümör mikroçevresinin (TME) üstesinden gelmektir14. Yukarıda tarif edilen T-BsAb etkinliğini etkileyen faktörler, T-BsAbs'nin tümörlere T hücresi homing'i etkili bir şekilde indükleme kabiliyeti üzerinde önemli bir etkiye sahiptir, ancak bu etkinin in vivo bir sistemde gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesi zordur. Bu makalede, tedavi sırasında deneysel immün sistemi baskılanmış fare modellerinde çeşitli dokulara T hücre kaçakçılığını değerlendirmek için T-BsAbs'nin klinik öncesi çalışmalarında lusiferaz transdüne T hücrelerinin kullanımının ayrıntılı bir açıklaması sunulmaktadır. Bu yöntemin genel amacı, tümörlerde ve diğer dokularda T hücresi infiltrasyonunu değerlendirmek için bir araç sağlamanın yanı sıra, tedavi sırasında hayvanları feda etmeye gerek kalmadan T hücresi homing kinetiği ve kalıcılığı hakkında gerçek zamanlı bir bakış açısı sağlamaktır. Hücresel immünoterapilere odaklanan artan sayıda araştırmacı için, klinik öncesi hayvan modellerinde T hücrelerini in vivo olarak izleme yeteneği çok önemlidir. Diğer araştırmacıların bu tekniği kolayca çoğaltmalarını sağlamak için lusiferaz transdüne T hücrelerini izlemek için kullandığımız yöntemin kapsamlı ve ayrıntılı bir açıklamasını sunmayı amaçlıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıdaki prosedürler Memorial Sloan Kettering'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından değerlendirilmiş ve onaylanmıştır.

1. 293T hücrelerinin lusiferaz ile transfeksiyonu ve viral süpernatan hasadı

  1. 293T hücrelerin kültürü
    1. Her biri bir litre DMEM'e aşağıdakileri ekleyerek ortam hazırlayın: 110 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 11 mL penisilin-streptomisin.
    2. 5 x 106 293T hücrelerini çözün ve yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan ortamla bir T175 şişesine aktarın.
    3. 293T hücrelerini 6 gün boyunca her 3 günde bir 1:10 bölün. Hücrelerin% 90'dan fazla birleşmesine izin vermeyin.
  2. 293T hücrelerinin transfeksiyonu
    NOT: Aşağıdaki reaktif miktarları, 293T hücrelerin bir T175 şişesinin transfekte edilmesi için hesaplanmıştır. Daha fazla şişe dönüştürülecekse buna göre ayarlayın.
    1. Bir pipet kullanarak iki 50 mL tüpün her birine 1,5 mL ortam aktarın. Bir tüpe 10 μg VSV-G plazmid, 20 μg Gag / pol ve 20 μg tıklama böceği kırmızı TD domates (CBR-TDR) lusiferaz plazmidi ekleyin ve karıştırın. Diğer tüpe 100 μL DNA in vitro transfeksiyon reaktifi ekleyin ve karıştırın. Her iki tüpü de oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Bu makalede açıklanan tüm plazmidler Dr. Vladimir Ponomarev tarafından sağlanmıştır.
    2. DNA in vitro transfeksiyon reaktifini içeren ortamı, DNA plazmidlerini içeren tüpe damla damla aktarın (yaklaşık 30 saniyenin üzerinde) ve bir pipetle hafifçe karıştırın. RT'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
    3. Bu 20 dakikalık inkübasyon sırasında, 5-10 mL% 0.05 tripsin ekleyerek 293T hücrelerini ayırın. Hücreler ayrıldıktan sonra, 10 mL ortam ekleyin ve 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj yapın. Hücreleri 1.5 mL ortamdaki yeniden askıya alın.
    4. DNA in vitro transfeksiyon reaktifini ve DNA plazmidlerini içeren ortamı 293T hücrelerine ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    5. Bir T175 şişesine aktarın ve 18 mL ortam ekleyin. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    6. Ertesi gün, hücreleri ayırmadan ortamı bir cam pipetle dikkatlice aspire edin. 18 mL taze ortam ile değiştirin. Bir inkübatörde gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Viral süpernatan hasadı
    1. Viral süpernatantı buza konmuş bir pipet kullanarak çıkarın. Hücreleri ve kalıntıları pelet etmek için 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleyin.
      NOT: Hücre peleti büyükse, süpernatant çıkarıldığında hücreler muhtemelen şişeden bozulmuştur. Bu hücreler taze ortam ile yeni bir şişede tekrar kaplanabilir.
    2. Viral süpernatantı 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin.
    3. Viral süpernatantı hemen kullanın. Buz üzerinde veya 24 saate kadar 4 ° C'de saklayın veya uzun süreli depolama için -80 ° C'de dondurun.

