Summary
近赤外フェムト秒レーザーを用いた中期I期にマウス卵母細胞の細胞質微小管組織化中心の枯渇を可能にする最適化されたプロトコルを提示します。
Abstract
卵母細胞減数分裂の忠実度は、発達的に有能な倍数体卵を生成するために重要です。哺乳動物では、卵母細胞は最初の減数分裂の前期Iで長時間の停止を受ける。思春期後、減数分裂の再開時に、核膜は分解し(核膜破壊)、紡錘体は主に卵母細胞中心で組み立てられます。初期の中央紡錘体位置決めは、異常な動膜-微小管(MT)付着および異数性から保護するために不可欠です。中央に配置された紡錘体は、時間に敏感な方法で皮質に向かって移動し、これは小さな極性体を押し出すために必要なプロセスです。有糸分裂細胞では、紡錘体の位置決めは、中心体を介したアストラルMTと細胞皮質との間の相互作用に依存しています。それどころか、マウスの卵母細胞は古典的な中心体を欠いており、代わりに多数の中心性MT組織化センター(MTOC)を含んでいます。中期I期では、マウス卵母細胞には、(1)紡錘体極を組み立てるためにクラスター化およびソートされたMTOC(極性MTOC)と、(2)細胞質に残り、紡錘体形成に直接寄与しないが、紡錘体の位置決めとタイムリーな紡錘体移動の調節に重要な役割を果たす中期細胞質MTOC(mcMTOC)の2つの異なるMTOCセットがあります。ここでは、 Cep192-eGfp レポーターマウスから採取した卵母細胞において内因的に標識されたmcMTOCsを選択的に枯渇させる多光子レーザーアブレーション法について説明する。この方法は、哺乳類の卵母細胞における紡錘体の位置決めと移動の根底にある分子メカニズムの理解に貢献します。
Introduction
一倍体配偶子(精子と卵母細胞)は減数分裂によって産生され、1ラウンドのDNA複製とそれに続く受精前の染色体数の減少に必要な2つの連続した分裂を伴います。哺乳動物では、胎児の初期に、卵母細胞は、最初の減数分裂の前期Iのジプロテン段階、胚小胞(GV)段階と呼ばれる段階で(思春期まで)長時間の停止を受ける。減数分裂の再開後、GV卵母細胞は核膜破壊(NEBD)を受け、紡錘体は主に卵母細胞中心1,2,3で組み立てられます。その後、F-アクチンによって駆動され、紡錘体は卵母細胞の中心から皮質にタイムリーに移動し、非常に非対称な分裂を確実にし、小さな極体(PB)を持つ卵子をもたらします4,5,6。
有糸分裂細胞では、中心体は、ペリセントリン、γチューブリン、Cep152、およびCep192などの中心小体材料成分(PMC)に囲まれた一対の中心小体からなる7。これらの中心体含有中心体は、双極紡錘体形成の忠実度に寄与する8。しかし、中心小体は、げっ歯類を含む様々な種において、初期の卵形成中に失われる9。したがって、マウスの卵母細胞は、多数の中心微小管(MT)組織化センター(MTOC)を使用して、中心小体に依存しない紡錘体アセンブリ経路を採用しています9,10。減数分裂が再開すると、核周囲MTOCは、再凝縮、伸張、および断片化の3つの異なるステップを経て、多数のより小さなMTOCになります11,12。次に、断片化されたMTOCをクラスタ化してソートし、バイポーラスピンドル10、13、14を整理します。MTOCの別のプールは、NEBD中に細胞質にあります。これらの細胞質MTOCの一部は移動して紡錘体極を形成します(極性MTOC、pMTOC)10,11。最近、中期細胞質MTOC(mcMTOC)と呼ばれる細胞質MTOCの別のサブセットが発見され、紡錘体極形成には寄与しませんが、中期I期(Met I)中に卵母細胞質に残ります15。多光子レーザーアブレーションによるmcMTOCの枯渇、またはオートファジー阻害によるMCMTOCの数の異常増加は、紡錘体の位置決めと移動を乱し、中期II卵母細胞における異数性の発生率を増加させる15。
