Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi
Summary
Burada in vitro nötrofil hücre dışı tuzakların (NET’ler) indüksiyonu ve analizi için bir protokol sunulmaktadır. DNA, katelisidin (LL37) ve enzim aktivitesinin nicelleştirilmesi, benzer kontrollü koşullar altında mikrobiyal ve kimyasal uyaranlar tarafından indüklenen NET’lerin bileşimindeki ve morfolojisindeki değişkenliği gösteren veriler vermiştir.
Abstract
Nötrofiller, nötrofil hücre dışı tuzakların (NET’ler) oluşumu gibi çeşitli mekanizmalar kullanarak doğuştan gelen bir bağışıklık tepkisinde hücresel savunmanın ilk hattı olarak işlev görür. Bu çalışma, mikrobiyal ve kimyasal uyaranların neden olduğu NET’lerdeki morfolojik ve bileşimsel değişiklikleri, NET indüksiyonu ve insan hücreleri ile karakterizasyonu için standartlaştırılmış in vitro metodolojiler kullanarak analiz etmektedir. Burada açıklanan prosedürler, NET morfolojisinin (litik veya litik olmayan) ve kompozisyonun (DNA-protein yapıları ve enzimatik aktivite) analizine ve çözünür faktörlerin veya hücresel temasın bu özellikler üzerindeki etkisine izin verir. Ek olarak, burada açıklanan teknikler, eksojen çözünür faktörlerin veya hücresel temasın NET bileşimi üzerindeki etkisini değerlendirmek için değiştirilebilir.
Uygulanan teknikler, polimorfonükleer hücrelerin çift yoğunluklu bir gradyan (1.079-1.098 g / mL) kullanılarak insan periferik kanından saflaştırılmasını, Wright’ın boyanması, tripan mavisi dışlaması ve FSC’ye karşı SSC analizi ve 7AAD boyama dahil olmak üzere akış sitometrisi ile gösterildiği gibi optimum saflık ve canlılığı (≥% 95) garanti etmeyi içerir. NET oluşumu mikrobiyal (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ve Candida albicans) ve kimyasal (forbol miristat asetat, HOCl) uyaranlarla indüklenir ve NET’ler DNA-DAPI boyaması, antimikrobiyal peptid katelisidin (LL37) için immün boyama ve enzimatik aktivitenin (nötrofil elastaz, kathepsin G ve miyeloperoksidaz) nicelleştirilmesi ile karakterize edilir. Görüntüler floresan mikroskopi ile elde edilir ve ImageJ ile analiz edilir.
Introduction
Nötrofiller, kan dolaşımındaki en bol lökositlerdir ve patojenik ajanların, DNA ve birkaç nükleer, sitoplazmik ve granüler antibakteriyel proteinden oluşan büyük kromatin yapılarının salınması da dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalarla temizlenmesi sırasında önemli bir rol oynarlar 1,2. Nötrofillerin bu antimikrobiyal rolünü tanımlayan doğrudan öncül, 1996 yılında Takei ve ark.3 tarafından yapılmıştır. Bu yazarlar, nötrofillerde apoptoz ve nekroptozdan farklı yeni bir ölüm şekli bildirmiş, nükleer rüptür sergileyen morfolojik değişiklikler göstermiş, bunu nükleoplazmadan sitoplazmaya dökülmeyi ve forbol miristat asetat (PMA) ile 3 saatlik inkübasyondan membran geçirgenliğinde bir artış göstermiştir 2,3. Bununla birlikte, 2004 yılına kadar “nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET’ler)” teriminin kullanıldığı4.
NET oluşumu, mikrobiyal yayılımı nötralize etmek, öldürmek ve önlemek için bakteriyel, fungal5, viral6 ve paraziter enfeksiyonlar gibi çeşitli koşullarda gözlenmiştir7. Diğer çalışmalar, patojenik olmayan koşullarda, sitokinler, monosodyum ürik asit veya kolesterol kristalleri, otoantikorlar, bağışıklık kompleksleri ve aktif trombositler gibi steril uyaranlarla da ortaya çıkabileceğini göstermektedir7. Lipopolisakkarit (LPS), interlökin-8 (IL-8) ve PMA, NET indükleyicileri olarak tanımlanan ilk in vitro uyaranlar arasındaydı ve patojenik süreçlerdeki in vivo NET katılımı iki akut inflamasyon modelinde gösterilmiştir: deneysel dizanteri ve spontan insan apandisiti4. DNA önemli bir NET bileşenidir. Uygun yapısı ve bileşimi, NET’leri ve mikrobisidal özelliklerini parçalayan kısa bir deoksiribonükleaz (DNaz) tedavisi ile gösterildiği gibi, yakalanan mikroplara karşı yüksek bir lokal antimikrobiyal molekül konsantrasyonu sağlayarak mikroorganizmaların tutulması ve öldürülmesi için gereklidir4. DNA’nın yanı sıra, NET’ler histonlar, nötrofil elastaz (NE), kathepsin G (CG), proteinaz 3, laktoferrin, jelatinaz, miyeloperoksidaz (MPO) ve katyonik pro-inflamatuar peptid katelisidin LL-37 gibi antimikrobiyal peptitler (AMP’ler) gibi bağlı proteinleri içerir 8,9. Bu tür agregalar, 50 nm’ye kadar çaplara sahip daha büyük dişler oluşturabilir. Bu faktörler mikrobiyal virülans faktörlerini veya patojen hücre zarının bütünlüğünü bozabilir; Ek olarak, AMP’ler NET kaynaklı DNA’yı bakteriyel nükleazlar tarafından bozulmaya karşı stabilize edebilir10.
NET oluşumunu düzenleyen spesifik mekanizmalar henüz tam olarak açıklığa kavuşturulmamıştır. NET salınımına yol açan en iyi karakterize yol, NADPH oksidaz aktivasyonu ve reaktif oksijen türleri (ROS) üretiminin yanı sıra MPO yolunun aktivasyonunu tetikleyen hücre içi kalsiyumun artmasına yol açan ERK sinyallemesidir. Bu da hidrojen peroksiti hipokloröz aside dönüştürür ve NE’yi oksidasyon11,12 ile aktive eder. NE, fagositozu bloke etmek için sitoiskeletin aktin filamentlerinin parçalanmasından ve granül ve sitoplazmik proteinlerle ilişkili kromatin liflerinin duyarsızlaştırılmasını sağlayan ve daha sonra hücre dışı olarak salınan PAD4 ile proteolitik bölünme ve deaminasyon ile işlenmek üzere çekirdeğe taşınmasından sorumludur7. Bu proteazlar, azurofil granüllerinin azurozom kompleksinden ve kathepsin G13 gibi diğer proteazlardan salınanları içerir.
Nötrofillerdeki morfolojik değişikliklere bağlı olarak, NET’ler iki tipte sınıflandırılır: hücre ölümüne yol açan intihar veya litik NET oluşumu4 ve nükleer veya mitokondriyal DNA’nın veziküler salınımının aracılık ettiği canlı hücreler tarafından üretilen hayati veya litik olmayan NET oluşumu, fagositik kapasiteye sahip bir anüklee sitoplastın kalıntısı14,15. Genel olarak, mitokondriyal DNA’dan oluşan NET’ler uzatılmış bir lif14 morfolojisi sunarken, nükleer DNA’dan yapılandırılmış olanlar bulut benzeri bir görünüme sahiptir3. Bununla birlikte, nötrofilin DNA kökenini nasıl seçtiği bilinmemektedir. NET’lerin kanonik yollarını birkaç saat gerektirdiğini tanımlayan önceki çalışmaların aksine, hayati yol sadece 5-60 dakika15’te hızla aktive edilir.
Bu ilerlemelere rağmen, NET bileşimi uyarana bağlı olarak değişir; Örneğin, P. aeruginosa’nın farklı mukoid ve mukoid olmayan suşları, 33 ortak protein ve 50’ye kadar değişken proteiniçeren NET’lerin oluşumunu indükler. Bu nedenle, araştırma gruplarında nesnel sonuçların üretilmesine izin veren teknikleri homojenize etmek gerekir. Bu yazıda, farklı mikroorganizmalarla indüklenen NET’lerin bileşiminin, yapısının ve morfolojisinin karşılaştırılmasına ve değerlendirilmesine olanak tanıyan çeşitli tekniklerle bir protokol açıklanmaktadır: Staphylococcus aureus (gram-pozitif bakteri), Pseudomonas aeruginosa (gram-negatif bakteri) ve Candida albicans (mantar) ve sağlıklı bireylerden gelen insan nötrofillerinde kimyasal uyaranlar (PMA, HOCl). Temsili sonuçlar, DNA-DAPI boyaması, LL37 için immün boyama ve enzimatik aktivitenin (NE, CG ve MPO) nicelleştirilmesi ile karakterize edilen karşılaştırılabilir in vitro koşullar altında indükleyici uyaranlarına bağlı olarak NET’lerin heterojenliğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
NET’lerin salınımını indüklemek için oldukça saf bir canlı nötrofil popülasyonu elde edilmelidir, çünkü bu hücreler ortalama 8 saatlik sınırlı bir ex vivo ömre sahiptir, bu da tüm deneylerin yapılması gereken bir süredir. Bu amaçla, ideal metodoloji, Ficoll-Histopaque gradyanı veya Dextran sedimantasyon tekniklerinin aksine, eksojen stimülasyona daha duyarlı aktive olmayan hücreleri izole ederek saflaştırma süresini optimize etmek için çift yoğunluklu gradyandır<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, CONACyT’den bir temel bilim hibesi (#285480) ve Universidad Autónoma ‘Benito Juárez’ de Oaxaca Biyokimyasal Bilimler Fakültesi Klinik İmmünoloji Araştırma Bölümü tarafından desteklenmiştir. A.A.A, S.A.S.L ve W.J.R.R., sırasıyla #799779, #660793 ve #827788 CONACyT numaralarının doktora burslarına sahiptir.
Materials
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL – Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory – CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
References
- De Buhr, N., Maren, K. B. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. eLife. 6, 24437 (2017).
- Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection. Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Delgado-Rizo, V., et al. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview. Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).
- Petretto, A., et al. Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis. PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).
- Neumann, A., et al. Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases. Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Sabbatini, M., Magnelli, V., Renò, F. NETosis in wound healing: When enough Is enough. Cells. 10 (3), 494 (2021).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).
- Clark, S. R., et al. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Sosa, S. A., et al. Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus. Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).
- White, P. C., et al. Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).
