בידוד זקיקים פרה-אנטרליים קטנים משחלת הבקר באמצעות שילוב של פיצול, הומוגניזציה וסינון סדרתי
Summary
קידום המחקר של פוליקולוגנזה פרה-אנטרלית דורש שיטות יעילות לבידוד זקיקים משחלות בודדות. מוצג כאן פרוטוקול מכני יעיל לבידוד זקיקים משחלות בקר באמצעות מסוק רקמות והומוגנייזר. שיטה זו מאפשרת איסוף של מספר רב של זקיקים פרה-אנטרליים בני קיימא משחלה אחת.
Abstract
הבנת התהליך המלא של פוליקולוגנזה של יונקים היא חיונית לשיפור טכנולוגיות הרבייה בסיוע בבעלי חיים, בבני אדם ובמינים בסכנת הכחדה. המחקר הוגבל בעיקר לזקיקים פרה-אנטרליים וגדולים בשל קושי בבידוד של זקיקים פרה-אנטרליים קטנים יותר, במיוחד ביונקים גדולים כמו מיני בקר. עבודה זו מציגה גישה יעילה לשליפת מספר גדול של זקיקים פרה-אנטרליים קטנים משחלה אחת של בקר. קליפת המוח של שחלות בקר בודדות נפרסה לקוביות של 500 מיקרומטר באמצעות מסוק רקמות והומוגנית במשך 6 דקות ב-9,000-11,000 סל”ד באמצעות בדיקה של 10 מ”מ. פסולת גדולה הופרדה מההומוגנט באמצעות בד גבינה, ולאחר מכן סינון סדרתי דרך מסנני תאים של 300 מיקרומטר ו-40 מיקרומטר. התכולה שנשמרה במסננת 40 מיקרומטר נשטפה לתוך צלחת חיפוש, שם זוהו זקיקים ונאספו לתוך טיפה של מדיום. הכדאיות של הזקיקים שנאספו נבדקה באמצעות צביעה כחולה טריפאן. שיטה זו מאפשרת בידוד של מספר רב של זקיקים פרה-אנטרליים קטנים בני קיימא משחלת בקר בודדת תוך כ-90 דקות. חשוב לציין ששיטה זו היא מכנית לחלוטין ומונעת שימוש באנזימים לניתוק הרקמה, מה שעלול לפגוע בזקיקים. הזקיקים המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש ליישומים במורד הזרם כגון בידוד RNA עבור RT-qPCR, אימונולוקליזציה של חלבונים ספציפיים ותרבית חוץ גופית .
Introduction
זקיקי השחלות הם היחידות הפונקציונליות של השחלה, האחראיות על ייצור הגמטה (ביצית) וכן הורמונים קריטיים לתפקוד הרבייה ולבריאות הכללית. זקיקים קדמוניים נוצרים בשחלה במהלך התפתחות העובר או בתקופת היילודים בהתאם למין1, והם מהווים את שמורת השחלות של הנקבה. צמיחת הזקיקים מתחילה בהפעלת זקיקים קדמוניים העוזבים את בריכת המנוחה ונכנסים לשלב הגידול. פוליקולוגנזה פרה-אנטרלית, המקיפה את כל שלבי הזקיקים לפני התפתחות אנטרום, היא תהליך דינמי ביותר הדורש שינויים מורפולוגיים ומטבוליים סינכרוניים בביצית ובתאי הגרנולוזה הסובבים אותה, המונעים על ידי תקשורת הדוקה בין שני סוגי תאים אלה 2,3. זקיקים פרה-אנטרליים מהווים את רוב יחידות הזקיקים הנמצאות בשחלה בכל זמן נתון4. ההתפתחות בשלבים הפרה-אנטרליים של folliculogenesis מוערכת כארוכה בכמה שבועות מהתפתחות אנטרלית 5,6, והפעם היא הכרחית כדי שהביציות והתאים הסומטיים ירכשו בגרות מספקת כדי להיכנס לשלב הסופי של ההתפתחות (כלומר, השלב האנטרלי), ולהתכונן לביוץ, להפריה ולהתפתחות עוברית 7,8,9.
