Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vitro Spaltningsanalyser ved bruk av rensede rekombinante Drosophila caspases for substratscreening

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64392
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMass Chan Medical School

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å uttrykke og rense rekombinante Drosophila caspases Dronc og Drice, og deres bruk i in vitro cleavage assays.

Abstract

Caspases er svært spesifikke celledødsproteaser som er involvert i apoptotiske og ikke-apoptotiske prosesser. Mens rollen som caspases under apoptose har vært svært godt definert og mange apoptotiske proteolytiske substrater av caspases har blitt identifisert og karakterisert, er rollen som caspases for ikke-apoptotiske prosesser ikke godt forstått. Spesielt har få ikke-apoptotiske substrater av caspases blitt identifisert så langt. Her, for å lette identifisering og karakterisering av potensielle caspase substrater, beskrives en protokoll som tillater testing av kandidatsubstrater i caspase cleavage assays in vitro . Denne protokollen inkluderer produksjon og rensing av rekombinante kaspaseproteiner, produksjon av kandidatsubstratene enten rekombinant eller i et cellefritt ekspresjonssystem, og den faktiske in vitro-spaltningsreaksjonen etterfulgt av SDS-PAGE og immunoblotting. Denne protokollen er skreddersydd for Drosophila caspases Dronc og Drice, men kan enkelt tilpasses for caspases fra andre organismer, inkludert pattedyr.

Introduction

Programmert celledød eller apoptose utføres av en klasse høyt spesialiserte celledødsproteaser kalt caspases (gjennomgått i referanse1). Caspases er Cys proteaser som inneholder en Cys rest i det katalytiske stedet. De har definert konsensus spaltningssteder og spaltesubstrater proteolytisk etter Asp-rester (selv om Drosophila caspase Dronc også er rapportert å spalte etter glurester2). De er delt inn i initiator (også kjent som apikal eller oppstrøms) og effektor (bøddel eller nedstrøms) caspases. Initiator caspases aktivere effektor caspases. For eksempel, hos pattedyr, klipper initiativtakeren Caspase-9 og aktiverer effektoren caspase Caspase-33. På samme måte, i Drosophila melanogaster, klipper caspase-9-ortholog Dronc og aktiverer caspase-3-ortholog Drice 2,4. Under apoptose spalter effektorkaspaser hundrevis av substrater som fører til cellens død5.

Caspases syntetiseres som inaktive proenzymer (zymogener) i cellen. I denne formen inneholder de et N-terminalt prodomain, en stor underenhet med katalytisk Cys i den sentrale delen av proenzymet, og en liten underenhet ved C-enden 1 (figur 1). Aktiveringsmekanismen er forskjellig mellom initiator- og effektorkaspaser. Initiator caspases (Caspase-9, Dronc) krever dimerisering for aktivering, som oppstår ved inkorporering i et stort proteinkompleks, kalt apoptosomet6. For inkorporering i apoptosomet har Caspase-9 og Dronc et caspase aktiverings- og rekrutteringsdomene (CARD) i det N-terminale prodomenet (figur 1). Apoptosomkomponenten Apaf-1 inneholder også et CARD og rekrutterer Caspase-9 eller Dronc via CARD/CARD-interaksjon til apoptosomet 3,6,7. Mens Caspase-9 og Dronc kan behandles proteolytisk i apoptosomet, er denne behandlingen ikke fullt ut nødvendig for enzymatisk aktivitet 8,9.

I motsetning til dette bærer effektor-caspaser (Caspase-3, Drice) ikke et kort i sine prodomener og er ikke innlemmet i store proteinkomplekser for aktivering1. De er avhengige av proteolytisk spaltning av henholdsvis aktiv Caspase-9 eller Dronc1. Den aktive effektoren caspase danner en tetramer sammensatt av to store og to små underenheter, og inneholder dermed to katalytiske steder (figur 1). Viktig for denne protokollen forårsaker rekombinant ekspresjon av caspases i E. coli automatisk behandling og aktivering av caspases, inkludert Drice 10 og Dronc 2,8,9,11,12, selv i fravær av Apaf-1. Denne automatiske behandlingen gjør det mulig å utføre in vitro spaltningsanalyser av kandidatsubstrater med rekombinant caspaseprotein.

Caspases er ikke bare involvert i apoptose, men de kan også ha mange ikke-apoptotiske funksjoner, inkludert spredning, differensiering, cellemigrasjon, nevronbeskjæring, medfødt immunitet og andre13,14,15. Det er foreløpig ukjent hvordan celler kan overleve til tross for at de inneholder aktive caspaser under ikke-apoptotiske prosesser. Det er mulig at disse cellene aktiverer caspases bare ved sub-dødelige nivåer16 eller de sekvestrerer aktive caspases i ikke-apoptotiske rom i cellen som plasmamembranen17,18. Derfor vil identifisering og verifisering av ikke-apoptotiske substrater ikke bare avsløre hvordan caspases formidler ikke-apoptotiske prosesser, men kan også bidra til å forstå hvordan celler kan overleve i nærvær av aktive caspases.