2. Lusiferaz ile aktive edilmiş insan T hücrelerinin genişlemesi ve transdüksiyonu

  1. İnsan T hücrelerinin in vitro aktivasyonu
    1. Steril 15 mL'lik bir tüpe %0,1 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek, boncuklar ekleyerek (iki T hücresi başına bir boncuk), 2 dakika boyunca bir mıknatıs rafına yerleştirerek ve PBS'yi emerek boncukları yıkayın.
    2. Ortamı adım 1.1.1'de açıklandığı gibi hazırlayın, ardından IL-2'yi 30 IU / mL'lik son konsantrasyona ekleyin ve yıkanmış boncukları ekleyin. Aktive edilecek her iki milyon T hücresi için 2,5 mL ortam yapın.
    3. Bir hemositometre ve tripan mavisi leke kullanarak T hücrelerini (taze saflaştırılmış veya önceden saflaştırılmış, dondurulmuş, çözülmüş ve yıkanmış) sayın. Adım 2.1.2'de hazırlanan ortama T hücreleri ekleyin ve karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin. T hücreleri, hücrelerin kaynağına ve genel sağlığına bağlı olarak en az 20 kat genişleyecektir. Fareleri tedavi etmek için gereken sayıyı hesaplayarak ve 20'ye bölerek aktive edilecek T hücrelerinin sayısını belirleyin. Burada, ön deneylere dayanarak fare başına 20 x 106 T hücre kullanılmıştır.
    4. 24 delikli bir doku kültürü plakasının her bir kuyucuğunda iki milyon T hücresi, boncuk ve IL-2 içeren 2.5 mL ortam plakası. Nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de kültür.
    5. Lusiferaz ile ne zaman transdübe edileceğini belirlemek için T hücrelerini önümüzdeki 3 gün boyunca her gün 20x mikroskop altında inceleyin. Hücreler bir araya toplandıklarında ve medyayı tükettiklerinde, kırmızı / pembeden açık turuncuya dönüştürdüklerinde hazırdırlar.
  2. Retronektin plakalarının hazırlanması
    NOT: Retronektin, gen iletimini arttırdığı için transdüksiyonda kullanılan plakaları kaplamak için kullanılır15.
    1. PBS'de 2 mL 20 μg / mL retronektin, işlenmemiş 6 delikli bir plakanın kuyucuğuna ekleyin. RT'de 2 saat veya 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Her iki milyon T hücresinin dönüştürülmesi için retronektin kaplı bir kuyu gereklidir.
    2. Plakanın tabanını çizmeden retronektini aspire edin.
    3. 6 delikli plakadaki kuyucuk başına PBS'de (steril filtreli) 3 mL% 2 BSA ekleyin. RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Spinokülasyon
    1. BSA'yı plakanın tabanını çizmeden aspire edin.
    2. Kuyucukları bir kez kuyu başına 3 mL PBS ile yıkayın. Devam edin veya taze PBS ile değiştirin ve plakayı gece boyunca 4 ° C'de kapalı bırakın.
    3. Kuyucuk başına 2 mL CBR-TDR lusiferaz viral süpernatant (adım 1.3'te toplanır) ekleyin.
    4. 32 °C'de 90 dakika boyunca 1.240 x g'de santrifüj.
  4. Iletim
    1. T hücrelerini sayın.
    2. Viral süpernatantı plakanın dibini çizmeden aspire edin.
    3. 30 IU / mL insan IL-2 içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'unun (DMEM) 6 mL'sinde kuyu başına iki milyon T hücresi plakası.
    4. T hücrelerini günlük olarak inceleyin. T hücreleri, genellikle 2 gün sonra, neredeyse birleştiklerinde genişlemeye hazırdır.
    5. Hücreler neredeyse birleştiğinde, bir pipet kullanarak plakanın altından yavaşça yıkayın ve her bir kuyucuğu ayrı bir T75 şişesine aktarın. Şişe başına toplam 15 mL ortam için 9 mL ortam ekleyin.
    6. Ertesi gün, ek olarak 15 mL ortam ekleyin. Hücreler, bu ortam ilavesinden bir gün sonra farelere enjekte edilmeye hazır olmalıdır. Akış sitometrisi yaparak başarılı transdüksiyonu onaylayın (lusiferaz yapısı, PE kanalında görülebilen bir TD domates floroforu içerir)16.