興味深いことに、mcMTOCは多くの点でpMTOCとは異なります15。例えば、主に核周囲MTOCに由来するpMTOCとは対照的に、mcMTOCは卵母細胞皮質に由来する。スピンドルがまだ卵母細胞中心にある場合、mcMTOCは、PB押出15のためにスピンドルが移動する側とは反対に非対称に局在する。アストラル様MTは、比較的大きな卵母細胞内の皮質に到達できません。したがって、これらのmcMTOCはMTを核形成して、紡錘体を(アストラル様MTOCを介して )皮質に固定します。これらの知見は、mcMTOC有核MT力が、皮質への紡錘体移動を促進するFアクチン媒介力を打ち消すモデルを示唆している。これら2つの相反する力のバランスは、中央スピンドルの位置とタイムリーなスピンドルの移動を調整するために不可欠です15。
現在までに、検査されたすべてのPMCタンパク質(ペリセントリン、g-チューブリン、Cep192、およびオーロラキナーゼA)は、両方のMTOCプール(mcMTOCおよびpMTOC)に局在しています15。したがって、pMTOCを摂動せずにmcMTOCを選択的に摂動させる化学的または遺伝的アプローチはありません。これらの制限は、レーザーアブレーションでmcMTOCを選択的に標的にすることで回避できます。マイクロアブレーションのために開発されたレーザーベースの技術の中で、パルス多光子フェムト秒レーザーは、焦点面に限定された精密な衝撃、近赤外光の高い浸透深さ、および細胞への光毒性および熱損傷の低減により、大きな可能性を示しています16,17,18。この研究では、倒立顕微鏡に結合された多光子レーザーを使用して、マウス卵母細胞のmcMTOCをアブレーションする選択的アプローチについて説明しています。
Protocol
ここに記載されているすべての方法は、ミズーリ大学によって承認されています(アニマルケア品質保証参照番号9695)。 Cep192-eGFP レポーター6〜8週齢の雌マウスを本試験に用いた。 Cep192-eGFP レポーターマウスを作製するために、CRISPR/Cas9を介した相同性指向修復を用いて、EGFPレポーター遺伝子をCF-1マウスゲノムに組み込んだ。EGFPレポーターは、Cep192(MTOCの不可欠なコンポーネント)のC末端で融合しました15。マウスコロニーを維持するために、ホモ接合型の Cep192-eGfp レポーターマウスを使用した。すべての動物は、ケージ(ケージあたり最大4匹/ケージ)で21°C、湿度55%で維持され、12時間の明暗サイクルと食物と水への 自由 アクセスがありました。
1.マウス卵母細胞コレクション
- 培養培地(Chatot、Ziomek、およびBavister、CZB19、 材料表を参照)を調製し、37°Cおよび5%CO2 で一晩インキュベートします。
注:CZB培地は4°Cで1ヶ月間保存できます(培地組成については 補足ファイル1 を参照)。 - CZB培地にグルタミン(1 mM)とミルリノン(2.5 mM)(CZB + M)( 材料の表を参照)を補給し、インキュベーターに入れます。
注:ミルリノンは、前期Iで停止した卵母細胞を維持し、減数分裂の再開を防ぐホスホジエステラーゼ阻害剤です20。 - 3 mg/mLのポリビニルピロリドン(PVP)、25 mM HEPES(pH 7.3)(補足ファイル1)、およびミルリノン(2.5 mM)(MEM/PVP + M、 材料表を参照)を含む収集培地(重炭酸塩を含まない最小必須培地、MEM)を準備します。
- 収集皿と培養皿を準備し、60 mmと35 mmのペトリ皿にそれぞれ4マイクロドロップ(100 μL)の収集培地(MEM/PVP + M)と2マイクロドロップ(100 μL)の培養液(CZB + M)を作り、鉱物油で覆います( 材料表を参照)。回収皿をスライド保温器上に保ち、培養皿を37°C、5%CO2のインキュベーターに入れる。
- 卵母細胞採取の44〜48時間前に、妊娠牝馬の血清ゴナドトロピン(PMSG、 材料の表を参照)の5IUを性的に成熟した(6〜8週齢) Cep192-eGFP レポーター雌マウスに腹腔内注射します。.
