JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Küçük Preantral Foliküllerin Sığır Yumurtalıktan Parçalanma, Homojenizasyon ve Seri Filtrasyon Kombinasyonu Kullanılarak İzolasyonu

Published: September 27, 2022
doi:
10.3791/64423
, , ,
1Department of Animal Science,University of California Davis

Summary

Preantral folikülogenez çalışmasının ilerletilmesi, tek yumurtalıklardan folikül izolasyonu için etkili yöntemler gerektirir. Burada bir doku doğrayıcı ve homojenizatör kullanılarak sığır yumurtalıklarından folikül izolasyonu için modernize edilmiş, mekanik bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, tek bir yumurtalıktan çok sayıda canlı preantral folikülün toplanmasına izin verir.

Abstract

Memeli folikülogenezinin tüm sürecini anlamak, hayvancılıkta, insanlarda ve nesli tükenmekte olan türlerde yardımcı üreme teknolojilerinin geliştirilmesi için çok önemlidir. Araştırmalar, özellikle sığır türleri gibi büyük memelilerde, daha küçük preantral foliküllerin izolasyonundaki zorluk nedeniyle çoğunlukla antral ve büyük preantral foliküllerle sınırlı kalmıştır. Bu çalışma, tek bir sığır yumurtalığından çok sayıda küçük preantral folikül almak için etkili bir yaklaşım sunmaktadır. Bireysel sığır yumurtalıklarının korteksi, bir doku doğrayıcı kullanılarak 500 μm küplere dilimlendi ve 10 mm’lik bir prob kullanılarak 9.000-11.000 rpm’de 6 dakika homojenize edildi. Büyük döküntüler homojenattan bir peynir bezi kullanılarak ayrıldı, ardından 300 μm ve 40 μm hücre süzgeçleri aracılığıyla seri filtreleme yapıldı. 40 μm süzgeçte tutulan içerikler, foliküllerin tanımlandığı ve bir damla ortama toplandığı bir arama kabında durulandı. Toplanan foliküllerin canlılığı tripan mavisi boyama ile test edildi. Bu yöntem, yaklaşık 90 dakika içinde tek bir sığır yumurtalıktan çok sayıda canlı küçük preantral folikülün izole edilmesini sağlar. Önemli olarak, bu yöntem tamamen mekaniktir ve foliküllere zarar verebilecek dokuyu ayırmak için enzimlerin kullanılmasını önler. Bu protokol kullanılarak elde edilen foliküller, RT-qPCR için RNA’nın izolasyonu, spesifik proteinlerin immünolokalizasyonu ve in vitro kültür gibi aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.

Introduction

Yumurtalık folikülleri, gamet (oosit) üretiminin yanı sıra üreme fonksiyonu ve genel sağlık için kritik olan hormonlardan sorumlu olan yumurtalık fonksiyonel birimleridir. İlkel foliküller, fetal gelişim sırasında veyayenidoğan döneminde 1. türe bağlı olarak yumurtalıkta oluşur ve bir dişinin yumurtalık rezervini oluşturur. Foliküler büyüme, dinlenme havuzunu terk eden ve büyüme fazına giren ilkel foliküllerin aktivasyonu ile başlar. Antrum gelişiminden önceki tüm folikül aşamalarını kapsayan preantral folikülogenez, oosit ve çevresindeki granüloza hücrelerinde senkron morfolojik ve metabolik değişiklikler gerektiren, bu ikihücre tipi 2,3 arasındaki sıkı iletişimle yönlendirilen oldukça dinamik bir süreçtir. Preantral foliküller, herhangi bir zamanda yumurtalıkta bulunan foliküler birimlerin çoğunluğunu oluşturur4. Folikülogenezin preantral aşamalarındaki gelişimin, antral gelişimden 5,6’dan birkaç hafta daha uzun olduğu tahmin edilmektedir ve bu süre, oosit ve somatik hücrelerin gelişimin son aşamasına (yani antral aşamaya) girmek ve yumurtlamaya, döllenmeye ve embriyonik gelişime hazırlanmak için yeterli olgunluk kazanmaları için gereklidir 7,8,9.