3. Bağışıklık sistemi baskılanmış farelerde lusiferaz transdüslü T hücrelerinin engraftmanı

  1. T hücrelerini enjeksiyon için hazırlayın ve sayın.
    1. T hücrelerini şişelerden çıkarın ve sayın. Hücreler, 20x-30x genişlediklerinde, genellikle aktivasyon sonrası 7. günde enjekte etmeye hazırdır.
    2. T hücrelerini 800 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. 2 mL ortamda tekrar askıya alın ve bir mıknatıs rafı kullanarak boncukları çıkarın.
    3. T hücrelerinin bispesifik antikorlardan ayrı olarak enjekte edileceği deneyler için, T hücrelerini sayın ve nihai konsantrasyonun 100 μL ortam başına 20 milyon T hücresi olacak şekilde yeniden askıya alın. 3.2 adımına geçin. Ex vivo silahlı T hücreleri (EAT) kullanan deneyler için adım 3.1.4'e atlayın.
    4. Ex vivo silahlı T hücrelerini kullanan deneyler için, T hücrelerini sayın ve bunları fare başına 20 milyon hücre ile her grup için ayrı ayrı 1,5 mL tüplere ayırın. Örneğin, her biri beş fareden oluşan üç grup varsa, her biri 100 milyon T hücreli üç adet 1,5 mL tüp hazırlayın.
    5. 1,5 mL'lik tüpleri 800 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Ortamın T hücresi topaklarını rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın. Bispesifik antikorları içeren en fazla 50 μL'lik ortamda yeniden askıya alın. RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Bu çalışmada yapılan deneylerin amaçları doğrultusunda, laboratuvarda üretilen tescilli IgG-[L]-scFv T hücresi ile ilgilenen bispesifik antikorlar kullanılmıştır. T hücresi silahlandırması için, 20 x 106 T hücresi başına 5 μg antikor kullanın. Ticari olarak temin edilebilen bispesifik antikorlar da kullanılabilir.
    6. Her tüpe 1.450 μL ortam ekleyerek fazla antikorları yıkayın. 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj yapın, ortamı dikkatlice aspire edin ve 100 μL ortam başına 20 milyon silahlı T hücresi konsantrasyonunda yeniden askıya alın.
  2. Farelere enjeksiyon ve engraftman
    1. Fareleri, 1 L / dak oksijende% 3.5 (v / v) inhale izofluran sağlayan bir odada uyuşturun. Arka bacak pedalı çekilme refleksi ortadan kalktığında fareler tamamen uyuşturulur.
      NOT: İşlem boyunca termal destek sağlayın.
    2. 26 G'lik bir iğne kullanarak, fare başına geriye dönük olarak 100 μL ortama 20 milyon T hücresi enjekte edin.
    3. T hücresi sağkalımını in vivo olarak desteklemek için 1.000 U rekombinant IL-2'yi deri altından uygulayın.
    4. Bispesifik antikorları retroorbital olarak (T hücresi enjeksiyonu için kullanılmayan göz içine) veya intraperitoneal olarak uygulayın. Farelerin anesteziden kurtulmasına ve kafeslerine dönmesine izin verin.
      NOT: Yine, burada, laboratuarda üretilen tescilli antikorlar kullanıldı, ancak bunun yerine ticari olarak temin edilebilen antikorlar kullanılabilir. Buradaki deneylerde, doz başına fare başına 0.3-10 μg antikor uygulandı. Antikorlar 3-4 hafta boyunca haftada iki kez uygulandı.

4. Lusiferaz transdüslü T hücreleri ile aşılanmış farelerin in vivo görüntülemesi

NOT: Bu adım, T hücrelerinin ve / veya antikorların farelere uygulandığı gün olması gerekmeyen görüntüleme gününde gerçekleştirilmelidir. Tipik olarak, lusiferaz transdüe T hücrelerinin uygulanmasından 24 saat sonra görüntüleme yapıyoruz.