Kandidatproteiner som caspasesubstrater kan identifiseres ved hjelp av genetiske og biokjemiske metoder. Identifiserte proteiner kan kontrolleres for tilstedeværelsen av konsensus Dronc-spaltningssteder. Dette kan gjøres ved å visuelt inspisere proteinsekvensen eller bruke mer sofistikerte online bioinformatiske verktøy som CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/) 19,20. Disse verktøyene bruker de kjente konsensusspaltningsstedene til caspases og strukturelle hensyn for å forutsi nye mål for caspases. Mens CasCleave inkorporerer informasjonen om verifiserte substrater fra humane Caspases-1, -3, -6, -7 og -8, kan det likevel også være nyttig for de formål som er beskrevet her, da disse caspasene og deres konsensusspaltningssteder er godt bevart. Men fordi Dronc-spaltningsstedet ikke er godt definert (to studier identifiserte to forskjellige optimale spaltningssteder, TATD / E2 og LALD9), undersøkes kandidatsubstratene også for tilstedeværelse av andre kaspasespaltningssteder, inkludert Drice.

For å validere de forutsagte substratene til caspases, er det nødvendig med ytterligere analyser. En av disse analysene er demonstrasjonen av at en gitt caspase faktisk kan spalte kandidatproteinet in vitro. Her gir vi en praktisk protokoll for in vitro caspase cleavage assays. Ved hjelp av denne protokollen testes kandidatsubstrater med Dronc som caspase. De kan også testes som substrater av Drice. Selv om denne protokollen er skrevet for Drosophila caspases Dronc og Drice, kan den også tilpasses for caspases fra andre organismer.

Ekstraksjonen og rensingen av Dronc og Drice sammen med in vitro-spaltningsanalysen må utføres samme dag på grunn av tap av katalytisk aktivitet av disse caspasene. Denne protokollen er endret og optimalisert fra tidligere publikasjoner 8,9,11,12,21,22. I denne protokollen uttrykkes fire forskjellige caspaseproteiner rekombinant i E. coli-stammen BL21 (DE3) pLysS. Disse proteinene er: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt og 6xHis-DriceC211A. Hvert av disse proteinene er merket med 6 histidinrester (6xHis) ved N-terminalen for rensing. Dronc wt og Dricewt er villtypeproteinene og kan automatisk behandle inn i den aktive caspasen ved rekombinant ekspresjon. DroncC318A og DriceC211A koder for mutante former av Dronc og Drice som endrer den katalytiske Cys-resten til en Ala-rest. Disse konstruksjonene er katalytisk inaktive og kan ikke automatisk behandle (se figur 2A). De brukes som kontroller i spaltningsanalysen. Fordi DriceC211A ikke kan behandle automatisk, brukes den også som modellsubstrat for Droncwt i in vitro-spaltningsanalysen beskrevet her.

Protocol

1. Rekombinant caspaseuttrykk i bakterier

  1. Klon genet av interesse (Caspase eller antatt substrat) til en bakteriell ekspresjonsvektor med N- og / eller C-terminal tag (er) ved hjelp av standardprotokoller23.
    MERK: Tagger kan øke løseligheten av de rekombinante proteinene og brukes til rensing av de rekombinante proteinene. Her klones Dronc, Drice og deres katalytiske mutanter inn i vektoren pET28a, som gir en N-terminal 6xHis-tag (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-Drice C211A); (for primerinformasjon, se utfyllende tabell 1).
  2. Transformer vektorene med genene av interesse til kompetente BL21 (DE3) pLysS E. coli-celler ved hjelp av standardprosedyrer23,24. Plate transformasjonsblandingen på LB-agarplater med passende antibiotika (kanamycin i tilfelle pET28a) for å velge transformerte bakterier. (Se utfyllende tabell 2.)
  3. Velg en koloni fra platen og inokuler i 5 ml LB-medium som inneholder riktig antibiotika for å vokse over natten ved 37 ° C ved 220 o / min på en ristingsplattform.
  4. Neste dag, lag 30-50 ml (per prøve) LB-medium med antibiotika og tilsett 1 ml av den dyrkede kulturen over natten. Den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) ved bruk av et biofotometer/spektrofotometer bør være mellom 0,1 og 0,2.
  5. Dyrk kulturen ved 37 °C ved 220 o / min på en ristingsplattform til OD600 når 0,6. Sjekk OD600 hver time til den når 0,6. Dette tar omtrent 2 til 3 timer.
  6. For å indusere protein (caspase) ekspresjon, legg IPTG til en endelig konsentrasjon på 0,1-0,2 mM (fortynnet 1: 1000-1: 500 fra IPTG-lager, se tilleggstabell 2).
  7. Dyrk kulturene i 3 timer ved 30 °C ved 220 o/min.
    MERK: Tid og temperatur er avhengig av hva slags protein som uttrykkes og dets oppløselighet. Disse forholdene må kanskje justeres hvis forskjellige caspases eller substrater uttrykkes.
  8. Etter 3 timer, spinn ned kulturene i 50 ml sentrifugerør i 20 minutter ved 4 °C ved 2000 x g. Kast supernatanten og fortsett med pelleten.
    MERK: Protokollen kan stoppes på dette tidspunktet og fortsettes senere. Bakteriepellets kan fryses ved -80 °C.