Yumurtalık preantral folikülogenezi hakkındaki mevcut bilgilerin çoğu, kısmen bu foliküllerin büyük bir kısmının daha küçük ve daha az fibröz bir yumurtalıktan kurtarılmasındaki kolaylıktan dolayı, fare modelleri 10,11,12,13’ten gelmektedir. Sığır yumurtalıklarından çok sayıda preantral folikülün izolasyonuna ilişkin raporlar yaklaşık 30 yıl öncesine dayanmasına rağmen14, bu erken evre foliküllerin gelişimini düzenleyen süreçler hakkında daha eksiksiz bir anlayış, büyük ölçüde, özellikle gelişimin erken aşamalarında, yeterli sayıda canlı preantral folikül elde etmek için optimize edilmiş, verimli ve tekrarlanabilir yöntemlerin bulunmaması nedeniyle gerçekleşmemiştir. İnsanlarda yardımlı üremede gelecekteki kullanım için yumurtalık rezervinin korunmasına olan ilginin artmasıyla birlikte, inekler daha benzer yumurtalık yapıları nedeniyle çekici bir model haline gelmiştir15. Bununla birlikte, sığır yumurtalık, fare yumurtalık16’ya kıyasla kollajen bakımından belirgin şekilde daha zengindir ve fare için açıklanan yöntemleri kullanarak mekanik izolasyonu çok verimsiz hale getirir. Fertilite koruma tekniklerini genişletme çabaları, preantral foliküllerin antral aşamaya kadar tam in vitro büyümesini, ardından kapalı oositlerin in vitro olgunlaşmasını (IVM), in vitro fertilizasyonu (IVF) ve embriyo üretimini ve transferini içerir17. Şimdiye kadar, tüm bu süreç sadecefarelerde 18 elde edildi. Sığırlarda, in vitro folikül büyümesine doğru ilerleme, kültürün başlangıcında değişken folikül aşamalarına veprotokoller 17,19 arasında değişken kültür uzunluğuna sahip birkaç raporla sınırlıdır.

Sığır yumurtalıktan preantral foliküllerin toplanması için literatürde açıklanan yöntemler çoğunlukla izole edilmiş veya kombinasyon halinde mekanik ve enzimatik teknikler kullanmıştır 2,14,17,20. Sığır preantral folikül izolasyonu için bir protokolün ilk raporunda, tüm yumurtalıkları işlemek için bir doku homojenizatörü ve seri filtrasyon kullanılmıştır20. Bu çalışmayı, kollajenaz14’ün kullanıldığı mekanik ve enzimatik prosedürleri birleştiren raporlar izledi. Yumurtalık dokusunu sindirmek için kollajenaz kullanıldığında tekrarlayan bir tema, foliküler bazal membranın hasar görmesi için potansiyel risktir, bu da folikül canlılığını tehlikeye atabilir 14,21,22,23. Bu nedenle, bir doku doğrayıcı ve tekrarlanan pipetleme veya homojenizasyon20,24,25,26 ile birleştirilmiş bir doku doğrayıcı kullanımı gibi farklı mekanik yöntem kombinasyonları kullanılmıştır. Tarif edilen bir başka mekanik teknik, preantral folikülleri doğrudan yumurtalık dokusundan diseke etmek için iğneler kullanır, bu da özellikle daha büyük (>200 μm) sekonder folikülleri izole etmek için yararlıdır. Bununla birlikte, bu süreç zaman alıcıdır, daha küçük preantral folikülleri izole etmek için verimsizdir ve sığır yumurtalıklarında denendiğinde beceri setine bağımlıdır 19,27,28.

Literatürde anlatılan farklı tekniklerden yararlanan bu protokol, enzimatik solüsyonlarda inkübasyonu önleyen basit, tutarlı ve verimli bir şekilde preantral foliküllerin tek sığır yumurtalıklarından izolasyonunu optimize etmeyi amaçlamıştır. Preantral folikülleri izole etme yöntemlerinin geliştirilmesi, folikülogenezin bu aşamasının anlaşılmasını arttırmak ve preantral folikülleri antral aşamaya kadar geliştirmek için etkili kültür sistemlerinin geliştirilmesini sağlamak için bir fırsat sağlayacaktır. Preantral foliküllerin sığır türleri gibi büyük bir memeliden izole edilmesi için burada açıklanan ayrıntılı prosedürler, insanlara çevrilebilen murin olmayan bir türde erken folikülogenezi incelemeyi amaçlayan araştırmacılar için hayati önem taşıyacaktır.

