Affinità cellulare dell'emulsione stabilizzata dalle particelle per aumentare l'internalizzazione dell'antigene
Summary
Per progettare razionalmente adiuvanti efficienti, abbiamo sviluppato l’emulsione Pickering stabilizzata con nanoparticelle di acido polilattico e co-glicolico (PNPE). Il PNPE possedeva una morbidezza unica e un’interfaccia idrofobica per un potente contatto cellulare e offriva un carico di antigene ad alto contenuto, migliorando l’affinità cellulare del sistema di consegna alle cellule presentanti l’antigene e inducendo un’internalizzazione efficiente degli antigeni.
Abstract
L’affinità cellulare delle micro / nanoparticelle è la precondizione per il riconoscimento cellulare, l’assorbimento cellulare e l’attivazione, che sono essenziali per la somministrazione di farmaci e la risposta immunitaria. Il presente studio è nato dall’osservazione che gli effetti della carica, delle dimensioni e della forma delle particelle solide sull’affinità cellulare sono solitamente considerati, ma raramente ci rendiamo conto del ruolo essenziale della morbidezza, del fenomeno di ristrutturazione dinamica e della complessa interazione di interfaccia nell’affinità cellulare. Qui, abbiamo sviluppato l’emulsione Pickering stabilizzata con nanoparticelle (PLGA) con acido poli-lattico-co-glicolico (PLGA) che ha superato le carenze delle forme rigide e simulato la flessibilità e la fluidità dei patogeni. È stato messo a punto un metodo per testare l’affinità del PNPE con le superfici cellulari ed elaborare la successiva internalizzazione da parte delle cellule immunitarie. L’affinità del PNPE con le vescicole extracellulari bio-mimetiche (bEV) – la sostituzione delle cellule dendritiche del midollo osseo (BMDC) – è stata determinata utilizzando una microbilancia a cristalli di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D), che ha permesso il monitoraggio in tempo reale dell’adesione dell’emulsione cellulare. Successivamente, il PNPE è stato utilizzato per fornire l’antigene (ovalbumina, OVA) e l’assorbimento degli antigeni da parte dei BMDC è stato osservato utilizzando il microscopio a scansione laser confocale (CLSM). Risultati rappresentativi hanno mostrato che il PNPE ha immediatamente diminuito la frequenza (ΔF) quando ha incontrato i bEV, indicando una rapida adesione e un’alta affinità del PNPE ai BMDC. PNPE ha mostrato un legame significativamente più forte alla membrana cellulare rispetto alle microparticelle PLGA (PMP) e all’adiuvante AddaVax (indicato come nano-emulsione stabilizzata con tensioattivo [SSE]). Inoltre, a causa della maggiore affinità cellulare con gli immunociti attraverso cambiamenti di curvatura dinamica e diffusioni laterali, l’assorbimento dell’antigene è stato successivamente potenziato rispetto alle PMP e all’ESS. Questo protocollo fornisce approfondimenti per la progettazione di nuove formulazioni con elevata affinità cellulare e internalizzazione efficiente dell’antigene, fornendo una piattaforma per lo sviluppo di vaccini efficienti.
Introduction
Per combattere le malattie epidemiche, croniche e infettive, è imperativo sviluppare coadiuvanti efficaci per le vaccinazioni profilattiche e terapeutiche 1,2. Idealmente, gli adiuvanti dovrebbero possedere un’eccellente sicurezza e attivazione immunitaria 3,4,5. Si ritiene che l’assorbimento e il processo efficaci degli antigeni da parte delle cellule presentanti l’antigene (APC) siano una fase essenziale nelle cascate di segnalazione a valle e nell’inizio della risposta immunitaria 6,7,8. Quindi, acquisire una chiara comprensione del meccanismo di interazione delle cellule immunitarie con gli antigeni e progettare adiuvanti per migliorare l’internalizzazione sono strategie efficienti per migliorare l’efficienza dei vaccini.
Le micro-/nanoparticelle con proprietà uniche sono state precedentemente studiate come sistemi di rilascio dell’antigene per mediare l’assorbimento cellulare degli antigeni e l’interazione cellulare con i pattern molecolari associati ai patogeni 9,10. Al contatto con le cellule, i sistemi di consegna iniziano a interagire con la matrice extracellulare e la membrana cellulare, che ha portato all’internalizzazione e alle successive risposte cellulari11,12. Studi precedenti hanno portato alla luce che l’internalizzazione delle particelle avviene attraverso l’adesione membrana cellulare-particella13, seguita da deformazione flessibile della membrana cellulare e diffusione del recettore alla membrana superficiale14,15. In queste circostanze, le proprietà del sistema di consegna dipendono dall’affinità con gli APC, che successivamente influenzano la quantità di assorbimento16,17.
