Eine skalierbare, zellbasierte Methode zur funktionellen Bewertung von Ube3a-Varianten
Summary
Eine einfache und skalierbare Methode wurde entwickelt, um die funktionelle Bedeutung von Missense-Varianten in Ube3a zu bewerten, einem Gen, dessen Verlust und Funktionsgewinn sowohl mit dem Angelman-Syndrom als auch mit der Autismus-Spektrum-Störung verbunden sind.
Abstract
Der verstärkte Einsatz von Sequenzierung in der Medizin hat Millionen von kodierenden Varianten im menschlichen Genom identifiziert. Viele dieser Varianten kommen in Genen vor, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, aber die funktionelle Bedeutung der überwiegenden Mehrheit der Varianten bleibt unbekannt. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung von Varianten für Ube3a, ein Gen, das eine E3-Ubiquitin-Ligase kodiert, die sowohl mit Autismus als auch mit Angelman-Syndrom verbunden ist. Die Duplikation oder Verdreifachung von Ube3a ist stark mit Autismus verbunden, während seine Deletion das Angelman-Syndrom verursacht. Daher ist das Verständnis der Valenz von Veränderungen der UBE3A-Proteinaktivität wichtig für klinische Ergebnisse. Hier wird eine schnelle, zellbasierte Methode beschrieben, die Ube3a-Varianten mit einem Wnt-Signalweg-Reporter paart. Dieser einfache Assay ist skalierbar und kann verwendet werden, um die Wertigkeit und das Ausmaß von Aktivitätsänderungen in jeder Ube3a-Variante zu bestimmen. Darüber hinaus ermöglicht die Einrichtung dieser Methode die Generierung einer Fülle von Struktur-Funktions-Informationen, die verwendet werden können, um tiefe Einblicke in die enzymatischen Mechanismen von UBE3A zu gewinnen.
Introduction
Jüngste technologische Fortschritte haben die Sequenzierung von Exomen und Genomen in klinischen Umgebungen zur Routine gemacht 1,2. Dies hat zur Entdeckung einer großen Anzahl genetischer Varianten geführt, darunter Millionen von Missense-Varianten, die typischerweise eine Aminosäure in einem Protein verändern. Das Verständnis der funktionellen Bedeutung dieser Varianten bleibt eine Herausforderung, und nur ein kleiner Bruchteil (~2%) der bekannten Missense-Varianten hat eine klinische Interpretation 1,3.
Ein prominentes Beispiel für dieses Problem ist Ube3a, ein Gen, das für eine E3-Ubiquitin-Ligase kodiert, die auf Substratproteine für den Abbauabzielt 4. Ube3a befindet sich auf Chromosom 15q11-13 und wird ausschließlich aus dem mütterlich vererbten Allel 5,6,7 exprimiert. Beobachtungen aus der Krankheitsgenetik deuten stark darauf hin, dass eine unzureichende oder übermäßige Aktivität des UBE3A-Enzyms unterschiedliche neurologische Entwicklungsstörungen verursacht. Die Deletion des mütterlichen Chromosoms 15q11-13 verursacht das Angelman-Syndrom (AS)8, eine Störung, die durch schwere geistige Behinderung, motorische Beeinträchtigungen, Krampfanfälle, ein fröhliches Auftreten mit häufigem Lächeln und dysmorphe Gesichtszüge gekennzeichnetist 8,9,10. Im Gegensatz dazu verursacht die Duplikation oder Verdreifachung des mütterlichen Chromosoms 15q11-13 das Dup15q-Syndrom, eine heterogene Erkrankung, die als eine der häufigsten syndromalen Formen von Autismus anerkanntwird 11,12,13. Darüber hinaus gibt es Hunderte von Missense-Varianten, die in Ube3a identifiziert wurden, von denen die meisten als Varianten von ungewisser Signifikanz (VUS) gelten, da ihre funktionelle und klinische Bedeutung unbekannt ist. Daher besteht ein erhebliches Interesse an der Entwicklung von Methoden, die Ube3a-Varianten empirisch bewerten können, um festzustellen, ob sie zu neurologischen Entwicklungsstörungen beitragen.
Das UBE3A-Enzym gehört zur HECT-Domänenfamilie (homolog to E6-AP C-terminus) von E3-Ubiquitin-Ligasen, die alle die gleichnamige HECT-Domäne besitzen, die die biochemische Maschinerie enthält, die notwendig ist, um aktiviertes Ubiquitin von E2-Enzymen aufzunehmen und auf Substratproteine zu übertragen14. In der Vergangenheit stützte sich die Charakterisierung von E3-Enzymen auf rekonstituierte In-vitro-Systeme, die ein Ensemble gereinigter Proteineerfordern 4,15,16. Solche Methoden sind langsam und arbeitsintensiv und können die Aktivität einer großen Anzahl von Varianten nicht beurteilen. In früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass UBE3A den Wnt-Signalweg in HEK293T-Zellen aktiviert, indem es die Funktion des Proteasoms moduliert, um den Abbau von β-Catenin17 zu verlangsamen. Diese Erkenntnis ermöglicht den Einsatz von Wnt-Signalwegreportern als effiziente und schnelle Methode, um sowohl Loss- als auch Gain-of-Function-Varianten von Ube3a18 zu identifizieren. Das folgende Protokoll beschreibt detailliert eine Methode zur Erzeugung von Ube3a-Varianten sowie einen Luciferase-basierten Reporter zur Beurteilung von Veränderungen in der Aktivität von Ube3a-Varianten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll bietet eine effiziente und skalierbare Methode zur Beurteilung der enzymatischen Aktivität von Ube3a-Varianten. Es gibt mehrere technische Details, die bei der Verwendung dieses Assays sorgfältig berücksichtigt werden sollten. Eine Überlegung ist die Wahl der Wnt-Reporterplasmide, die in diesem Assay verwendet werden. Das hier beschriebene Protokoll verwendet speziell den β-Catenin-aktivierten Reporter (BAR)21, einen Reporter, der ein Konkatemer aus 12…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; J.J.Y.), einen NARSAD Young Investigator Award der Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), ein Forschungsstipendium der Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.) und Forschungsstipendien der Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), der Whitehall Foundation (J.J.Y.) und des NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
Referências
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