2. Småskala rekombinant caspases ekstraksjon

  1. Fjern de frosne rørene med pelleterte kulturer fra -80 °C lagring og hold dem på is i 10 minutter for å myke opp pelleten.
  2. Etter 10 minutter tilsettes 0,6 ml bakteriell cellelysebuffer (supplerende tabell 2) supplert med nytilsatte proteasehemmere, 10 mg/ml lysozym og 50 U/ml benzonase i pelletsslangene ved hjelp av en pipettekontroller med en 1 ml serologisk pipette.
  3. Oppløs pelleten med samme pipettespiss ved å pipettere opp og ned til en klar, svakt gul oppløsning uten pelletspartikler er synlig. Inkuber i 30 minutter på is.
  4. Overfør lysatet til passende sentrifugerør og sentrifuger lysatene ved 17 000 x g i 40 minutter ved 4 °C.
  5. Overfør supernatantene til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Dette er råekstraktet som inneholder caspasene.
  6. Hold rørene på is og fortsett for rensing med Ni-NTA agarose.

3. Småskala His-tagged caspases rensing

  1. Tilsett 0,2 ml av 50 % oppslemming av Ni-NTA-agarose til hvert rør av caspaseekstraktene fra trinn 2,5. Roter rørene på en ende-til-ende rotator i 1 time ved 4 °C.
  2. Etter 1 time, tilsett ekstraktet med Ni-NTA-agarose til 1 ml polypropylenkolonner med spissen intakt, plassert i et stativ. La det stå i 5 min.
  3. Etter 5 min, fjern hetten på kolonnene og la supernatanten strømme ut av tyngdekraften.
  4. Tilsett forsiktig 1 ml av vaskebufferen (tilleggstabell 2) til kolonnene uten å forstyrre den pakkede harpiksen av Ni-NTA-agarose og vask den gjennom tyngdekraften.
  5. Utfør vasketrinnet tre ganger.
  6. For eluering av caspasene, plasser 1,5 ml mikrosentrifugerør under oppsamlingsdysen til kolonnene etter fullstendig drenering av vaskebufferen.
  7. Tilsett 0,5 ml av elueringsbufferen (supplert med 1x proteasehemmere umiddelbart før bruk) til hver kolonne og samle eluatet i 1,5 ml mikrosentrifugerørene.
    MERK: Det finrensede eluatet vil være gjennomsiktig i fargen.
  8. Hold eluatene på is og mål konsentrasjonen av proteiner ved Bradford-analyse25. Bekreft renhet/homogenitet av de rensede caspasene ved SDS-PAGE etterfulgt av Coomassie Blue staining26.
    MERK: Utbyttet av en 50 ml LB-kultur varierer mellom 0,5 og 1,5 mg caspaseprotein. Gitt at 0,5 ml elueringsbuffer brukes til eluering, varierer konsentrasjonen fra 1 til 3 mg / ml. Det er viktig å bruke de rensede caspase eluates for in vitro spaltningsanalyser på samme dag med lyse og rensing, da disse caspasepreparatene mister aktivitet over natten.

4. Ekspresjon av det antatte caspasesubstratet i cellefrie ekspresjonssystemer

MERK: I denne protokollen fremstilles Drice, det naturlige substratet til Dronc, både ved rekombinant uttrykk i E. coli (se avsnitt 3 ovenfor) og ved uttrykk i kaninretikulocyttlysat (RRL), et pattedyrcellefritt uttrykkssystem (denne delen, se nedenfor).

  1. Klon genet til det antatte substratet til en ekspresjonsvektor som inneholder enten en T7-, T3- eller SP6-promotor ved hjelp av standardprosedyrer23.
    MERK: I denne protokollen blir DriceC211A brukt som modellsubstrat og ble klonet inn i vektoren pT7CFE1-N-Myc, som bærer en T7-promotor for genuttrykk og merker det antatte proteinsubstratet med en N-terminal Myc-tag for deteksjon ved immunoblotting.
  2. I RRL kan kandidatsubstrater syntetiseres enten radioaktivt eller ikke-radioaktivt.
    1. Ikke-radioaktiv syntese: I et 0,5 ml mikrosentrifugerør tilsettes 25 μL RRL, 2 μL reaksjonsbuffer, 0,5 μL aminosyreblanding -minus leucin (1 mM), 0,5 μL aminosyreblanding-minus metionin (1 mM), 1 μL ribonukleasehemmer (40 U / μL), 2 μL DNA-mal (0,5 μg / μL) og 1 μL T7-RNA-polymerase. Tilsett nukleasefritt vann for å justere det endelige volumet av reaksjonen til 50 μL. Bland komponentene forsiktig ved pipettering eller omrøring med pipettespiss, og spinn ned kort.
      MERK: RRL-lysatet inneholder 100-200 mg / ml av de endogene proteinene. For in vitro translasjonsreaksjoner, legg til RRL ved 50% konsentrasjon (her 25 μL / 50 μL reaksjon).
    2. Radioaktiv syntese: I et 0,5 ml mikrosentrifugerør tilsettes 25 μL RRL-lysat, 2 μL reaksjonsbuffer, 0,5 μL aminosyreblanding-minus metionin (1 mM), 1 μL ribonukleasehemmer (40 U/μL), 2 μL DNA-mal (0,5 μg/μL), 2 μL S35-merket metionin (1000 Ci/mmol ved 10 mCi/ml) og 1 μL T7-RNA-polymerase. Tilsett nukleasefritt vann for å justere det endelige volumet av reaksjonen til 50 μL. Bland komponentene forsiktig ved pipettering eller omrøring med pipettespiss, og spinn ned kort. Kast tips og rør i en beholder for radioaktivt avfall.
      MERK: Ikke tilsett aminosyreblandingen uten leucin. pT7CFE1-vektoren bruker en T7-promotor for proteinuttrykk. Andre vektorer bruker T3- eller SP6-promotorer. I så fall bør T3- eller SP6 RNA-polymeraser brukes i stedet for T7 RNA-polymerase. Forsikre deg om at DNA-malen har høy renhet.
  3. Inkuber reaksjonen ved 30 °C i 90 minutter.
  4. Spinn kort i 10 s og legg rørene på is. Kontroller ekspresjonsnivået til det antatte substratet i RRL ved hjelp av SDS-PAGE og immunoblotting/autoradiografi.
    MERK: Mengden RRL-ekstrakt tilsatt spaltningsreaksjonen bør være basert på mengden protein som kan detekteres ved deteksjonsmetoden (enten immunoblotting eller S35 autoradiografi). Fortsett til in vitro spaltningsanalysen (neste avsnitt) eller oppbevar den ved -80 °C.