Protocol

Sığır (Bos taurus) yumurtalıkları yerel bir mezbahadan temin edildi ve toplandıktan sonraki 6 saat içinde laboratuvara taşındı. Tesiste işlenen çok sayıda hayvan nedeniyle, hayvanların östrus döngüsünün yaşı, cinsi ve aşaması bilinmemektedir. Bu deneylerde canlı hayvan kullanılmadığından, onaylanmış bir hayvan bakımı ve kullanım protokolü gerekli değildi. 1. Ekipman ve reaktiflerin hazırlanması Bir laboratuvar tezgahını…

Representative Results

Genel bakış ve kritik adımlarBu protokolü kullanarak, küçük sığır preantral folikülleri, deneysel olarak ilgili sayılarda tek yumurtalıklardan güvenilir bir şekilde izole edilebilir. Toplam 30 replikasyondan, replika başına ortalama 41 folikül elde edildi ve 11 ila 135 folikül aralığında (Şekil 4A). 14 replikasyonda, foliküller, stereomikroskop altında 1 μm mikroskop kalibrasyon slaytı kullanılarak folikül çapının ölçülmesiyle daha önc…

Discussion

Mevcut protokol, sığır yumurtalığından erken evre preantral folikülleri, özellikle primer ve erken sekonder evrelerde, almak için tekrarlanabilir bir yöntemi detaylandırmaktadır. Bu protokol, önceki raporlara dayanır 20,25,30,34,35,36 ve bireysel bir yumurtalıktan anlamlı sayıda folikülün izolasyonu ile sonuçlanan optimizasyonlar sağlar.<s…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu proje kısmen USDA Çok Devletli proje W4112 ve UC Davis Jastro Shields SM’ye verilen ödül tarafından finanse edildi.

Yazarlar, tüm deneylerde kullanılan sığır yumurtalıklarını sağladığı için Central Valley Meat, Inc.’e teşekkürlerini sunmak istiyorlar. Yazarlar ayrıca Olivia Silvera’ya yumurtalık işleme ve folikül izolasyonu ile ilgili yardımları için teşekkür eder.