  1. D-luciferin'in hazırlanması
    1. 1 g D-lusiferini 33.3 mL steril PBS içinde çözün (nihai konsantrasyon: 30 mg / mL).
    2. Çözünmüş D-lusiferini 33 x 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine alın ve tüpleri -20 ° C'de tutun.
    3. Görüntüleme gününde, görüntülenecek hayvan sayısı için yeterli miktarda 30 mg / mL D-lusiferin alikotunu çözün. Bir tüp 10 hayvan için yeterlidir.
      NOT: Kullanımdan sonra kalan D-luciferin'i tekrar dondurun. D-lusiferin en az beş donma / çözülme döngüsü için kararlıdır.
  2. D-luciferin'in farelere uygulanması
    NOT: D-luciferin'i farelere uygulamadan önce, görüntüleme yazılımını açın ve sistemi başlatın. Kameranın soğuması birkaç dakika sürebilir ve bu, substratın uygulanmasından 5 dakika sonra görüntülemenin yapılabilmesini sağlamak için farelere D-lusiferin enjekte edilmeden önce yapılmalıdır.
    1. 1 L/dak oksijende %3,5 (v/v) solunan izofluran sağlayan bir odada beş fareye kadar anestezi uygulayın. Arka bacak pedalı çekilme refleksi ortadan kalktığında fareler tamamen uyuşturulur.
    2. Fareler tamamen anestezi altına alındıktan sonra, 26 G iğne ile retroorbital enjeksiyonla fare başına 100 μL 30 mg / mL D-lusiferin (fare başına 3 mg) uygulayın. D-luciferin'i bir sonraki gruba uygulamadan önce bu fare grubunu görüntüleyin. Bir sonraki fare grubunu, önceki grup görüntülenirken anestezi uygulanacak izofluran odasına yerleştirin.
  3. Lusiferaz transdüne T hücrelerinin görüntülenmesi
    1. Anestezi uygulanan fareleri görüntüleyicinin ışık geçirmez odasına taşıyın ve 0,5 L/dak'da %3 izofluran uygulamaya devam edin. Fareleri, ksenogrefti taşıyan kanat kameraya doğru bakacak şekilde yanlarına yerleştirin. Akciğerlerdeki T hücresi varlığını değerlendirmek için farelerle sırtüstü pozisyonda başka bir dizi görüntü alın.
    2. Edinme Denetim Masası'nı kullanarak Lüminesan, Fotoğraf ve Bindirme'yi seçin. Pozlama süresini otomatik, gruplamayı orta ve F/Stop değerini 1 olarak ayarlayın. Görüntüleri alın. İlk görüntüden sonra, sonraki görüntülerin doğrudan karşılaştırılabilmesi için pozlama süresini ilk görüntü için otomatik olarak hesaplananla eşleşecek şekilde ayarlayın. Piksel doygunluğu olmadan en parlak sinyali elde etmek için en uygun pozlama süresini belirlemek üzere birden fazla pozlama süresine sahip görüntüler yakalamak yararlı olabilir.
    3. Fareleri izoflurandan çıkarın, kafeslerine geri dönün ve uyanık ve ayakta olana kadar gözlemleyin.
    4. Tüm gruplar görüntülenene kadar adım 4.2.1'deki adımları tekrarlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Adım 4.3'te açıklandığı gibi, fareler farklı dokulardaki T hücrelerinin varlığını değerlendirmek için görüntüleme sırasında farklı pozisyonlarda yönlendirilebilir. Sırtüstü konumlandırma, enjeksiyondan sonra erken zaman noktalarında yaygın olan akciğerlerdeki T hücrelerinin değerlendirilmesine izin verir. Subkutan ksenogreft yukarı bakacak şekilde lateral pozisyonlama, tümöre T hücre kaçakçılığını en iyi şekilde değerlendirmek için kullanılır. Bu makalede açıklanan tüm deneyler için dişi C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac fareleri kullanılmıştır. Şekil 1, GD2-pozitif ksenogreftler taşıyan farelerin, bir GD2 BsAb veya lusiferaz transdüe T hücreleri ile ex vivo silahlı lusiferaz transdüe T hücreleri ve GD2 BsAb ile ayrı ayrı enjekte edildiği bir deneyden görüntüler göstermektedir17. Şekil 1A, silahlı T hücrelerinin tümöre silahsız T hücrelerinden daha hızlı kaçakçılık yaptığını göstermektedir (Şekil 1B), akciğerleri 2 gün daha erken terk etmektedir. Şekil 1C, bu fenomenin nicelleştirilmesini göstermektedir. Şekil 1E-G, lusiferaz transdüksiyonlu T hücrelerinin enjeksiyonundan sonra en az 28 gün boyunca T hücresi kaçakçılığını izlemenin mümkün olduğunu göstermektedir ve araştırmacıların, T hücresi infiltrasyonunun sadece bir anlık görüntüsüne izin veren immünohistokimya (IHC) gibi diğer tekniklerin aksine, tedavi boyunca T hücresi homing ve kalıcılığını izlemelerine izin vermektedir.