5. In vitro spaltningsanalyse med substrater generert med RRL

  1. Ta de antatte substratene som genereres, som beskrevet i avsnitt 4. I denne protokollen brukes N-Myc-DriceC211A som modellsubstrat.
  2. Avhengig av ekspresjonsnivået til det antatte substratet (som skal bestemmes separat ved immunoblot- eller autoradiografianalyse, se trinn 4.4), bruk 1-10 μL av RRL programmert med proteinet av interesse i spaltningsanalysen.
  3. Tilsett 10 μg renset kaspaseprotein generert i avsnitt 1, 2 og 3.
  4. Bring det totale reaksjonsvolumet til 50 μL med caspase assay buffer.
  5. Inkuber reaksjonene i et vannbad ved 30 °C i 3 timer. Sørg for å inkludere de riktige kontrollene i spaltningsanalysen. Her brukes den katalytiske mutanten DroncC318A som kontroll.
  6. Etter 3 timer, stopp reaksjonene ved å overføre rørene på is.
  7. Legg til ett volum LDS-prøvebuffer som inneholder 50 mM DTT. Reaksjonen stoppes helt med tillegg av LDS prøvebuffer.
  8. Inkuber prøvene ved 75 °C i en varmeblokk i 10 minutter.
  9. Spinn raskt, bland ved å bla, last inn 24 μL per prøve og kjør SDS-PAGE (se avsnitt 7) eller lagre prøvene ved -20 °C.

6. In vitro spaltningsanalyse med bakterielt uttrykt rekombinant substratprotein

  1. Tilsett 10 μg renset kandidatsubstrat (her 6xHis-DriceC211A, generert i avsnitt 1, 2 og 3) til et 0,5 ml mikrosentrifugerør.
  2. Tilsett 10 μg av de rensede caspaseproteinene generert i avsnitt 1 og 2. Bring det totale volumet til 50 μL ved å bruke caspase assay buffer.
  3. Følg trinn 5.5 til 5.9.

7. SDS-PAGE og immunoblotting

  1. Last spaltningsreaksjonene (24 μL) på 4% -12% Tris-Glycine eller Bis-Tris gradientgeler (Table of Materials) og utfør proteinelektroforese og immunoblotting (eller autoradiografi hvis du bruker S35-merkede substrater) for å visualisere resultater ved hjelp av standardprosedyrer27,28.
    MERK: Her, i denne protokollen, ble Bis-Tris gradientgeler med Mops kjører buffer og LDS lasting buffer brukt. Generelt kjører de ofte brukte PAGE-protokollene til Tris-Glycine-geler ved hjelp av Tris-Glycine-SDS-kjørebufferen, og SDS-lastebufferen fungerer bra.

Representative Results

Denne protokollen gir trinnvise instruksjoner for caspaseproteininduksjonen i E. coli, rensing av de rekombinante Drosophila caspases Dronc og Drice, syntesen av kandidatsubstrater og in vitro-spaltningsreaksjonen med kandidatsubstrater (her DriceC211A) og caspase Dronc. Den katalytiske mutantenDrice C211A ble brukt som modellsubstrat i denne analysen fordi den ikke har automatisk prosesseringsaktivitet (figur 2A) og forblir i full lengde til den spaltes av Droncvekt. DriceC211A skal alltid brukes som en positiv kontroll for å validere at Droncwt-preparatet har enzymatisk aktivitet.

Figur 2A gir et representativt eksempel på uttrykk og rensing av rekombinante caspaser. Fire forskjellige rekombinante caspases ble indusert og renset: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt og 6xHis-DriceC211A. De rensede caspasene ble drevet av SDS-PAGE, immunoblotted, og flekken ble undersøkt med et anti-Hans antistoff (fortynnet 1:5,000; etterfulgt av anti-mus IgG, HRP-koblet antistoff (1:10,000)). Den ubehandlede 6xHis-Dronc (proDronc) kjører med en relativ molekylvekt (MW r) på 55 kDa (lane 2) og ubehandlet 6xHis-Drice (proDrice) har en MWr på 35 kDa (lane 4). Autoprosessering av caspasene er synlig ved utseendet til bånd med mindre MWr som på grunn av tilstedeværelsen av His-taggen ved N-enden representerer de store underenhetene til caspasene (figur 1). For 6x-Dronc har den store underenheten en MWr på 40 kDa (kjørefelt 1). Den store underenheten til 6x-Drice kjører på 23 kDa (bane 3). De katalytiske mutantene 6xHis-DroncC318A og 6xHis-DriceC211A klarer ikke å autoprosessere og kan bare påvises som proteiner i full lengde (bane 2 og 4).

