Afinidade celular da emulsão estabilizada por partículas para aumentar a internalização de antígenos
Summary
Para projetar racionalmente adjuvantes eficientes, desenvolvemos emulsão de Pickering estabilizada por nanopartículas poli-láticas-co-glicólicas (PNPE). O PNPE possuía maciez única e uma interface hidrofóbica para contato celular potente e oferecia carga de antígenos de alto conteúdo, melhorando a afinidade celular do sistema de entrega às células apresentadoras de antígenos e induzindo a internalização eficiente de antígenos.
Abstract
A afinidade celular das micro-/nanopartículas é a pré-condição para o reconhecimento celular, absorção celular e ativação, que são essenciais para a entrega de medicamentos e resposta imune. O presente estudo resultou da observação de que os efeitos da carga, tamanho e forma de partículas sólidas sobre a afinidade celular são geralmente considerados, mas raramente percebemos o papel essencial da suavidade, do fenômeno de reestruturação dinâmica e da interação de interface complexa na afinidade celular. Aqui, desenvolvemos a emulsão de Pickering estabilizada por nanopartículas poli-lática-co-glicólica (PLGA) que superou as deficiências de formas rígidas e simulou a flexibilidade e fluidez de patógenos. Um método foi criado para testar a afinidade do PNPE com as superfícies celulares e elaborar a subsequente internalização por células imunes. A afinidade do PNPE com vesículas extracelulares biomiméticas (bEVs) – substitutas das células dendríticas da medula óssea (BMDCs) – foi determinada por meio de um microequilíbrio de cristal de quartzo com monitoramento de dissipação (QCM-D), que permitiu o monitoramento em tempo real da adesão célula-emulsão. Posteriormente, o PNPE foi utilizado para a entrega do antígeno (ovalbumina, OVA) e a captação dos antígenos pelos BMDCs foi observada por meio de microscópio confocal de varredura a laser (CLSM). Resultados representativos mostraram que o PNPE diminuiu imediatamente a frequência (ΔF) quando encontrou os bEVs, indicando rápida adesão e alta afinidade do PNPE aos BMDCs. PNPE mostrou ligação significativamente mais forte à membrana celular do que as micropartículas PLGA (PMPs) e Adjuvante AddaVax (denotado como nanoemulsão estabilizada por surfactante [SSE]). Além disso, devido à maior afinidade celular com os imunócitos através de alterações dinâmicas de curvatura e difusões laterais, a captação de antígenos foi subsequentemente aumentada em comparação com PMPs e SSE. Este protocolo fornece insights para o projeto de novas formulações com alta afinidade celular e internalização eficiente de antígenos, fornecendo uma plataforma para o desenvolvimento de vacinas eficientes.
Introduction
Para combater doenças epidêmicas, crônicas e infecciosas, é imprescindível o desenvolvimento de adjuvantes eficazes para a vacinação profilática e terapêutica 1,2. Idealmente, os adjuvantes devem possuir excelente segurança e ativação imunológica 3,4,5. Acredita-se que a captação e o processo efetivos de antígenos por células apresentadoras de antígenos (APCs) sejam um estágio essencial nas cascatas de sinalização a jusante e no início da resposta imune 6,7,8. Assim, obter uma compreensão clara do mecanismo de interação das células imunes com antígenos e projetar adjuvantes para melhorar a internalização são estratégias eficientes para aumentar a eficiência das vacinas.
Micro/nanopartículas com propriedades únicas têm sido previamente investigadas como sistemas de liberação de antígenos para mediar a captação celular de antígenos e a interação celular com padrões moleculares associados a patógenos 9,10. Ao entrar em contato com as células, os sistemas de liberação passam a interagir com a matriz extracelular e a membrana celular, o que levou à internalização e subsequentes respostas celulares11,12. Estudos prévios trouxeram à tona que a internalização de partículas ocorre por meio da adesão membrana celular-partícula13, seguida de deformação flexível da membrana celular e difusão do receptor para a membrana superficial14,15. Nessas circunstâncias, as propriedades do sistema de entrega dependem da afinidade com as APCs, que posteriormente afetam a quantidade de captação16,17.