- マウスを頸部脱臼によって屠殺し、卵巣21を特定して除去し、37°Cで予熱した収集培地(MEM/PVP + M)を含む時計のグラスに移します。
- 時計のグラスの底に1 mLの注射器を触れ、束ねた縫い針を使用して数回(卵巣あたり~40回)穿刺して卵巣を固定し、卵母細胞を培地に放出します。
- プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、ステップ1.7の積雲母細胞複合体(COC)を含むすべての培地を空の100 mmプラスチックペトリ皿に移します。
- 実体顕微鏡下で、パスツールガラスピペットを使用してCOCを収集し、MEM/PVP + Mを含む収集皿に移します。
- 細いパスツールガラスピペット(直径約100 μm)を使用して、穏やかに反復ピペッティングして卵母細胞を機械的に脱ヌードし、続いてCZB + M培養皿に移す前に、(100 μL)MEM/PVP + M(収集皿)の4マイクロドロップで卵母細胞を移して洗浄します。
- 露出した卵母細胞を空気中の5%のCO2 で37°Cで1時間インキュベートします。
2.卵母細胞マイクロインジェクション
- 250 μLのMEM/PVP + M滴を100 mmのプラスチック製ペトリ皿蓋に入れ、鉱物油で覆います。
注意: ペトリ皿の蓋には、マイクロマニピュレーターを調整するためのより多くのスペースを提供する下部リムがあります。 - マイクロインジェクションシステムをオンにします(材料の表を参照)。
- マイクロインジェクションディッシュを顕微鏡の加温ステージ(37°C)に置きます。
- マイクロローダーピペットチップ(材料の表を参照)を使用して、0.5 μLのmCh-Cep192cRNAを注射針にロードし、注射針をマイクロマニピュレーターに固定します。
- 露出した卵母細胞(ステップ1.11)を250 μLマイクロドロップ(ステップ2.1)に移します。
- 20倍または40倍の対物レンズの下で、卵母細胞の位置に応じて注射針と保持針の位置と焦点を調整します(図1)。
- マイクロインジェクションユニットをセットアップし、注入圧力(pi)、補償圧力(pc)、および注入時間(ti)を設定して、5〜10 plの mCh-Cep192 cRNAを注入できるようにします(MTOCを外因的に標識するため)。
- 核に触れずに卵母細胞を慎重に注入します。
- すべての卵母細胞を注入したら、CZB + Mの3マイクロドロップで洗浄し、培養皿(CZB + M)に移し、37°Cで3時間インキュベートしてmCh-Cep192を発現させます。
3.卵母細胞の成熟
- 空気中の5%CO2 をインキュベーター内で37°Cで少なくとも3時間予め平衡化したCZB培地にグルタミン(1mM)を添加して成熟培地を調製する。
- 35 mmのペトリ皿に成熟培地を2マイクロドロップ(100 μL)入れ、鉱物油(熟成皿)で覆います。
- 前期I-停止した卵母細胞を100 μLのミリノンフリーCZBマイクロドロップで少なくとも3回洗浄して、ミリノンを完全に除去し、減数分裂の再開を可能にします。
- 卵母細胞を成熟皿に移し、37°Cの空気中に5%CO2 を含む加湿インキュベーター内で5時間(前中期I期)インキュベートする。
4.アブレーションとイメージングのための卵母細胞の準備
- 前中期I卵母細胞(ステップ3.4)を、鉱物油で覆われた100 μLの成熟培地(ステップ3.1)を含むガラス底培養皿に移します。
5.アブレーションのための顕微鏡の準備
- アブレーションの少なくとも30分前に、ステージインキュベーターの温度コントローラー( 材料表を参照)の電源を入れ、37°Cに設定します。
- CO 2コントローラーの電源を入れ、5%CO2に設定します。
- 40倍の油浸アポクロマート対物レンズを選択し、液浸油を少量塗布します。
- ガラス底培養皿を卵母細胞とともにステージトップインキュベーターに取り付け、インキュベーターをガス蓋で覆います。
- 画像取得ソフトウェア( 材料表を参照)で、複数のステージ位置の保存を可能にするオプションを選択します(例:「マークを定義して実験を見つける」)。透過光明視野照明を使用して、個々の卵母細胞を中心に置き、その位置を保存します。
- 画像取得ソフトウェアで、 XYZスキャン モードを選択し、画像形式を 256 x 256 ピクセルに設定し、ズーム係数を 2.5倍〜3.0倍に設定し、スキャン周波数を 600Hzに設定します。これは、約1.6μsのピクセル滞留時間に相当します。
- 488 nmの励起レーザーラインをレーザー出力の約10%(サンプルレベルで4.0 μWに相当)に設定し( 材料表を参照)、500〜550 nmのスペクトル帯域幅を使用してMTOCからのGFP信号を観測します。mCherryタグ付きCep192からの蛍光を同時に観察するには、585 nmの励起レーザーラインをレーザー出力の約8%(サンプルレベルで10.7 μWに相当)に設定し、595-645 nmのスペクトル帯域幅に設定された別の検出器を使用します。