Figur 2B For å demonstrere at det bakterielt produserte og rensede 6xHis-Droncwt-preparatet har enzymatisk aktivitet, ble det utført en in vitro spaltningsanalyse som beskrevet i denne protokollen. Som negativ kontroll ble den katalytiske mutanten 6xHis-DroncC318A brukt. Underlaget var RRL-generert N-Myc-DriceC211A, som er merket med en Myc-tag ved N-terminalen. Etter in vitro-spaltningsreaksjonen ble proteinene separert av SDS-PAGE, immunblottet og flekkene ble inkubert med et anti-MYC-antistoff (fortynnet 1:1,000) etterfulgt av anti-mus IgG, HRP-bundet antistoff (1:10,000)) for å oppdage N-Myc-DriceC211A. Vellykket spaltning og dermed enzymatisk aktivitet av caspasen kan demonstreres ved utseendet av minst ett bånd av mindre MWr sammenlignet med substratets fulllengdede, ubehandlede form. Ubehandlet, full lengde N-Myc-Drice C211A har en MWr på 40 kDa (baner 2 og 4), mens den store underenheten av behandlet N-Myc-DriceC211A kjører på 30 kDa (lane 3). Lane 1 representerer det uprogrammerte RRL-lysatet (ingen plasmid/transkripsjon tilføyd). Lane 2 demonstrerer in vitro-produksjon av DriceC211A ved RRL-uttrykk. Lane 3 inneholder in vitro-spaltningsreaksjonen med 6xHis-Droncwt. Lane 4 inneholder in vitro-spaltningsreaksjonen med 6xHis-DroncC318A.

Figur 2C En in vitro spaltningsreaksjon som bruker både rekombinant og renset caspase (6xHis-Droncwt og 6x-His-DroncC318A) og substrat (6xHis-DriceC211A) i henhold til denne protokollen, ble analysert av SDS-PAGE og immunoblot. For analyse av spaltningsreaksjonen ble det anti-spaltede Drice-antistoffet (fortynnet 1: 5000, etterfulgt av anti-kanin IgG, HRP-bundet antistoff (1: 10 000)) brukt i denne immunobloten. Det anti-spaltede Drice-antistoffet oppdager sin neo-epitop i den store underenheten (23 kDa) av 6xHis-DriceC211A først etter behandling av 6xHis-Droncwt (lane 1). Den katalytiske mutanten 6xHis-DroncC318A er ikke i stand til å behandle 6xHis-Drice C211A i denne analysen, og full lengde 6xHis-DriceC211A fremstår som svakt ubehandlet bånd på 35 kDa (bane 2).

Figure 1
Figur 1: Domenestrukturen til initiatorkaspasene Caspase-9 og Dronc og effektorkaspasene Caspase-3 og Drice. CARD - caspase aktivering og rekruttering domene; Cys - relativ plassering av den katalytiske Cysteinresten; L - stor underenhet; S - liten underenhet. Plasseringen av N-terminale prodomener er angitt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative resultater. (A) Immunoblotanalyse av rensede rekombinante 6xHis-Dronc og 6xHis-Drice preparater, undersøkt med et anti-His antistoff. Ubehandlet (proDronc og proDrice) og spaltet 6xHis-Dronc og 6xHis-Drice er indikert med piler. MW-markører er angitt til venstre. (B) Immunoblotanalyse av in vitro spaltningsreaksjon av RRL-generert N-Myc-Drice med caspases 6xHis-Droncwt (lane 3) eller 6x-His-DroncC318A (lane 4) undersøkt med et anti-Myc antistoff. Uprogrammerte og programmerte (N-Myc-DriceC211A) RRL-reaksjoner lastes og separeres i bane 1 og 2. Ubehandlet (proDrice) og spaltet N-Myc-Drice er indikert med piler. MW-markører er angitt til venstre. (C) Immunoblotanalyse av in vitro spaltningsreaksjon av bakterielt uttrykt og renset rekombinant 6xHis-Drice C211A med caspases 6xHis-Droncwt (lane 1) eller 6x-His-DroncC318A (lane 2), undersøkt med et anti-spaltet Drice antistoff. Full lengde (proDrice) og spaltet 6xHis-DriceC211A er indikert med piler. MW-markører er angitt til venstre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende tabell 1: Denne tabellen inneholder primere som brukes til kloning i pET28a vektor. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 2: Denne tabellen inneholder sammensetningen av buffere og medier. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Hovedtyngden av vår kunnskap om caspases og caspase funksjon har kommet fra intenst arbeid i apoptose i løpet av de siste tre tiårene. Det er meget godt etablert at initiator caspases proteolytisk behandler effektorkaspaser, og hundrevis av proteiner har blitt identifisert som effektorkaspasesubstrater under apoptose 5,29. I motsetning til dette er mye mindre kjent om funksjonen av caspases for ikke-apoptotiske prosesser og hvilke ikke-apoptotiske substrater de behandler. Det kan tenkes at initiativtaker-caspases er sentrale beslutningstakere her. Under apoptose aktiverer de effektorkaspaser som forårsaker celledød. For å utløse ikke-apoptotiske prosesser kan de imidlertid aktivere forskjellige proteiner (annet enn effektorkasser), som styrer den ikke-apoptotiske prosessen. Denne protokollen tester kandidatproteiner som substrater av initiatoren caspase Dronc i Drosophila 17,30.