Materials

5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette Duran Wheaton Kimble 63A54 Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining
20 mL Luer-lock Syringe Fisher Scientific Z116882-100EA Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
#21 Sterile Scalpel Blade Fisher Scientific 50-365-023 Used to cut the ovaries and remove the medula
40 μm Cell Strainer Fisher Scientific  22-363-547 Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer
104 mm Plastic Funnel Fisher Scientific 10-348C Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over
300 μm Cell Strainer pluriSelect  43-50300-03 Used to filter the filtrate from the cheese cloth 
500 mL Erlenmeyer Flask Fisher Scientific FB500500 Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth 
Air-Tite Sterile Needles 18 G Thermo Fisher Scientific 14-817-151 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm Fisher Scientific 14-817-171 Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck
BD Hoechst 33342 Solution Fisher Scientific BDB561908 Fluorescent DNA stain
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030-100G  Component of follicle wash media
Cheese Cloth Electron Microscopy Sciences 71748-00 First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris
Classic Double Edge Safety Razor Blades Wilkinson Sword N/A Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Fisher Scientific A-21206 Secondary antibody for immunostaining
Eisco Latex Pipette Bulbs Fisher Scientific S29388 Rubber bulb to use with Pasteur pipettes
HEPES Buffer Sigma-Aldrich H3375 Component of follicle wash media
Homogenizer VWR 10032-336 Homogenize the ovarian tissue to release follicles 
ImageJ/Fiji NIH v2.3.1 Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization
McIlwain Tissue Chopper Ted Pella 10184 Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization
Microscope – Stereoscope Olympus SZX2-ILLT Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate
Microscope – Inverted Nikon Diaphot 300 Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles
Microscope – Inverted ECHO Revolve R4 Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles
Mineral Oil Sigma-Aldrich M8410-1L Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching
Non-essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-050 Component of follicle wash medium
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-001 Reagent for immunostaining blocking buffer
Nunc 4-well Dishes for IVF Thermo Fisher Scientific 144444 4-well dishes for follicle isolation and washing
Penicillin-Streptomycin Solution 100x Gibco 15-140-122 Component of follicle wash medium
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm Ted Pella 10184-04 Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP665-1 Washing buffer for ovaries and follicles
Plastic Cutting Board Fisher Scientific 09-002-24A Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries
Polyvinylpyrrolidone (PVP) Fisher Scientific BP431-100 Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other 
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue
Qiagen RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA column clean-up kit
R The R Foundation v4.1.2 Statistical analysis software
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody Abcam ab181701 Cx37 primary antibody for immunostaining
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific K1691 cDNA synthesis kit
Rstudio RStudio, PBC v2021.09.2 Statistical analysis software
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) Fisher Scientific SS266-1 Used to increase media pH to 7.6-7.8
Sodium Pyruvate (NaPyr) Gibco 11360-070 Component of follicle wash medium
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm  Thermo Fisher Scientific 60872-310 Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles 
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix BioRad 1725271 Mastermix for PCR reaction
Steritop Threaded Bottle Top Filter Sigma-Aldrich S2GPT02RE Used to sterilize follicle wash medium
SYBR-safe DNA gel stain Thermo Fisher Scientific S33102 Staining to visual PCR products on agarose gel
TCM199 with Hank’s Salts Gibco 12-350-039 Component of follicle wash medium
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100 Detergent for immunostaining permeabilization buffer
Trizol reagent Thermo Fisher Scientific 15596026 RNA isolation reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15-250-061 Used for testing viability of isolated follicles
Tween 20 Detergent for immunostaining wash buffer
Warmer Plate Universal WTA 20931 Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope
Wiretrol II Calibrated Micropipets Drummond 50002-005 Glass micropipettes to manipulate follicles
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
  2. Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology. 195 (4), 327-336 (1997).
  3. Jaffe, L. A., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annual Review of Physiology. 79, 237-260 (2017).
  4. Driancourt, M. A., Reynaud, K., Cortvrindt, R., Smitz, J. Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function. Reviews of Reproduction. 5 (3), 143-152 (2000).
  5. Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproductive Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
  6. Aerts, J. M. J., Bols, P. E. J. Ovarian follicular dynamics: a review with emphasis on the bovine species. Part I: Folliculogenesis and preantral follicle development. Reproduction in Domestic Animals. 45 (1), 171-179 (2010).
  7. Sugiura, K., Pendola, F. L., Eppig, J. J. Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Biologia do Desenvolvimento. 279 (1), 20-30 (2005).
  8. Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biology of Reproduction. 73 (2), 351-357 (2005).
  9. Sugimura, S., et al. Amphiregulin co-operates with bone morphogenetic protein 15 to increase bovine oocyte developmental competence: effects on gap junction-mediated metabolite supply. Molecular Human Reproduction. 20 (6), 499-513 (2014).