注:共焦点顕微鏡の透過光検出器(TLD)を使用して、卵母細胞の境界を同時に検出すると便利です。 - ライブスキャンモードとzドライブの手動制御を使用して、卵母細胞のMTOCをスクリーニングします。
- mcMTOC が検出されたら、その周りに正方形の関心領域 (ROI) を描画します。
6.MCMTOCのアブレーション
- フェムト秒レーザーを740nmの波長に設定します。
注:レーザーの波長は、顕微鏡とレーザーの条件に応じて変更できます。 - 多光子顕微鏡の電気光学変調器( 材料表を参照)を使用して、サンプル面での70〜80mWの電力に対応するレーザー出力を60%〜70%に設定します。
注意: レーザーにフェムト秒パルス補償器が装備されている場合は、それを使用して群遅延分散(GDD)を補正します。GDD補正は、効率的なmcMTOCアブレーションに必要なレーザー出力の量を減らし、卵母細胞への光損傷を最小限に抑えます。GDD制御は通常、市販の多光子顕微鏡の画像取得ソフトウェアと統合されています。 - 手順 5.6 と同じ画像形式、ズーム倍率、スキャン頻度を使用します。ライン平均化パラメーターとフレーム平均化パラメーターを 1 に設定します。
- ソフトウェアのスキャンボタンをクリックして、選択したROIの単一の レーザースキャンを実行して 、mcMTOCのアブレーションを実行します。
- ステップ5.7のチャンネル設定を使用して、多光子レーザー露光の前後に撮影されたGFP標識構造の画像を比較して、アブレーションの結果を確認します。アブレーションが成功すると、標的mcMTOCのGFP蛍光の強度はバックグラウンドで観察されるレベルまで低下します。
- GFP標識構造の断片が残っている場合は、mcMTOCのさまざまなz平面に焦点を合わせて、手順6.4を1回以上繰り返します。
- ステップ5.7のチャンネル設定を使用して、mcMTOC関連のmCherry信号(mCh-Cep192)の完全な損失によるアブレーション効率を確認します。
- ステップ5.8からステップ6.7を繰り返して、卵母細胞のすべてのMTOCが(さまざまな焦点面で)アブレーションされるまで繰り返します。
注:このプロトコルは、多光子レーザー露光後のmcMTOC枯渇を確認し、GFP蛍光の損失がGFP光退色によって引き起こされる可能性を排除する戦略として mCh-Cep192 マイクロインジェクションを使用します。ただし、このプローブのマイクロインジェクションはオプションであり、アブレーション手順には必要ありません。
Representative Results
多光子レーザーアブレーションは、細胞内構造を選択的にアブレーションする効率的な方法を提供します。現在の研究では、マウス卵母細胞のmcMTOCを選択的に枯渇させるために多光子レーザーアブレーションを採用しました。レーザーアブレーションは、標的mcMTOCの内因性GFP蛍光がバックグラウンドに匹敵するレベルまで減少したことによって示されるように、mcMTOCを効率的に枯渇させました。標的mMTOCの外因性mCh-Cep192もレーザーアブレーション後に廃止されました。mcMTOCのレーザーアブレーションは、卵母細胞内のすべてのmcMTOCが枯渇するように、卵母細胞内の異なる焦点面(mcMTOCが配置されている場所、図 2)で実行する必要があります(図3)。
図1:卵母細胞のマイクロインジェクション。 mCh-Cep192 cRNAによる前期I停止マウス卵母細胞のマイクロインジェクション。スケールバー:10μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウス卵母細胞におけるmcMTOCの枯渇。 単焦点面の代表的な画像。白い四角は、多光子レーザーアブレーション前後のmcMTOCを示しています。スケールバー:40μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウス卵母細胞の異なる焦点面でのmcMTOCの枯渇。 mcMTOCアブレーションマウス卵母細胞の代表的な最大投影画像。スケールバー:20μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:チャトー、ジオメック、バビスター(CZB)および重炭酸塩を含まない最小必須培地(MEM / PVP)の組成物。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
細胞22、23、24、25内の細胞骨格関連構造を乱すための異なる方法が存在する。しかし、細胞の生存率を損なうことなく標的構造を選択的に摂動する効率的な技術を見つけることは困難です。ここで紹介する多光子レーザーアブレーション法は、卵母細胞の生存率を変えることなく、卵母細胞内のmcMTOCに選択的な機械的摂動を誘導する効率的な戦略です。