Substratene som skal testes i spaltningsanalysen kan produseres enten i et in vitro pattedyrcellefritt uttrykkssystem som RRL eller ved rekombinant uttrykk i E. coli. Det er flere fordeler ved in vitro-uttrykk ved bruk av RRL fremfor bakterieuttrykk. RRL-uttrykksprotokollen er enkel og rask, slik at mange forskjellige underlag kan fremstilles parallelt. I mange tilfeller kan RRL-ekstraktet som inneholder proteinet av interesse lagres ved -80 ° C før bruk i spaltningsanalysen (selv om dette må bestemmes separat for hvert substrat). Det antatte substratet kan merkes med S35-Met, noe som gjør det enkelt å analysere ved autoradiografi etter SDS-PAGE. Det er spesielt nyttig hvis det ikke finnes noe substratspesifikt antistoff. Alternativt, hvis S35-Met-merking ikke er ønsket, kan det antatte substratet merkes med vanlige koder som Flag, HA eller Myc-koder, noe som gjør det mulig å oppdage caspase-spaltning ved immunoblotting.

Det må sterkt understrekes at suksessen til denne protokollen avhenger av forsiktig og konsekvent rensing av de rekombinante Dronc- og Drice-proteinene. Dessverre kan disse proteinene ikke lagres - ikke engang kortsiktig - verken i kjøleskapet eller frosset. De mister den enzymatiske aktiviteten over natten i en hvilken som helst lagret form. Derfor må de tilberedes ferskt på dagen for spaltningsanalysen. Uansett hvilke kandidatprotein(er) som testes, bør DriceC211A alltid brukes som en positiv kontroll for å validere den enzymatiske aktiviteten til Droncwt-preparatet (se figur 2B,C). Alternativt kan aktiviteten til Dronc- og Drice-preparatene også testes ved in vitro-spaltning av fluorogene syntetiske tetrapeptidsubstrater 2,9,31.

Hvis antistoffer brukes til å oppdage kandidatsubstratene, må de valideres av brukeren32,33. Det gjelder også kommersielt tilgjengelige antistoffer som oppdager epitopmerker som Flag, HA, Myc eller andre. Dårlig antistoffkvalitet kan skjule viktige resultater. Dobbelt-epitop-merking av kandidatsubstratene på både N- og C-terminalen med forskjellige tagger anbefales også34. Hvis spalting oppstår, bidrar dobbeltmerking til å spore begge spaltningsproduktene og kan bidra til å belyse hvis spalting skjer på ett eller flere steder.

Selv om denne protokollen enkelt validerer det kjente biologiske substratet til Dronc, Drice, er det også begrensninger. En begrensning er at dette er en in vitro-protokoll med rekombinante proteiner. I disse analysene er caspasene tilstede ved en ufysiologisk høy konsentrasjon, noe som fremgår av observasjonen at de spontant kan autoprosessere i E. coli. Den spontane autoprosesseringen skjer vanligvis ikke under de fysiologiske forholdene. Denne høye caspasekonsentrasjonen kan forårsake falsk aktivitet som resulterer i falske positiver. Falske positiver kan elimineres ved å senke caspasekonsentrasjonen i in vitro-spaltningsreaksjonen. Videre, som beskrevet mer detaljert nedenfor, er det nødvendig med ytterligere analyser for å bekrefte ekte substrater og for å eliminere falske positiver.

De rekombinante caspasene har kanskje ikke samme spesifisitet som de har i sitt normale cellulære miljø in vivo. For eksempel kan aktiviteten til caspases modifiseres ved posttranslasjonelle modifikasjoner. Disse er ikke tilstede på de rekombinante proteinene. Videre inkorporeres initiatorkaspaser, inkludert Dronc, in vivo, i store proteinkomplekser som apoptosomet. Under betingelsene i denne protokollen oppnås ikke dannelsen av apoptosomet. Det ville kreve rekombinant uttrykk for Drosophila Apaf-1 (aka Dark eller Hac-1) 35-37 som har egne utfordringer. Derfor, in vitro, kan Dronc ikke ha samme spesifisitet som den har in vivo.

Det kan også tenkes at Dronc er inkorporert i et annet proteinkompleks for ikke-apoptotiske prosesser. Dette kan gi en annen spaltningsspesifisitet til Dronc, noe som også kan forklare hvorfor Dronc ikke induserer apoptose under ikke-apoptotiske forhold. Relatert til dette bruker CasCleave de kjente spaltningskonsensusstedene for å forutsi nye caspasesubstrater. Det er imidlertid ukjent om de samme spaltningskonsensusstedene også brukes til ikke-apoptotiske prosesser. Faktisk ble det nylig vist at Caspase-3 endrer sitt foretrukne konsensussted under en ikke-apoptotisk prosess i den utviklende auditive hjernestammen i kyllingembryoet38. På samme måte, hvis initiator-caspaser inkorporeres i forskjellige proteinkomplekser, kan de ha en annen spesifisitet og kan dermed spalte ved forskjellige konsensussekvenser.