Per ottenere informazioni sulla progettazione del sistema di consegna per migliorare la risposta immunitaria, ampi sforzi sono stati concentrati sullo studio della relazione tra le proprietà delle particelle e l’assorbimento cellulare. Il presente studio è scaturito dall’osservazione che le micro-/nanoparticelle solide con varie cariche, dimensioni e forme sono spesso studiate in questa luce, mentre il ruolo della fluidità nell’internalizzazione dell’antigene è raramente studiato18,19. Infatti, durante l’adesione, le particelle morbide hanno dimostrato cambiamenti dinamici di curvatura e diffusioni laterali per aumentare l’area di contatto per interazioni multivalenti, difficilmente replicabili dalle particelle solide20,21. Inoltre, le membrane cellulari sono doppi strati fosfolipidi (sfingolipidi o colesterolo) nel sito di assorbimento e le sostanze idrofobiche possono alterare l’entropia conformazionale dei lipidi, riducendo la quantità di energia richiesta per l’assorbimento cellulare22,23. Pertanto, amplificare la mobilità e promuovere l’idrofobicità del sistema di consegna può essere una strategia efficace per rafforzare l’internalizzazione dell’antigene per migliorare la risposta immunitaria.
L’emulsione pickering, stabilizzata da particelle solide assemblate all’interfaccia tra due liquidi immiscibili, è stata ampiamente utilizzata in campo biologico24,25. Infatti, le particelle aggreganti sull’interfaccia olio/acqua determinano la formulazione di strutture multilivello, che promuovono interazioni multi-livello sistema di somministrazione-cellulare e inducono ulteriormente proprietà fisiochimiche multifunzionali nella somministrazione di farmaci. A causa della loro deformabilità e mobilità laterale, ci si aspettava che le emulsioni di Pickering entrassero in interazione cellulare multivalente con gli immunociti e fossero riconosciute dalle proteine di membrana26. Inoltre, poiché i nuclei di micelle oleose nelle emulsioni Pickering non sono completamente ricoperti di particelle solide, le emulsioni Pickering presentano spazi di diverse dimensioni tra le particelle sull’interfaccia olio/acqua, che causano una maggiore idrofobicità. Pertanto, è fondamentale esplorare l’affinità delle emulsioni di Pickering con le APC ed elaborare la successiva internalizzazione per sviluppare adiuvanti efficienti.
Sulla base di queste considerazioni, abbiamo progettato un’emulsione di Pickering stabilizzata con nanoparticelle PLGA (PNPE) come sistema di somministrazione del vaccino a fluidità che ha anche contribuito a ottenere preziose informazioni sull’affinità del PNPE con i BMDC e sull’internalizzazione cellulare. L’adesione in tempo reale delle vescicole extracellulari bio-mimetiche (bEV; una sostituzione dei BMDC) al PNPE è stata monitorata tramite un metodo label-free utilizzando una microbilancia a cristalli di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D). Dopo la caratterizzazione dell’affinità di PNPE con BMDC, è stata utilizzata la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) per determinare l’assorbimento dell’antigene. Il risultato ha indicato la maggiore affinità di PNPE con le BMDC e l’efficiente internalizzazione dell’antigene. Abbiamo anticipato che il PNPE avrebbe mostrato una maggiore affinità con le APC, che potrebbero stimolare meglio l’internalizzazione degli antigeni per migliorare le risposte immunitarie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato un’emulsione olio/acqua stabilizzata con nanoparticelle PLGA come sistema di rilascio per una maggiore internalizzazione dell’antigene. Il PNPE preparato possedeva una superficie densamente imballata per supportare il punto di atterraggio e una morbidezza e fluidità uniche per un potente contatto cellulare con la membrana cellulare immunitaria. Inoltre, l’interfaccia olio/acqua offriva un carico di antigene ad alto contenuto e il PLGA anfifilico conferiva al PNPE un’elevata stabilità per il trasporto…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal progetto sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), From 0 to 1 Original Innovation Project of Basic Frontier Scientific Research Program of Chinese Academy of Sciences (ZDBS-LY-SLH040), la Fondazione per i gruppi di ricerca innovativi della National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21821005).
Materials
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
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