T hücresi kaçakçılığını in vivo olarak değerlendirme yeteneği olmadan, T-BsAbs'yi test eden araştırmacılar, T hücrelerinin tedavi sırasında tümörlere sızıp sızmadığını ve devam edip etmediğini belirleyemezler. Bir tedavi başarısız olursa, hayvanları feda etmeden ve IHC uygulamadan, başarısızlığın T hücresi kaçakçılığı, kalıcılık, T hücresi tükenmesi veya başka bir nedenden kaynaklanıp kaynaklanmadığını bilmek zor veya imkansız olabilir. Şekil 2A-C, meme kanseri hastası kaynaklı ksenogreftleri taşıyan farelerin, Fc fonksiyonlarını susturmak için lusiferaz transdüe edilmiş insan T hücreleri ve farklı mutasyonlar taşıyan HER2 hedefli BsAbs ile tedavi edildiği bir deneyi göstermektedir7. Şekil 2C, susturulmamış bir Fc ile HER2 BsAb ile yapılan tedavinin, kontrol BsAb'ına kıyasla tümör büyümesi üzerinde hiçbir etkisi olmadığını, oysa tek başına veya bir K322A mutasyonu ile kombinasyon halinde bir N297A mutasyonu içeren HER2 BsAbs ile tedavinin tümör büyümesini tamamen durdurabildiğini göstermektedir. Şekil 2A ve Şekil 1B, susturucu mutasyonlara sahip gruplarda, T hücrelerinin lüminesans sinyalinin enjeksiyon sonrası 3. günde daha yüksek bir zirveye ulaştığını ve kontrol BsAb ve susturulmamış HER2 BsAb'ye kıyasla daha yüksek bir seviyede devam ettiğini göstermektedir. Takip deneyleri, susturulmamış Fcs'li T hücreleri ve BsAb'larla tedavi edilen farelerde, akciğerlerin perivasküler bölgelerindeki T hücrelerinin murin nötrofiller ve makrofajlarla çevrili olduğunu ve bunun da tümöre göçü önleyen BsAb'ye bağlı T hücrelerinin Fc'ye bağımlı bir şekilde tutulmasını önerdiğini göstermiştir. Tümör yerleşimli M2-polarize makrofajların pro-tümörojenik etkisi iyi tanımlanmıştır. Şekil 3A,B, nöroblastom hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX'ler) taşıyan farelerde, Ly6c-pozitif makrofajların tükenmesinin, tümörlere yönelen T hücresini önemli ölçüde artırdığını, bunun sonucunda tümör büyümesinin azaldığını ve sağkalımın uzadığını göstermektedir (Şekil 3C)18. Bu etki osteosarkom PDX'lerinde daha da belirgindir (Şekil 3D).

İn vivo T hücresi takibi ayrıca araştırmacıların T hücresi kaçakçılığı kinetiğinin, yapısal konfigürasyon da dahil olmak üzere antikor mühendisliğindeki diğer değişkenlerden nasıl etkilendiğini izlemelerini sağlar. Bu makalenin girişinde açıklandığı gibi, laboratuvarımızdaki önceki çalışmalar, BsAbs'nin in vivo etkinliği için tümör ve T hücresine bağlanan kolların bivalans ve cis oryantasyonunun önemini vurgulamıştır. Şekil 4, tümör antijeni STEAP1'i (Şekil 4A) hedef alan bir BsAbs paneli arasında, IgG-[L]-scFv formatının, tedavi süresince devam eden ilk T hücresi dozundan sonraki 6. günde önemli ölçüde daha fazla T hücresi infiltrasyonu ile sonuçlandığını göstermektedir (Şekil 4C)10. Bu fenomen in vitro sitotoksisite testleri (Şekil 4B) tarafından öngörülmemiştir ve in vitro sonuçların in vivo modellerde doğrulanmasının önemini vurgulamaktadır.