  10. Edson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
  11. Matzuk, M. M., Burns, K. H. Genetics of mammalian reproduction: modeling the end of the germline. Annual Review of Physiology. 74, 503-528 (2012).
  12. McGee, E. A., Raj, R. S. Regulators of ovarian preantral follicle development. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (3), 179-184 (2015).
  13. Chen, Y., et al. The factors and pathways regulating the activation of mammalian primordial follicles in vivo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575706 (2020).
  14. Figueiredo, J. R., et al. Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology. 40 (4), 789-799 (1993).
  15. Sirard, M. A. The ovarian follicle of cows as a model for human. Animal Models and Human Reproduction. , 127-144 (2017).
  16. Parkes, W. S., et al. Hyaluronan and collagen are prominent extracellular matrix components in bovine and porcine ovaries. Genes. 12 (8), 1186 (2021).
  17. Araújo, V. R., Gastal, M. O., Figueiredo, J. R., Gastal, E. L. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12 (1), 1-14 (2014).
  18. Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biology of Reproduction. 41 (2), 268-276 (1989).
  19. McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  20. Nuttinck, F., Mermillod, P., Massip, A., Dessy, F. Characterization of in vitro growth of bovine preantral ovarian follicles: A preliminary study. Theriogenology. 39 (4), 811-821 (1993).
  21. Demeestere, I., et al. Effect of preantral follicle isolation technique on in-vitro follicular growth, oocyte maturation and embryo development in mice. Human Reproduction. 17 (8), 2152-2159 (2002).
  22. Fattahi, A., et al. Optimization of porcine ovarian follicle isolation methods for better developmental potential. Tissue Engineering Part A. 26 (13-14), 712-719 (2020).
  23. Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reproduction and Fertility. 2 (1), 35-46 (2021).
  24. Lucci, C. M., Rumpf, R., Figueiredo, J. R., Báo, S. N. Zebu (Bos indicus) ovarian preantral follicles: Morphological characterization and development of an efficient isolation method. Theriogenology. 57 (5), 1467-1483 (2002).
  25. Langbeen, A., et al. Characterization of freshly retrieved preantral follicles using a low-invasive, mechanical isolation method extended to different ruminant species. Zygote. 23 (5), 683-694 (2014).
  26. Candelaria, J. I., Denicol, A. C. Characterization of isolated bovine preantral follicles based on morphology, diameter and cell number. Zygote. 28 (2), 154-159 (2020).
  27. vanden Hurk, R., et al. Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Human Reproduction Update. 4 (6), 833-841 (1998).
  28. Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. de Aguiar, L. H., Hyde, K. A., Pedroza, G. H., Denicol, A. C. Heat stress impairs in vitro development of preantral follicles of cattle. Animal Reproduction Science. 213, 106277 (2020).
  31. Kristensen, S. G., Ebbesen, P., Andersen, C. Y. Transcriptional profiling of five isolated size-matched stages of human preantral follicles. Molecular and Cellular Endocrinology. 401, 189-201 (2015).
  32. Candelaria, J. I., Rabaglino, M. B., Denicol, A. C. Ovarian preantral follicles are responsive to FSH as early as the primary stage of development. Journal of Endocrinology. 247 (2), 153-168 (2020).
  33. Nuttinck, F., et al. Comparative immunohistochemical distribution of Connexin 37 and Connexin 43 throughout folliculogenesis in the bovine ovary. Molecular Reproduction and Development. 57 (1), 60-66 (2000).
  34. Itoh, T., Hoshi, H. Efficient isolation and long-term viability of bovine small preantral follicles in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal. 36 (4), 235-240 (2000).
  35. Saha, S., Shimizu, M., Geshi, M., Izaike, Y. In vitro culture of bovine preantral follicles. Animal Reproduction Science. 63 (1-2), 27-39 (2000).
  36. Bus, A., et al. Preservation of connexin 43 and transzonal projections in isolated bovine pre-antral follicles before and following vitrification. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (2), 479-492 (2021).
  37. Gougeon, A., Ecochard, R., Thalabard, J. C. Age-related changes of the population of human ovarian follicles: increase in the disappearance rate of non-growing and early-growing follicles in aging women. Biology of Reproduction. 50 (3), 653-663 (1994).
  38. Xu, D., et al. Raf-ERK1/2 signaling pathways mediate steroid hormone synthesis in bovine ovarian granulosa cells. Reproduction in Domestic Animals. 54 (5), 741-749 (2019).
  39. Santos, R. R., et al. Cryopreservation of ovarian tissue: an emerging technology for female germline preservation of endangered species and breeds. Animal Reproduction Science. 122 (3-4), 151-163 (2010).
  40. Leonel, E. C. R., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
  41. Bus, A., Langbeen, A., Martin, B., Leroy, J. I. M. R., Bols, P. E. J. Is the pre-antral ovarian follicle the ‘holy grail’ for female fertility preservation. Animal Reproduction Science. 207, 119-130 (2019).
  42. Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
  43. Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 1-9 (2017).
  44. Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
  45. Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).

Tags

Keywords: Bovine OvaryPreantral FolliclesFolliculogenesisFertility PreservationOvarian BiopsyFragmentationHomogenizationFiltrationIsolation ProtocolCortexMedullaScalpelPBS
check_url/pt/64423?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of Small Preantral Follicles from the Bovine Ovary Using a Combination of Fragmentation, Homogenization, and Serial Filtration. J. Vis. Exp. (187), e64423, doi:10.3791/64423 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image