Disse begrensningene illustrerer at det ikke er tilstrekkelig å bare stole på in vitro-spaltningsanalysene som er beskrevet i denne protokollen. Alternative tilnærminger bør benyttes for ytterligere å validere resultatene oppnådd ved hjelp av denne protokollen. Ideelt sett bør in vivo-analyser brukes til å ta opp følgende spørsmål: Behandles kandidatproteinet proteolytisk under den ikke-apoptotiske prosessen in vivo? Hvis ja, er det samme spaltningsstedet brukt in vivo og in vitro? Hva er konsekvensen hvis spaltningen er blokkert av mutagenese av spaltningsstedet? Er behandlingen av kandidatsubstratet avhengig av caspases, og i så fall hvilken? Hva er rollen til spaltningsfragmentene for den ikke-apoptotiske prosessen? Disse spørsmålene kan enkelt løses i de genetiske modellorganismer som C. elegans og Drosophila ved hjelp av standard genetiske og transgene metoder.

Oppsummert beskriver denne protokollen en pålitelig og konsistent metode for å produsere enzymatisk aktive caspases, spesielt Drosophila caspases Dronc og Drice. Det endelige målet med denne protokollen er å undersøke om Dronc kan spalte kandidatsubstrater in vitro, som ble identifisert ved genetiske, biokjemiske eller bioinformatiske tilnærminger. Som forklart i forrige avsnitt, er det nødvendig med ytterligere analyser for å validere disse proteinene som caspase substrater in vivo. Gitt graden av bevaring av caspase gener over metazoa, bør det være mulig å tilpasse denne protokollen til caspases fra andre organismer også.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Elif Kamber-Kaya for hennes hjelp til å etablere protokollen i laboratoriet. Dr. Guy Salvesen ga vennlig DriceC211A mutant9. Dette arbeidet ble finansiert av en MIRA-pris fra National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) fra National Institutes of Health (NIH) under tilskuddsnummer 2R35GM118330. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Fisher BP1760-25
Anti-His antibody Sigma-Aldrich MA1-21315
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7076P2
Anti-Myc antibody Santa Cruz Biotechnology sc-40
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7074P2
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5415 R
Benzonase Sigma-Aldrich E1014-5KU
BioPhotometer Eppendorf #6131
BL21 (DE3) pLysS Competent Cells Promega L1195
Centrifuge rotor Beckman Coulter JA-25.50
CHAPS  Sigma-Aldrich C3023-1G
ChemiDoc with image software Bio-Rad Universal Hood II For Chemiluminiscence imaging
Chemiluminiscence Substrate Thermofisher Scientific 34095 For Chemiluminiscence imaging
Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody Cell Signaling Technology 9478S
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14955128 Used to measure bacterial growth and protein concentration
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad #1610610
Erlenmeyer flasks, 1000 mL Millipore sigma CLS49801L For LB agar media preparation and autoclaving
Erlenmeyer flasks, 250 mL Millipore sigma CLS4980250 For bacterial culture growth and induction.
Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Gel extraction kit Qiagen 28704
Gel tank SDS-PAGE system Thermofisher Scientific STM1001
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermofisher scientific 87786
HEPES Sigma-Aldrich H3375
His-Drice-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DriceC211A-pET28a  This study N/A Available from authors
His-Dronc-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DroncC318A-pET28a  This study N/A Available from authors
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-100G
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermofisher Scientific FERR0392
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5
LB Agar, Miller (Powder) Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Thermofisher Scientific 90082
Microbiological plate incubator Fisher Scientific 11-690-650D For colony growth after transformation
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL Eppendorf 22363611
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363204
Midiprep kit Qiagen 12243
Mini tube rotator Fisher Scientific 05-450-127 for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose
Miniprep kit Qiagen 27106
Motorized Pipette Controller Gilson F110120 For using serological pipettes
NaH2PO4 Fisher Scientific BP330-1
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well Thermofisher Scientific WG1402BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermofisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) Thermofisher Scientific NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Invitrogen NP00061
Orbital shaking incubator with temperature control New Brunswick Scientific C25 incubator shaker
Petridish 100 mm x 15 mm Fisher Scientific FB0875712
Plating beads Zymo research S1001 For spreading culture on AmpR/KanR plates
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen 34924 For purification of His-tagged proteins
Precision Plus Protein Standards Bio-Rad #161-0374
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
pT7CFE1-NMyc Thermofisher Scientific 88863 For cloning substrates for RRL expression
PVDF membrane Invitrogen LC2007
14 mL Polypropylene round bottom tubes Fisher Scientific 352029 For growing plasmid cultures
QiaRack Qiagen 19095 For holding polypropylene columns during purification
Refrigerated High speed Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25
rRNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N251A For RRL expression
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Sterile Falcon tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-527-90
Sterile Falcon tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-959-49A
Sucrose Sigma-Aldrich S70903-250G