Figure 1
Şekil 1: Silahlı T hücreleri, BsAb tarafından yönlendirilen silahsız T hücrelerinden daha hızlı tümör güdümlü kinetiği sergiler ve akciğer sekestrasyonunu hızla atlar. Luciferaz transdübe T hücreleri genişletildi ve BsAb (Luc (+) GD2-EAT'ler) ile silahlandırıldı. Luc(+) GD2-EAT'ler (10 μg GD2-BsAb/2×107 T hücre) veya Luc(+) GD2-BsAb (10 μg) olan veya olmayan silahsız T hücreleri (2 x 107 hücre), ortalama tümör hacmi 100 mm3'e ulaştığında GD2 pozitif nöroblastom PDX taşıyan farelere intravenöz olarak uygulandı. (A) GD2-EAT'lerin tümörlere kaçakçılığının biyolüminesans görüntüleri. (B) GD2 BsAb'ın biyolüminesans görüntüleri, günler boyunca tümörlere silahsız T hücresi kaçakçılığını yönlendirdi. (C) Tümör konturu (ROI) üzerine entegre edilmiş piksel başına toplam akı veya ışıma (foton/s) olarak ifade edilen biyolüminesans (n = 5 fare/grup) ile ölçülen zaman içinde tümörlere T hücresi infiltrasyonunun kantitasyonu. (D) GD2-EAT'ler, GD2-BsAb artı silahsız T hücreleri veya silahsız T hücreleri ile tedavi edilen bireysel farelerin tümör büyüme eğrileri. Hedef antijene özgü EAT'lerin in vivo kalıcılığını test etmek için, Luc(+) GD2-EAT'ler (10 μg GD2-BsAb/2×107 T hücre ile donanmış) veya Luc(+) HER2-EAT'ler (10 μg HER2-BsAb/2×107 T hücreli) osteosarkom TEOS1C PDX taşıyan farelere intravenöz olarak uygulandı. 7. ve 14. günlerde iki ek doz lusiferaz transdüe GD2-EATs veya HER2-EATs uygulandı. (E) Tedavi sonrası tümörlerde Luc(+) EAT'lerin biyolüminesansının kantitasyonu. (F) GD2-EAT'ler, HER2-EAT'ler veya silahsız T hücreleri ile tedavi edilen veya tedavi edilmeyen bireysel farelerin tümör büyüme eğrileri. (G) Zaman içinde tümörlerde Luc(+) GD2-EAT'lerin (üstte) veya Luc(+) HER2-EAT'lerin (altta) biyolüminesans görüntüleri. Luc(+) EAT'lerin biyolüminesansı enjeksiyondan sonraki 28 gün içinde tespit edildi. Kısaltmalar: EATs = ex vivo silahlı T hücreleri; ROI = ilgilenilen bölge. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını gösterir. Bu rakam Park ve ark.17'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: DKO farelerde HER2 pozitif insan meme kanseri PDX'e T hücresi kaçakçılığı. (A) T hücresi kaçakçılığının temsili biyolüminesans görüntüleri. (B) Tüm tümör konturu (ROI) boyunca entegre edilmiş her pikselde toplam akı veya ışıma (foton/s) olarak ifade edilen biyolüminesans (n = 5 fare/grup) ile zaman içinde tümörlere T hücresi kaçakçılığının kantitasyonu. (C) Ctrl BsAb, HER2 BsAb ve Fc mutantları ile tedaviden sonra HER2 pozitif meme kanseri PDX (M37) büyümesi (n = 5 fare / grup). Gösterilen sonuçlar en az üç bağımsız deneyden elde edilen temsili sonuçlardır. Anlamlı farklılıklar, eğrinin altındaki alana (AUC) göre hesaplanmıştır. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını gösterir. Bu rakam Wang ve ark.7'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Monosit tükenmesinin BsAb kaynaklı T hücre kaçakçılığı ve in vivo anti-tümör yanıtı üzerindeki etkileri. (A) Luciferaz transdüe T hücreleri (Luc(+) T hücreleri) veya lusiferaz transdüe GD2-BsAb silahlı T hücreleri (Luc(+) GD2-EAT'ler), nöroblastoma hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) taşıyan farelere anti-Ly6C antikoru ile uygulandı. (B) Tümörün lezyonlarında biyolüminesans izlendi. 7. günde biyolüminesans görüntüleri ve tümörün lezyonlarında biyolüminesansın miktarının belirlenmesi. (C) Anti-Ly6C antikoru olan GD2-EAT'lerin in vivo anti-tümör yanıtı nöroblastoma PDX'lere karşı test edildi. (D) Anti-Ly6C antikoru ile GD2-EAT'lerin in vivo anti-tümör etkisi osteosarkom PDX'lerine karşı test edildi ve uzun süreli sağkalım analiz edildi. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını gösterir. İn vivo anti-tümör etkisi AUC ve sağkalım eğrisi analizleri ile karşılaştırıldı. Tümör infiltrasyonu yapan lenfositler, biyolüminesansın AUC'si kullanılarak ölçüldü. Şekilde belirtilen örnekler arasındaki farklar, iki veri kümesi için iki kuyruklu bir Öğrenci t-testi ve üç veya daha fazla veri kümesi için Tukey'in post hoc testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak istatistiksel anlamlılık açısından test edilmiştir. * p < 0.05; ** p < 0.01; p < 0.001; p < 0.0001. Bu rakam Park ve ark.18'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Anti-STEAP1 T hücresi ile ilgilenen bispesifik antikorun anti-tümör aktiviteleri. (A) STEAP1 BsAb'nin altı yapısal formatının şematik gösterimi. (B) Farklı STEAP1 BsAb formatları kullanılarak EFT hücre hatlarına (TC32 ad TC71) karşı antikora bağımlı T hücre aracılı sitotoksisite (ADTC) testi. Efektör-hedef (ET) hücre oranı 10:1 idi. (C) Tümörün lezyonlarında tedavi sonrası ve biyolüminesans yoğunluğunun kantitasyonu (a) gün 6 ve (b) gün 18'de altı farklı STEAP1 BsAb formatı ile donanmış Luc (+) T hücrelerinin biyolüminesans görüntülemesi (BLI). Luciferaz transdüslü T hücreleri (Luc (+) T hücreleri), çeşitli formatlarda STEAP1 BsAb (10 μg STEAP1 BsAb / 2 x 107 T hücreleri) ile silahlandırıldı ve EFT PDX'leri (ES15a) taşıyan farelere ek IL-2 (1.000 IU / doz) ile uygulandı ve BLIfollow. Kısaltmalar: EFT = Ewing sarkomu tümör ailesi; PDX'ler = hasta kaynaklı tümör ksenogreftleri; STEAP = prostatın altı transmembran epitel antijeni. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını gösterir. Tümör infiltrasyonu yapan lenfositler, biyolüminesans eğrisi altındaki alan hesaplanarak ölçüldü. Şekilde belirtilen örnekler arasındaki farklar, Tukey'in post hoc testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak istatistiksel anlamlılık açısından test edilmiştir. p < 0.0001. Bu rakam Lin ve ark.10'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