レーザーアブレーションは、有糸分裂および減数分裂中の染色体分配を制御する分子メカニズムを理解するために広く使用されています22,23,26,27。哺乳類の卵母細胞は体細胞と比較して比較的大きいサイズ(直径>80mm)のため28、それらの細胞内構造の切除は課題となる。さらに、中期I卵母細胞の平均mcMTOC体積は~20 μm15であり、さらなる課題となっています。これらの課題を克服するには、より深い組織浸透を提供する効率的な方法を採用する必要があります。アブレーションに多光子レーザーを使用する主な利点は、オフターゲット効果を最小限に抑えながら、細胞の奥深くまで到達できることです29。
標的構造を枯渇させるレーザーアブレーション法の有効性と効率を検証するには、蛍光標識タンパク質を使用して、経時的(アブレーション前後)に標的構造を特定することが推奨されます23。レーザーアブレーションは構造としてのmcMTOC全体を枯渇させることに注意することが重要ですが、小さなmcMTOCは1回のレーザー露光のみを必要としますが、より大きなmcMTOCは異なる焦点面で複数のレーザー露光を必要とする場合があります。また、コントロールおよびmcMTOCアブレーションされた卵母細胞のサブセットをMTOCマーカー(γチューブリン、ペリセントリン、Cep192など)で固定および免疫標識して、mcMTOCアブレーションの有効性をさらに確認することも推奨されます。対照卵母細胞では、mcMTOCに隣接しているが重なっていない細胞質の領域がレーザーにさらされます。
この実験では、卵母細胞内の異なる焦点面間を移動しながら、いくつかのmcMTOCアブレーションが必要です。したがって、実験を実行する前にこの手法を数回練習して、実験時間を最小限に抑え、それによって卵母細胞の生存率を高めることを強くお勧めします。さらに、卵母細胞の生存率に影響を与えることなくmcMTOCを枯渇させるのに十分な最小レーザー出力を使用することが重要です。
この手法にはいくつかの制限があります。まず、多光子共焦点顕微鏡は、通常の共焦点顕微鏡よりも比較的高価です。第二に、異なる焦点面ですべてのmcMTOCを摂動することは、化学的または遺伝的摂動よりも時間がかかります。第三に、このプロトコルには、すべてのmcMTOCを最短時間でアブレーションするための技術的スキルが必要です。しかし、一度習得すれば、多光子レーザーの使用は、mcMTOCを含むマウス卵母細胞のいくつかの細胞内構造を乱すための優れた戦略を提供し、哺乳類の卵母細胞における紡錘体の位置とそのタイムリーな移動を調節する分子メカニズムの理解に貢献します。
Disclosures
著者は競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、バルブーラ研究所のすべてのメンバーの貴重な助けと議論に感謝したいと思います。著者らは、mCherry-Cep192コンストラクトを親切に共有してくれたMelina Schuhに感謝します。この研究は、AZBへのR35GM142537(NIGMS、NIH)によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID | World precision instrument | TW100F-4 | Injection needles |
| Borosilicate glass | Fisherbrand | Cat# 13-678-20D | |
| Borosilicate glass capillarities | World Precision Instrument | Cat# TW100-6 | Holding needles |
| Bovine serum albumine | MilliporeSigma | Cat# A4503 | |
| Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope | Life Imaging Services GmbH | ||
| Calcium chlrode dihydrate | MilliporeSigma | Cat# C7902 | |
| CO2 controller | Pecon | # 0506.000 | |
| CO2 Cover HP | Pecon | # 0506.020 | |
| DL-Lactic acid | MilliporeSigma | Cat# L7900 | |
| DMi8 | Leica | N/A | Microscope |
| EDTA | MilliporeSigma | Cat# E5134 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | N/A | Microinjector |
| Femtotips Microloader | Fisher scientific | E5242956003 | |
