Een schaalbare, op cellen gebaseerde methode voor de functionele beoordeling van Ube3a-varianten
Summary
Een eenvoudige en schaalbare methode werd ontwikkeld om de functionele betekenis van missense-varianten in Ube3a te beoordelen, een gen waarvan het verlies en de winst van functie verband houden met zowel het Angelman-syndroom als de autismespectrumstoornis.
Abstract
Het toegenomen gebruik van sequencing in de geneeskunde heeft miljoenen coderende varianten in het menselijk genoom geïdentificeerd. Veel van deze varianten komen voor in genen die geassocieerd zijn met neurologische ontwikkelingsstoornissen, maar de functionele betekenis van de overgrote meerderheid van de varianten blijft onbekend. Het huidige protocol beschrijft de studie van varianten voor Ube3a, een gen dat codeert voor een E3 ubiquitine ligase gekoppeld aan zowel autisme als angelmansyndroom. Duplicatie of drievoud van Ube3a is sterk gekoppeld aan autisme, terwijl de deletie ervan het Angelman-syndroom veroorzaakt. Het begrijpen van de valentie van veranderingen in UBE3A-eiwitactiviteit is dus belangrijk voor klinische resultaten. Hier wordt een snelle, op cellen gebaseerde methode beschreven die Ube3a-varianten koppelt aan een Wnt-padverslaggever. Deze eenvoudige test is schaalbaar en kan worden gebruikt om de valentie en omvang van activiteitsveranderingen in elke Ube3a-variant te bepalen. Bovendien maakt de faciliteit van deze methode het mogelijk om een schat aan structuurfunctie-informatie te genereren, die kan worden gebruikt om diepgaande inzichten te krijgen in de enzymatische mechanismen van UBE3A.
Introduction
Recente technologische ontwikkelingen hebben de sequencing van exomen en genomen routine gemaakt in klinische omgevingen 1,2. Dit heeft geleid tot de ontdekking van een groot aantal genetische varianten, waaronder miljoenen missense-varianten die meestal één aminozuur in een eiwit veranderen. Het begrijpen van de functionele betekenis van deze varianten blijft een uitdaging, en slechts een klein deel (~2%) van de bekende missense varianten heeft een klinische interpretatie 1,3.
Een prominent voorbeeld van dit probleem is Ube3a, een gen dat codeert voor een E3-ubiquitineligase dat zich richt op substraateiwitten voor afbraak4. Ube3a bevindt zich binnen chromosoom 15q11-13 en wordt uitsluitend uitgedrukt uit het maternale erfelijke allel 5,6,7. Observaties uit de ziektegenetica suggereren sterk dat onvoldoende of overmatige activiteit van het UBE3A-enzym verschillende neurologische ontwikkelingsstoornissen veroorzaakt. Deletie van maternale chromosoom 15q11-13 veroorzaakt Angelman-syndroom (AS)8, een aandoening die wordt gekenmerkt door ernstige intellectuele achterstand, motorische stoornissen, epileptische aanvallen, een gelukkige houding met frequent glimlachen en dysmorfe gelaatstrekken 8,9,10. Daarentegen veroorzaakt duplicatie of tripplicatie van maternale chromosoom 15q11-13 het Dup15q-syndroom, een heterogene aandoening die wordt erkend als een van de meest voorkomende syndromale vormen van autisme 11,12,13. Bovendien zijn er honderden missense-varianten geïdentificeerd in Ube3a, waarvan de meerderheid wordt beschouwd als varianten van onzekere betekenis (VUS) omdat hun functionele en klinische betekenis onbekend zijn. Er is dus veel interesse in het ontwikkelen van methoden die Ube3a-varianten empirisch kunnen beoordelen om te bepalen of ze bijdragen aan neurologische ontwikkelingsziekten.
Het UBE3A-enzym behoort tot de HECT-domeinfamilie (homoloog aan E6-AP C-terminus) van E3-ubiquitine-ligases die allemaal het gelijknamige HECT-domein bezitten, dat de biochemische machinerie bevat die nodig is om geactiveerd ubiquitine uit E2-enzymen te accepteren en over te brengen naar substraateiwitten14. Historisch gezien is de karakterisering van E3-enzymen gebaseerd op gereconstitueerde in vitro systemen die een ensemble van gezuiverde eiwitten vereisen 4,15,16. Dergelijke methoden zijn traag en arbeidsintensief en niet vatbaar voor het beoordelen van de activiteit van een groot aantal varianten. In eerder werk werd UBE3A geïdentificeerd om de Wnt-route in HEK293T-cellen te activeren door de functie van het proteasoom te moduleren om de afbraak van β-catenine17 te vertragen. Dit inzicht maakt het gebruik van Wnt-pathway-verslaggevers mogelijk als een efficiënte en snelle methode om zowel verlies- als gain-of-function-varianten van Ube3a18 te identificeren. Het onderstaande protocol beschrijft in detail een methode om Ube3a-varianten te genereren, evenals een op luciferase gebaseerde verslaggever om veranderingen in de activiteit van Ube3a-varianten te beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol biedt een efficiënte en schaalbare methode om de enzymatische activiteit van Ube3a-varianten te beoordelen. Er zijn verschillende technische details die een zorgvuldige overweging rechtvaardigen bij het gebruik van deze test. Een overweging is de keuze van Wnt reporter plasmiden die in deze test worden gebruikt. Het hier beschreven protocol maakt specifiek gebruik van de β-catenine activated reporter (BAR)21, een reporter die een concatemeer van 12 T-cell fa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; J.J.Y.), een NARSAD Young Investigator Award van de Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), een Research Fellowship van de Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.), en onderzoeksbeurzen van de Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), de Whitehall Foundation (J.J.Y.) en de NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
Referências
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