Para obter insights sobre o design do sistema de entrega para melhorar a resposta imune, esforços extensivos têm se concentrado na investigação da relação entre as propriedades das partículas e a absorção celular. O presente estudo decorreu da observação de que micro/nanopartículas sólidas com várias cargas, tamanhos e formas são frequentemente estudadas sob essa luz, enquanto o papel da fluidez na internalização de antígenos é pouco investigado18,19. De fato, durante a adesão, as partículas moles demonstraram mudanças dinâmicas de curvatura e difusões laterais para aumentar a área de contato para interações multivalentes, que dificilmente podem ser replicadas pelas partículas sólidas20,21. Além disso, as membranas celulares são bicamadas fosfolipídicas (esfingolípidos ou colesterol) no local da absorção, e substâncias hidrofóbicas podem alterar a entropia conformacional dos lipídios, reduzindo a quantidade de energia necessária para a captação celular22,23. Assim, amplificar a mobilidade e promover a hidrofobicidade do sistema de entrega pode ser uma estratégia eficaz para fortalecer a internalização do antígeno para melhorar a resposta imune.
A emulsão pickering, estabilizada por partículas sólidas montadas na interface entre dois líquidos imiscíveis, tem sido amplamente utilizada no campo biológico24,25. De fato, as partículas agregadas na interface óleo/água determinam a formulação de estruturas multinível, que promovem interações multinível entre sistema de entrega multinível e células e induzem ainda mais propriedades físico-químicas multifuncionais na entrega de medicamentos. Devido à sua deformabilidade e mobilidade lateral, esperava-se que as emulsões de Pickering entrassem em interação celular multivalente com os imunócitos e fossem reconhecidas pelas proteínas da membrana26. Além disso, como os núcleos de micela oleosos nas emulsões de Pickering não são completamente cobertos com partículas sólidas, as emulsões de Pickering possuem lacunas de tamanhos diferentes entre as partículas na interface óleo/água, o que causa maior hidrofobicidade. Assim, é crucial explorar a afinidade das emulsões de Pickering com APCs e elaborar a internalização subsequente para desenvolver adjuvantes eficientes.
Com base nessas considerações, projetamos uma emulsão de Pickering estabilizada por nanopartículas (PNPE) PLGA como um sistema de entrega de vacinas de fluidez que também ajudou a obter informações valiosas sobre a afinidade do PNPE com BMDCs e internalização celular. A adesão em tempo real de vesículas extracelulares biomiméticas (bEVs; uma substituição de BMDCs) ao PNPE foi monitorada por meio de um método livre de rótulo usando um microequilíbrio de cristal de quartzo com monitoramento de dissipação (QCM-D). Após a caracterização da afinidade do PNPE com os BMDCs, a microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) foi utilizada para determinar a captação do antígeno. O resultado indicou a maior afinidade do PNPE com os BMDCs e a internalização eficiente do antígeno. Antecipamos que o PNPE apresentaria maior afinidade com as APCs, o que pode estimular melhor a internalização de antígenos para melhorar as respostas imunes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desenvolvemos a emulsão óleo/água estabilizada por nanopartículas PLGA como um sistema de entrega para a internalização aprimorada de antígenos. O PNPE preparado possuía uma superfície densamente embalada para suportar o ponto de pouso e suavidade e fluidez únicas para um potente contato celular com a membrana celular imune. Além disso, a interface óleo/água oferecia carga de antígenos de alto teor e o PLGA anfifílico conferia ao PNPE alta estabilidade para o transporte de antígenos para as células imune…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por Projeto apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Chaves da China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), De 0 a 1 Projeto de Inovação Original do Programa de Pesquisa Científica de Fronteira Básica da Academia Chinesa de Ciências (ZDBS-LY-SLH040), da Fundação para Grupos de Pesquisa Inovadores da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No. 21821005).
Materials
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
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