חלק גדול מהידע הנוכחי על פוליקולוגנזה פרה-אנטרלית של השחלות מגיע ממודלים של עכברים10,11,12,13, בין היתר בשל הקלות בהחלמת מספר גדול של זקיקים אלה משחלה קטנה יותר וסיבית פחות. אף על פי שהדיווחים על בידוד של מספר גדול של זקיקים פרה-אנטרליים משחלות בקר מתוארכים לסביבות 30 שנהו-14, הבנה מלאה יותר לגבי התהליכים המסדירים את התפתחותם של זקיקים אלה בשלב מוקדם נותרה בלתי ממומשת, בעיקר בשל היעדר שיטות אופטימליות, יעילות וחוזרות על עצמן כדי לאחזר מספר מספיק של זקיקים פרה-אנטרליים בני קיימא, במיוחד בשלבים מוקדמים של התפתחות. עם העניין הגובר בשימור הרזרבה השחלתית לשימוש עתידי ברבייה בסיוע בבני אדם, פרות הופכות למודל אטרקטיבי בשל מבנה השחלות הדומה יותר שלהן15. עם זאת, שחילת הבקר עשירה יותר בקולגן בהשוואה לשחלה של העכבר16, מה שהופך את הבידוד המכני בשיטות המתוארות עבור העכבר לבלתי יעיל מאוד. המאמצים להרחבת טכניקות שימור הפוריות כוללים גידול חוץ גופי מלא של זקיקים פרה-אנטרליים לשלב האנטרלי, ולאחר מכן הבשלה חוץ גופית (IVM) של הביציות הסגורות, הפריה חוץ גופית (IVF), וייצור והחזרת עוברים17. עד כה, כל התהליך הזה הושג רק בעכברים18. בבקר, ההתקדמות לקראת גידול זקיקים במבחנה מוגבלת למספר דיווחים עם שלבי זקיק משתנים בתחילת התרבית, כמו גם אורך משתנה של תרבית בין פרוטוקולים17,19.
השיטות המתוארות בספרות לקצירת זקיקים פרה-אנטרליים משחלת הבקר השתמשו בעיקר בטכניקות מכניות ואנזימטיות, מבודדות או בשילובשל 2,14,17,20. הדו”ח הראשון של פרוטוקול לבידוד זקיקים פרה-אנטרליים של בקר השתמש בהומוגנייזר רקמות וסינון סדרתי כדי לעבד שחלות שלמות20. בעקבות מחקר זה הגיעו דיווחים ששילבו פרוצדורות מכניות ואנזימטיות שהשתמשו בקולגנאז14. מוטיב חוזר בעת שימוש בקולגנאז לעיכול רקמת השחלות הוא הסיכון הפוטנציאלי לנזק של קרום המרתף הזקיקי, שעלול לפגוע בכדאיות הזקיקים 14,21,22,23. לכן, נעשה שימוש בשילובים שונים של שיטות מכניות, כגון שימוש במסוק רקמות ופיפטינג חוזר או מסוק רקמות בשילוב עם הומוגניזציה20,24,25,26. טכניקה מכנית נוספת שתוארה משתמשת במחטים כדי לנתח זקיקים פרה-אנטרליים ישירות מרקמת השחלות, וזה שימושי במיוחד לבידוד זקיקים משניים גדולים יותר (>200 מיקרומטר). עם זאת, תהליך זה גוזל זמן, אינו יעיל לבידוד זקיקים פרנטרליים קטנים יותר, והוא תלוי בכישורים כאשר מנסים להשתמש בשחלות בקר 19,27,28.
תוך ניצול הטכניקות השונות המתוארות בספרות, פרוטוקול זה נועד לייעל את הבידוד של זקיקים פרה-אנטרליים משחלות בקר בודדות באופן פשוט, עקבי ויעיל המונע דגירה בתמיסות אנזימטיות. שיפור השיטות לבידוד זקיקים פרה-אנטרליים יספק הזדמנות לשפר את ההבנה של שלב זה של פוליקולוגנזה ולאפשר פיתוח של מערכות תרבית יעילות לפיתוח זקיקים פרה-אנטרליים לשלב האנטרלי. הנהלים המפורטים המתוארים כאן לבידוד זקיקים פרה-אנטרליים מיונק גדול כמו מין הבקר יהיו חיוניים לחוקרים השואפים לחקור פוליקולוגנזה מוקדמת במין שאינו מורין הניתן לתרגום לבני אדם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה הניתנת לשחזור לשליפת זקיקים פרה-אנטרליים בשלב מוקדם, במיוחד בשלבים ראשוניים ומשניים מוקדמים, משחלות הבקר. פרוטוקול זה מסתמך על דוחות קודמים 20,25,30,34,35,36 ומספק אופטימיזציות המביאות לבידוד מספר משמעותי של זקיקים משחלה בודדת.<sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן בחלקו על ידי פרויקט רב-מדינתי של USDA W4112 ופרס UC Davis Jastro Shields ל-SM.
המחברים רוצים להרחיב את הערכתם ל-Central Valley Meat, Inc. על אספקת שחלות הבקר המשמשות בכל הניסויים. המחברים גם מודים לאוליביה סילברה על הסיוע בעיבוד השחלות ובבידוד הזקיקים.
Materials
| 5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
| 20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| #21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
| 104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
| 300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
| BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
| Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
| Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
| Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
| Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
| Microscope – Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
| Microscope – Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
| Microscope – Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
| Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
| Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
| Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
| Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
| Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
| Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
| Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
| SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
| TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
| Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
| Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
| Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |
Referências
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology. 195 (4), 327-336 (1997).
- Jaffe, L. A., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annual Review of Physiology. 79, 237-260 (2017).
- Driancourt, M. A., Reynaud, K., Cortvrindt, R., Smitz, J. Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function. Reviews of Reproduction. 5 (3), 143-152 (2000).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproductive Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Aerts, J. M. J., Bols, P. E. J. Ovarian follicular dynamics: a review with emphasis on the bovine species. Part I: Folliculogenesis and preantral follicle development. Reproduction in Domestic Animals. 45 (1), 171-179 (2010).
- Sugiura, K., Pendola, F. L., Eppig, J. J. Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Biologia do Desenvolvimento. 279 (1), 20-30 (2005).
- Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biology of Reproduction. 73 (2), 351-357 (2005).
- Sugimura, S., et al. Amphiregulin co-operates with bone morphogenetic protein 15 to increase bovine oocyte developmental competence: effects on gap junction-mediated metabolite supply. Molecular Human Reproduction. 20 (6), 499-513 (2014).
- Edson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H. Genetics of mammalian reproduction: modeling the end of the germline. Annual Review of Physiology. 74, 503-528 (2012).
- McGee, E. A., Raj, R. S. Regulators of ovarian preantral follicle development. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (3), 179-184 (2015).
- Chen, Y., et al. The factors and pathways regulating the activation of mammalian primordial follicles in vivo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575706 (2020).
- Figueiredo, J. R., et al. Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology. 40 (4), 789-799 (1993).
- Sirard, M. A. The ovarian follicle of cows as a model for human. Animal Models and Human Reproduction. , 127-144 (2017).
- Parkes, W. S., et al. Hyaluronan and collagen are prominent extracellular matrix components in bovine and porcine ovaries. Genes. 12 (8), 1186 (2021).
- Araújo, V. R., Gastal, M. O., Figueiredo, J. R., Gastal, E. L. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12 (1), 1-14 (2014).
- Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biology of Reproduction. 41 (2), 268-276 (1989).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Nuttinck, F., Mermillod, P., Massip, A., Dessy, F. Characterization of in vitro growth of bovine preantral ovarian follicles: A preliminary study. Theriogenology. 39 (4), 811-821 (1993).
- Demeestere, I., et al. Effect of preantral follicle isolation technique on in-vitro follicular growth, oocyte maturation and embryo development in mice. Human Reproduction. 17 (8), 2152-2159 (2002).
- Fattahi, A., et al. Optimization of porcine ovarian follicle isolation methods for better developmental potential. Tissue Engineering Part A. 26 (13-14), 712-719 (2020).
- Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reproduction and Fertility. 2 (1), 35-46 (2021).
- Lucci, C. M., Rumpf, R., Figueiredo, J. R., Báo, S. N. Zebu (Bos indicus) ovarian preantral follicles: Morphological characterization and development of an efficient isolation method. Theriogenology. 57 (5), 1467-1483 (2002).
- Langbeen, A., et al. Characterization of freshly retrieved preantral follicles using a low-invasive, mechanical isolation method extended to different ruminant species. Zygote. 23 (5), 683-694 (2014).
- Candelaria, J. I., Denicol, A. C. Characterization of isolated bovine preantral follicles based on morphology, diameter and cell number. Zygote. 28 (2), 154-159 (2020).
- vanden Hurk, R., et al. Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Human Reproduction Update. 4 (6), 833-841 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Aguiar, L. H., Hyde, K. A., Pedroza, G. H., Denicol, A. C. Heat stress impairs in vitro development of preantral follicles of cattle. Animal Reproduction Science. 213, 106277 (2020).
- Kristensen, S. G., Ebbesen, P., Andersen, C. Y. Transcriptional profiling of five isolated size-matched stages of human preantral follicles. Molecular and Cellular Endocrinology. 401, 189-201 (2015).
- Candelaria, J. I., Rabaglino, M. B., Denicol, A. C. Ovarian preantral follicles are responsive to FSH as early as the primary stage of development. Journal of Endocrinology. 247 (2), 153-168 (2020).
- Nuttinck, F., et al. Comparative immunohistochemical distribution of Connexin 37 and Connexin 43 throughout folliculogenesis in the bovine ovary. Molecular Reproduction and Development. 57 (1), 60-66 (2000).
- Itoh, T., Hoshi, H. Efficient isolation and long-term viability of bovine small preantral follicles in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal. 36 (4), 235-240 (2000).
- Saha, S., Shimizu, M., Geshi, M., Izaike, Y. In vitro culture of bovine preantral follicles. Animal Reproduction Science. 63 (1-2), 27-39 (2000).
- Bus, A., et al. Preservation of connexin 43 and transzonal projections in isolated bovine pre-antral follicles before and following vitrification. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (2), 479-492 (2021).
- Gougeon, A., Ecochard, R., Thalabard, J. C. Age-related changes of the population of human ovarian follicles: increase in the disappearance rate of non-growing and early-growing follicles in aging women. Biology of Reproduction. 50 (3), 653-663 (1994).
- Xu, D., et al. Raf-ERK1/2 signaling pathways mediate steroid hormone synthesis in bovine ovarian granulosa cells. Reproduction in Domestic Animals. 54 (5), 741-749 (2019).
- Santos, R. R., et al. Cryopreservation of ovarian tissue: an emerging technology for female germline preservation of endangered species and breeds. Animal Reproduction Science. 122 (3-4), 151-163 (2010).
- Leonel, E. C. R., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
- Bus, A., Langbeen, A., Martin, B., Leroy, J. I. M. R., Bols, P. E. J. Is the pre-antral ovarian follicle the ‘holy grail’ for female fertility preservation. Animal Reproduction Science. 207, 119-130 (2019).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 1-9 (2017).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