| Gentamicin | MilliporeSigma | Cat# G1272 | |
| Gentamycin | MilliporeSigma | Cat# 1272 | |
| Glass bottom dish | Mat Tek Corporation | Cat# P35G-1.0-20-C | |
| Hepes | MilliporeSigma | Cat# H3784 | |
| Hepes Sodium Salt | MilliporeSigma | Cat # H3784 | |
| Hera Cell vios 160i | Thermo | N/A | CO2 incubator |
| Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B | Leica Microsystems, Inc | N/A | |
| L-Glutamine | MilliporeSigma | Cat#G8540 | |
| Magnesium sulfate dihydrate | MilliporeSigma | Cat# M7774 | |
| MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser | Spectra-Physics | N/A | |
| mCH-Cep192 cRNA | N/A | ||
| Medium Essential Medium Eagle - MEM | MilliporeSigma | Cat #M0258 | |
| Milrinone | MilliporeSigma | Cat# M4659 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | Cat# M5310 | |
| Minimum essential medium eagle (MEM) | MilliporeSigma | Cat# M0268 - 1L | |
| Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1 | N/A | ||
| Petri dish (100 mm) | Fisherbrand | Cat# FB0875712 | |
| Petri dish (35 mm) | Corning | Cat# 430165 | |
| Petri dish (60 mm) | Falcon | Cat# 351007 | |
| Phenol Red | MilliporeSigma | Cat# P5530 | |
| Polyvinylpyrolidone | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Polyvinylpyrolidone (PVP) | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Potassium chloride | MilliporeSigma | Cat# P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | MilliporeSigma | Cat# P5655 | |
| Pregnant mare´s serum gonadotropin | Lee BioSolutions | Cat# 493-10-10 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Sewing needles | D.M.C | N/A | N° 5 * 16 Needles |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | Cat# S5761 | |
| Sodium chloride | MilliporeSigma | Cat# S5886 | |
| Stage-top heating insert P | Pecon | # 0426.300 | |
| Sterezoom S9i | Leica | N/A | Stereomicroscope |
| Syringe 1 mL | BD company | Cat# 309597 | |
| Taurine | MilliporeSigma | Cat# T0625 | |
| Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital | Pecon | # 0503.000 | |
| The Cube temperature controller for the cage incubator | Life Imaging Services GmbH |
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