Morfologisk och kompositionell analys av neutrofila extracellulära fällor inducerade av mikrobiella och kemiska stimuli
Summary
Här presenteras ett protokoll för induktion och analys av in vitro neutrofila extracellulära fällor (NET). Kvantifiering av DNA, kathelicidin (LL37) och enzymaktivitet gav data som visar variationen i sammansättningen och morfologin hos NET inducerad av mikrobiella och kemiska stimuli under liknande kontrollerade förhållanden.
Abstract
Neutrofiler fungerar som den första linjen av cellulärt försvar i ett medfött immunsvar genom att använda olika mekanismer, såsom bildandet av neutrofila extracellulära fällor (NET). Denna studie analyserar de morfologiska och kompositionella förändringarna i NET inducerade av mikrobiella och kemiska stimuli med hjälp av standardiserade in vitro-metoder för NET-induktion och karakterisering med mänskliga celler. De förfaranden som beskrivs här möjliggör analys av NET-morfologi (lytisk eller icke-lytisk) och komposition (DNA-proteinstrukturer och enzymatisk aktivitet) och effekten av lösliga faktorer eller cellulär kontakt på sådana egenskaper. Dessutom kan de tekniker som beskrivs här modifieras för att utvärdera effekten av exogena lösliga faktorer eller cellulär kontakt på NET-kompositionen.
De tillämpade teknikerna inkluderar rening av polymorfonukleära celler från humant perifert blod med hjälp av en dubbeldensitetsgradient (1,079-1,098 g / ml), vilket garanterar optimal renhet och livskraft (≥ 95%) vilket demonstreras av Wrights färgning, trypanblå uteslutning och flödescytometri, inklusive FSC kontra SSC-analys och 7AAD-färgning. NET-bildning induceras med mikrobiella (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus och Candida albicans) och kemiska (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, och NETs kännetecknas av DNA-DAPI-färgning, immunfärgning för den antimikrobiella peptiden cathelicidin (LL37) och kvantifiering av enzymatisk aktivitet (neutrofilt elastas, cathepsin G och myeloperoxidas). Bilderna förvärvas genom fluorescensmikroskopi och analyseras med ImageJ.
Introduction
Neutrofiler är de vanligaste leukocyterna i blodomloppet och spelar en viktig roll under clearance av patogena medel genom flera mekanismer, inklusive frisättning av stora kromatinstrukturer som består av DNA och flera nukleära, cytoplasmatiska och granulära antibakteriella proteiner 1,2. Den direkta antecedenten som beskriver denna antimikrobiella roll av neutrofiler gjordes av Takei et al.3 1996. Dessa författare rapporterade en ny form av död som skiljer sig från apoptos och nekroptos hos neutrofiler, visade morfologiska förändringar som uppvisade kärnbrott, följt av spillning ur nukleoplasman i cytoplasman och en ökning av membranpermeabiliteten från 3 timmars inkubation med forbolmyristatacetat (PMA)2,3. Det var dock inte förrän 2004 som termen “neutrofila extracellulära fällor (NET)” användes4.
NET-bildning har observerats under olika förhållanden, såsom bakteriella, svamp5, virus6 och parasitinfektioner, för att neutralisera, döda och förhindra mikrobiell spridning7. Andra studier visar att det också kan förekomma vid icke-patogena tillstånd genom sterila stimuli, såsom cytokiner, mononatrium urinsyra eller kolesterolkristaller, autoantikroppar, immunkomplex och aktiverade blodplättar7. Lipopolysackarid (LPS), interleukin-8 (IL-8) och PMA var bland de första in vitro-stimuli som beskrivs som NET-inducerare, och in vivo NET-involvering i patogena processer demonstrerades i två modeller av akut inflammation: experimentell dysenteri och spontan human blindtarmsinflammation4. DNA är en viktig NET-komponent. Dess lämpliga struktur och sammansättning är nödvändiga för att binda och döda mikroorganismer genom att leverera en hög lokal koncentration av antimikrobiella molekyler mot de fångade mikroberna, vilket framgår av en kort deoxiribonukleasbehandling (DNase) som sönderdelar NET och deras mikrobicida egenskaper4. Förutom DNA består NET av bundna proteiner såsom histoner, neutrofilt elastas (NE), cathepsin G (CG), proteinas 3, laktoferrin, gelatinas, myeloperoxidas (MPO) och antimikrobiella peptider (AMP) såsom den katjoniska proinflammatoriska peptiden cathelicidin LL-37 bland andra 8,9. Sådana aggregat kan bilda större trådar med diametrar upp till 50 nm. Dessa faktorer kan störa de mikrobiella virulensfaktorerna eller patogencellmembranets integritet; Dessutom kan AMP: erna stabilisera det NET-härledda DNA: t mot nedbrytning av bakteriella nukleaser10.
De specifika mekanismer som reglerar NET-bildning har ännu inte klargjorts fullständigt. Den bäst karakteriserade vägen som leder till NET-frisättning är genom ERK-signalering, vilket leder till NADPH-oxidasaktivering och produktion av reaktiva syrearter (ROS), samt ökat intracellulärt kalcium som utlöser aktivering av MPO-vägen. Detta omvandlar i sin tur väteperoxid till hypoklorsyra och aktiverar NE genom oxidation11,12. NE är ansvarig för att bryta ner cytoskelettens aktinfilament för att blockera fagocytos och translokera dem till kärnan för bearbetning genom proteolytisk klyvning och deaminering av PAD4 som driver desensibiliseringen av kromatinfibrer, som associerar med granulat och cytoplasmatiska proteiner, och frigörs sedan extracellulärt7. Dessa proteaser innefattar de som frigörs från azurosomkomplexet av azurofilgranulerna och andra proteaser, såsom cathepsin G13.
Beroende på de morfologiska förändringarna i neutrofiler klassificeras NET i två typer: suicidal eller lytisk NET-bildning som leder till celldöd4 och vital eller icke-lytisk NET-bildning producerad av livskraftiga celler medierade av en vesikulär frisättning av kärn- eller mitokondriellt DNA, med en rest av en anucleated cytoplast med fagocytisk förmåga14,15. I allmänhet presenterar NETs som består av mitokondriellt DNA en långsträckt fiber14-morfologi, medan de som är strukturerade av kärn-DNA har ett molnliknande utseende3. Det är emellertid inte känt hur neutrofilen väljer sitt DNA-ursprung. I motsats till tidigare studier som beskrev de kanoniska vägarna för NETs som kräver flera timmar, aktiveras den vitala vägen snabbt på bara 5-60 min15.
Trots dessa framsteg varierar NET-sammansättningen beroende på stimulansen; till exempel inducerar olika mucoid- och icke-mucoidstammar av P. aeruginosa bildandet av NET innehållande 33 vanliga proteiner och upp till 50 variabla proteiner7. Således är det nödvändigt att homogenisera tekniker som möjliggör generering av objektiva slutsatser i forskargrupper. Detta papper beskriver ett protokoll med olika tekniker som möjliggör jämförelse och utvärdering av sammansättningen, strukturen och morfologin hos NETs inducerad med olika mikroorganismer: Staphylococcus aureus (grampositiv bakterie), Pseudomonas aeruginosa (gramnegativ bakterie) och Candida albicans (svamp), liksom kemiska stimuli (PMA, HOCl) i humana neutrofiler från friska individer. De representativa resultaten visar heterogeniteten hos NETs beroende på deras inducerande stimulans under jämförbara in vitro-förhållanden, kännetecknade av DNA-DAPI-färgning, immunfärgning för LL37 och kvantifiering av enzymatisk aktivitet (NE, CG och MPO).
Protocol
Representative Results
Discussion
En mycket ren population av viabla neutrofiler måste erhållas för att inducera frisättning av NET eftersom dessa celler har en begränsad ex vivo-livslängd på i genomsnitt 8 timmar, en period inom vilken alla experiment måste utföras. För detta ändamål är den ideala metoden dubbeldensitetsgradienten för att optimera reningstiden genom att isolera icke-aktiverade celler som är mer mottagliga för exogen stimulering, i motsats till Ficoll-Histopaque-gradient eller Dextran sedimenteringstekniker<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett grundvetenskapligt bidrag (#285480) från CONACyT och av institutionen för klinisk immunologiforskning vid fakulteten för biokemiska vetenskaper, Universidad Autónoma ‘Benito Juárez’ de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L och W.J.R.R. har doktorandstipendier med CONACyT-nummer #799779, #660793 respektive #827788.
Materials
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL – Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory – CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
References
- De Buhr, N., Maren, K. B. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. eLife. 6, 24437 (2017).
- Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection. Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Delgado-Rizo, V., et al. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview. Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).
- Petretto, A., et al. Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis. PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).
- Neumann, A., et al. Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases. Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Sabbatini, M., Magnelli, V., Renò, F. NETosis in wound healing: When enough Is enough. Cells. 10 (3), 494 (2021).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).
- Clark, S. R., et al. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Sosa, S. A., et al. Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus. Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).
- White, P. C., et al. Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).