T-BsAb blinatumomab CD19 pozitif hematolojik maligniteler için onaylanmış olsa da, T-BsAbs'nin solid tümörlerde başarılı bir şekilde uygulanmasının çok daha zor olduğu kanıtlanmıştır. Epitel hücre adezyon molekülüne (EPCAM) karşı yönlendirilmiş bir T-BsAb olan Catumaxomab, yumurtalık kanseri hastalarında malign asitlerin tedavisi için onaylandı, ancak ilacın üretimi daha sonra ticari nedenlerle durduruldu19. Katı tümörler için başka hiçbir T-BsAb onaylanmamıştır, bu da bu tür bir tedaviyle ilişkili zorlukların altını çizmektedir. Sitokin salınım sendromuna (CRS) bağlı toksisite yaygın bir sorundur, ancak bu steroidler ve sitokin inhibitörleri ile yönetilebilir. Toksisiteye ek olarak, katı tümörler için T-BsAbs denemelerinde etkinlik eksikliği yaygındır. Tümörde T hücre kaçakçılığını ve kalıcılığını indüklemenin, muhtemelen TME14'teki çeşitli immünosüpresif faktörler nedeniyle zor olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, klinik öncesi bile, in vitro olarak iyi performans gösteren bir T-BsAb'nin tümörleri in vivo olarak etkili bir şekilde tedavi edemediği genellikle belirsizdir.

Bu makalede açıklanan T hücrelerini in vivo olarak gerçek zamanlı olarak izleme yöntemi, çeşitli nedenlerden dolayı araştırmacılar için yararlıdır. T hücresi homing'inin izlenmesi, araştırmacıların T hücresi kaçakçılığının ne zaman başladığını ve T hücrelerinin tedavi sırasında tümörde ne kadar süre kaldığını belirlemelerine izin vererek bazı T-BsAb'ların neden başarılı veya başarısız olduğuna dair mekanik bir bakış açısı sağlar. Yöntem, araştırmacıların birkaç hafta boyunca T hücresi homing'inin kinetiğinin çizilmesine izin veren birden fazla zaman noktasında tekrarlanabilir. ( Şekil 1'deki temsili sonuçlar, T hücrelerinin tümörde en az 28 gün boyunca kaldığını göstermektedir.) Lusiferaz transdüslü T hücrelerinin in vivo görüntülemesi, T hücresi infiltrasyonunun histolojik değerlendirmesi için tedavi sırasında hayvanları kurban etme ihtiyacını da ortadan kaldırarak, deney başına gereken toplam maliyeti ve hayvan sayısını azaltır. Görüntüleme gerektiği sıklıkta tekrarlanabildiğinden, aynı zamanda T hücresi homing kinetiğinin histolojik analize kıyasla çok daha kolay ve daha kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar; bu, farklı zaman noktalarında birden fazla hayvan kurban edilmedikçe esasen tek bir zaman noktasının anlık görüntüsüdür.