1 mL Serological Pipets, Sterile celltreat 229001B For bacterial cell lysis in 50 mL tubes
TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 Promega L4611
Tris-base Fisher Scientific BP154-1
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Waterbath Fisher Scientific 2340
Western wet transferring cassette Thermofisher Scientific STM2001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumar, S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 32-43 (2007).
  2. Hawkins, C. J., et al. The Drosophila caspase DRONC cleaves following glutamate or aspartate and is regulated by DIAP1, HID, and GRIM. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 27084-27093 (2000).
  3. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
  4. Meier, P., Silke, J., Leevers, S. J., Evan, G. I. The Drosophila caspase DRONC is regulated by DIAP1. EMBO Journal. 19 (4), 598-611 (2000).
  5. Timmer, J. C., Salvesen, G. S. Caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 66-72 (2007).
  6. Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11549-11556 (1999).
  7. Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., Wang, X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell. 90 (3), 405-413 (1997).
  8. Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 8359-8362 (1999).
  9. Snipas, S. J., Drag, M., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Activation mechanism and substrate specificity of the Drosophila initiator caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (5), 938-945 (2008).
  10. Fraser, A. G., Evan, G. I. Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE. EMBO Journal. 16 (10), 2805-2813 (1997).
  11. Denton, D., Mills, K., Kumar, S. Methods and protocols for studying cell death in Drosophila. Methods in Enzymology. 446, 17-37 (2008).
  12. Dorstyn, L., Kumar, S. A biochemical analysis of the activation of the Drosophila caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (3), 461-470 (2008).
  13. Aram, L., Yacobi-Sharon, K., Arama, E. CDPs: caspase-dependent non-lethal cellular processes. Cell Death and Differentiation. 24 (8), 1307-1310 (2017).
  14. Arama, E., Baena-Lopez, L. A., Fearnhead, H. O. Non-lethal message from the Holy Land: The first international conference on nonapoptotic roles of apoptotic proteins. FEBS Journal. 288 (7), 2166-2183 (2021).
  15. Baena-Lopez, L. A. All about the caspase-dependent functions without cell death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 77-78 (2018).
  16. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. Journal of Cell Biology. 196 (4), 513-527 (2012).
  17. Amcheslavsky, A., et al. Plasma membrane localization of apoptotic caspases for non-apoptotic functions. Developmental Cell. 45 (4), 450-464 (2018).
  18. Bergmann, A. Are membranes non-apoptotic compartments for apoptotic caspases. Oncotarget. 9 (60), 31566-31567 (2018).
  19. Song, J., et al. Cascleave: towards more accurate prediction of caspase substrate cleavage sites. Bioinformatics. 26 (6), 752-760 (2010).
  20. Wang, M., et al. Cascleave 2.0, a new approach for predicting caspase and granzyme cleavage targets. Bioinformatics. 30 (1), 71-80 (2014).
  21. Kamber Kaya, H. E., Ditzel, M., Meier, P., Bergmann, A. An inhibitory mono-ubiquitylation of the Drosophila initiator caspase Dronc functions in both apoptotic and non-apoptotic pathways. PLoS Genetics. 13 (2), 1006438 (2017).
  22. Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Caspases: preparation and characterization. Methods. 17 (4), 313-319 (1999).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  26. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  27. Hirano, S. Western blot analysis. Methods in Molecular Biology. 926, 87-97 (2012).
  28. Kim, B. Western blot techniques. Methods in Molecular Biology. 1606, 133-139 (2017).
  29. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
  30. Fogarty, C. E., et al. Extracellular reactive oxygen species drive apoptosis-induced proliferation via Drosophila macrophages. Current Biology. 26 (5), 575-584 (2016).
  31. Song, Z., et al. Biochemical and genetic interactions between Drosophila caspases and the proapoptotic genes rpr, hid, and grim. Molecular and Cellular Biology. 20 (8), 2907-2914 (2000).
  32. Edfors, F., et al. Enhanced validation of antibodies for research applications. Nature Communications. 9 (1), 4130 (2018).
  33. Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
  34. Brizzard, B. Epitope tagging. Biotechniques. 44 (5), 693-695 (2008).
  35. Kanuka, H., et al. Control of the cell death pathway by Dapaf-1, a Drosophila Apaf-1/CED-4-related caspase activator. Molecular Cell. 4 (5), 757-769 (1999).
  36. Rodriguez, A., et al. Dark is a Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved death pathway. Nature Cell Biology. 1 (5), 272-279 (1999).
  37. Zhou, L., Song, Z., Tittel, J., Steller, H. HAC-1, a Drosophila homolog of APAF-1 and CED-4 functions in developmental and radiation-induced apoptosis. Molecular Cell. 4 (5), 745-755 (1999).
  38. Weghorst, F., Mirzakhanyan, Y., Hernandez, K. L., Gershon, P. D., Cramer, K. S. Non-Apoptotic caspase activity preferentially targets a novel consensus sequence associated with cytoskeletal proteins in the developing auditory brainstem. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844844 (2022).

Tags

Bioteknologi utgave 188
<em>In vitro</em> Spaltningsanalyser ved bruk av rensede rekombinante <em>Drosophila</em> caspases for substratscreening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yarikipati, P., Bergmann, A. In… More

Yarikipati, P., Bergmann, A. In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening. J. Vis. Exp. (188), e64392, doi:10.3791/64392 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter