Aislamiento de pequeños folículos preantrales del ovario bovino mediante una combinación de fragmentación, homogeneización y filtración en serie
Summary
Avanzar en el estudio de la foliculogénesis preantral requiere métodos eficientes de aislamiento de folículos de ovarios individuales. Aquí se presenta un protocolo mecánico simplificado para el aislamiento de folículos de ovarios bovinos utilizando un cortador de tejido y homogeneizador. Este método permite la recolección de un gran número de folículos preantrales viables de un solo ovario.
Abstract
Comprender el proceso completo de la foliculogénesis de mamíferos es crucial para mejorar las tecnologías de reproducción asistida en ganado, humanos y especies en peligro de extinción. La investigación se ha limitado principalmente a los folículos preantrales y preantrales grandes debido a la dificultad en el aislamiento de folículos preantrales más pequeños, especialmente en mamíferos grandes como las especies bovinas. Este trabajo presenta un enfoque eficiente para recuperar un gran número de pequeños folículos preantrales de un solo ovario bovino. La corteza de los ovarios bovinos individuales se cortó en cubos de 500 μm usando un picador de tejido y se homogeneizó durante 6 minutos a 9,000-11,000 rpm usando una sonda de 10 mm. Los residuos grandes se separaron del homogeneizado con un paño de queso, seguido de una filtración en serie a través de filtros celulares de 300 μm y 40 μm. El contenido retenido en el colador de 40 μm se enjuagó en una placa de búsqueda, donde se identificaron los folículos y se recogieron en una gota de medio. La viabilidad de los folículos recolectados se probó mediante tinción de azul de tripano. Este método permite el aislamiento de un gran número de pequeños folículos preantrales viables de un solo ovario bovino en aproximadamente 90 minutos. Es importante destacar que este método es completamente mecánico y evita el uso de enzimas para disociar el tejido, lo que puede dañar los folículos. Los folículos obtenidos utilizando este protocolo se pueden utilizar para aplicaciones posteriores, como el aislamiento de ARN para RT-qPCR, la inmunolocalización de proteínas específicas y el cultivo in vitro .
Introduction
Los folículos ováricos son las unidades funcionales del ovario, responsables de la producción del gameto (ovocito), así como de las hormonas críticas para la función reproductiva y la salud en general. Los folículos primordiales se forman en el ovario durante el desarrollo fetal o en el período neonatal dependiendo de la especie1, y constituyen la reserva ovárica de una hembra. El crecimiento folicular comienza con la activación de los folículos primordiales que salen de la piscina de descanso y entran en la fase de crecimiento. La foliculogénesis preantral, que abarca todas las etapas del folículo antes del desarrollo del antro, es un proceso altamente dinámico que requiere cambios morfológicos y metabólicos sincrónicos en el ovocito y las células de la granulosa circundantes, impulsados por una estrecha comunicación entre estos dos tipos celulares 2,3. Los folículos preantrales constituyen la mayoría de las unidades foliculares que se encuentran en el ovario en un momento dado4. Se estima que el desarrollo a través de las etapas preantral de la foliculogénesis es varias semanas más largo que el desarrollo antral 5,6, y este tiempo es necesario para que el ovocito y las células somáticas adquieran la madurez suficiente para entrar en la etapa final de desarrollo (es decir, la etapa antral) y prepararse para la ovulación, la fertilización y el desarrollo embrionario 7,8,9.
Gran parte del conocimiento actual sobre la foliculogénesis preantral ovárica proviene de modelos de ratón10,11,12,13, debido en parte a la facilidad para recuperar un gran número de estos folículos de un ovario más pequeño y menos fibroso. Aunque los informes de aislamiento de un gran número de folículos preantrales de ovarios bovinos datan de aproximadamente 30 años14, una comprensión más completa sobre los procesos que regulan el desarrollo de estos folículos en etapa temprana ha permanecido sin realizar, en gran parte debido a la falta de métodos optimizados, eficientes y repetibles para recuperar un número suficiente de folículos preantrales viables, particularmente en las primeras etapas de desarrollo. Con el creciente interés en preservar la reserva ovárica para su uso futuro en reproducción asistida en humanos, las vacas se convierten en un modelo atractivo debido a su estructura ovárica más similar15. Sin embargo, el ovario bovino es marcadamente más rico en colágeno en comparación con el ovario del ratón16, lo que hace que el aislamiento mecánico utilizando métodos descritos para el ratón sea muy ineficiente. Los esfuerzos para ampliar las técnicas de preservación de la fertilidad incluyen el crecimiento completo in vitro de los folículos preantrales hasta la etapa antral, seguido de la maduración in vitro (MIV) de los ovocitos adjuntos, la fertilización in vitro (FIV) y la producción y transferencia de embriones17. Hasta ahora, todo este proceso solo se ha logrado en ratones18. En bovinos, el progreso hacia el crecimiento folicular in vitro se limita a unos pocos informes con etapas foliculares variables al inicio del cultivo, así como duración variable del cultivo entre los protocolos17,19.
Los métodos descritos en la literatura para la recolección de folículos preantrales del ovario bovino han utilizado principalmente técnicas mecánicas y enzimáticas, aisladas o en combinación 2,14,17,20. El primer informe de un protocolo para el aislamiento del folículo preantral bovino utilizó un homogeneizador tisular y filtración seriada para procesar ovarios enteros20. Este estudio fue seguido por informes que combinaron procedimientos mecánicos y enzimáticos que utilizaron colagenasa14. Un tema recurrente cuando se utiliza colagenasa para digerir el tejido ovárico es el riesgo potencial de daño de la membrana basal folicular, que puede comprometer la viabilidad del folículo 14,21,22,23. Por lo tanto, se han empleado diferentes combinaciones de métodos mecánicos, como el uso de un picador de tejidos y pipeteo repetido o un picador de tejidos combinado con homogeneización20,24,25,26. Otra técnica mecánica que se ha descrito utiliza agujas para diseccionar folículos preantrales directamente del tejido ovárico, lo que es especialmente útil para aislar folículos secundarios más grandes (>200 μm). Sin embargo, este proceso requiere mucho tiempo, es ineficiente para aislar folículos preantrales más pequeños y depende del conjunto de habilidades cuando se intenta en ovarios bovinos 19,27,28.
Aprovechando las diferentes técnicas descritas en la literatura, este protocolo tuvo como objetivo optimizar el aislamiento de folículos preantrales de ovarios bovinos individuales de una manera simple, consistente y eficiente que evite la incubación en soluciones enzimáticas. La mejora de los métodos para aislar los folículos preantrales brindará la oportunidad de mejorar la comprensión de esta etapa de la foliculogénesis y permitirá el desarrollo de sistemas de cultivo efectivos para desarrollar folículos preantrales hasta la etapa antral. Los procedimientos detallados descritos en este documento para el aislamiento de folículos preantrales de un mamífero grande como la especie bovina serán vitales para los investigadores que buscan estudiar la foliculogénesis temprana en una especie no murina que sea traducible a los humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente protocolo detalla un método reproducible para recuperar folículos preantrales en etapa temprana, específicamente en etapas primarias y secundarias tempranas, del ovario bovino. Este protocolo se basa en informes anteriores 20,25,30,34,35,36 y proporciona optimizaciones que resultan en el aislamiento de un número significativo de folículos de un ovario individual.<sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue parcialmente financiado por el proyecto multiestatal W4112 del USDA y el premio Jastro Shields de UC Davis a SM.
Los autores desean extender su agradecimiento a Central Valley Meat, Inc. por proporcionar los ovarios bovinos utilizados en todos los experimentos. Los autores también agradecen a Olivia Silvera por su ayuda con el procesamiento de los ovarios y el aislamiento del folículo.
Materials
| 5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
| 20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| #21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
| 104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
| 300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
| BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
| Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
| Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
| Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
| Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
| Microscope – Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
| Microscope – Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
| Microscope – Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
| Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
| Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
| Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
| Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
| Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
| Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
| Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
| SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
| TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
| Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
| Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
| Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |
Referências
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