Bu yöntemin en kritik adımı, T hücrelerinin lusiferaz yapısı ile başarılı bir şekilde transdüksiyonudur. Başarısız transdüksiyon, T hücresi ölümüne veya in vivo lusiferaz sinyalinin eksikliğine yol açabilir. T hücreleri transdüksiyondan sonra beklendiği gibi genişlemezse, transdüksiyon işleminden kaynaklanan potansiyel toksisiteyi azaltmak için dönüştürüldükleri viral titreyi azaltmak mümkün olabilir. Başka bir yaklaşım, T hücrelerinin daha büyük bir hücre kültürü kabına genişlemeden önce daha akıcı hale gelmesine izin vermek için T hücresi genişleme adımları arasında bir gün daha beklemek olacaktır. T hücrelerini farelere enjekte etmeden önce, akış sitometrisi (TD domates muhabirinin ekspresyonunu kontrol etmek için) veya bir biyolüminesan plaka okuyucu kullanarak transdüksiyon başarısını doğrulamak iyi bir fikirdir. Dönüştürülen T hücreleri biyolüminesan görüntüleme ile hala görülemiyorsa, T hücrelerinin sayısının bu teknik kullanılarak tespit edilemeyecek kadar düşük olması mümkün olabilir. Rabinovich ve ark., bu hassasiyet seviyesini gerektiren durumlarda uygulanabilecek 10 kadar az murin T hücresini tespit etmek için gelişmiş ateşböceği lusiferaz kullanarak benzer bir yöntem tanımlamaktadır20.

Özetle, lusiferaz transdüne T hücrelerinin in vivo takibi, bağışıklık sistemi baskılanmış fare kanser modellerinde T-BsAbs'yi inceleyen araştırmacılar için değerli bir araç sağlar. Yukarıda tartışılan uygulamalara ek olarak, bu T hücresi izleme yöntemi, kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerine uygulanmıştır ve görünüşte evlat edinilen T hücrelerini kullanan sinjenik fare modellerine de uygulanabilir21. Bu stratejinin translasyonel T-BsAbs geliştiren araştırmacılara yardımcı olacağını ve solid tümörlü hastalarda bu tedavilerin başarısının artmasına yol açacağını umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

NKC, Y-mAbs Therapeutics'ten ticari araştırma hibeleri aldığını bildiriyor. NKC, MSK tarafından Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon / Lallemand ve Abpro-labs'a lisanslanan patentlerin mucidi ve sahibidir. MSK ve NKC'nin Y-mAbs'de finansal çıkarları vardır. NKC, Eureka Therapeutics'ten hisse senedi opsiyonları aldığını bildirdi. HFG ve MEC'nin konuyla ilgili herhangi bir açıklaması yoktur.

Acknowledgments

Yazarlar, bu makalenin temsili sonuçlar bölümünde açıklanan deneylerde kullanılan lusiferaz yapılarını paylaştığı için Dr. Vladimir Ponomarev'e teşekkür eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293T cells ATCC CRL-11268
BSA Sigma Aldrich A7030-10G
CD3/CD28 beads Gibco (ThermoFisher) 11161D
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio LUCK-1G
DMEM Gibco (ThermoFisher) 11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet) SignaGen Laboratories SL100688
EDTA Sigma Aldrich E9884-100G
FBS Gibco (ThermoFisher) 10437028
Gag/pol plasmid Addgene 14887
GFP plasmid Addgene 11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin Gibco (ThermoFisher) 15140122
Recombinant human IL-2 R&D Systems 202-IL-010/CF
Retronectin Takara T100B
Trypsin Gibco (ThermoFisher) 25-300-120
VSV-G plasmid Addgene 8454

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gökbuget, N., et al. Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).
  2. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).
  3. Dreier, T., et al. T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct. The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).
  4. Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells. Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).
  5. Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy. Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).
  6. Santich, B. H., et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies. Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).
  7. Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency. Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).
  8. Park, J. A., Cheung, N. V. GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172 (2020).
  9. Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).
  10. Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).
  11. Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).
  12. Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia. Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).
  13. Hoseini, S. S., et al. T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).
  14. Li, H., Er Saw, P., Song, E. Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).
  15. Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
  16. Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).
  17. Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).
  18. Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142 (2021).
  19. Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis. Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).
  21. Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).

Tags

Kanser Araştırmaları Sayı 195 bispesifik antikorlar T hücresi engagerleri lusiferaz T hücreleri ksenogreftler
Luciferaz Dönüştürülmüş İnsan T Hücrelerini Kullanarak Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Kaçakçılığını İzleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F.,… More

Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. K. V. Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells. J. Vis. Exp. (195), e64390, doi:10.3791/64390 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter