微生物和化学刺激诱导的中性粒细胞胞外陷阱的形态学和组成分析

Summary

这里介绍的是用于体外中性粒细胞细胞 外 陷阱（NET）的诱导和分析方案。对DNA，cathelicidin（LL37）和酶活性的定量产生了数据，这些数据显示了在类似受控条件下由微生物和化学刺激诱导的NET的组成和形态的变化。

Abstract

中性粒细胞通过采用多种机制（例如中性粒细胞细胞外陷阱（NET）的形成）作为先天免疫反应的第一道细胞防御线。本研究使用标准化的 体外 方法分析了微生物和化学刺激诱导的NETs的形态和组成变化，用于人体细胞的NET诱导和表征。这里描述的程序允许分析NET形态（裂解或非裂解）和组成（DNA-蛋白质结构和酶活性），以及可溶性因子或细胞接触对这些特征的影响。此外，可以修改此处描述的技术以评估外源性可溶性因子或细胞接触对NET组成的影响。

应用的技术包括使用双密度梯度（1.079-1.098 g/mL）从人外周血纯化多形核细胞，保证最佳纯度和活力（≥95%），如Wright染色，台盼蓝排除和流式细胞术（包括FSC与SSC分析和7AAD染色）所示。通过微生物（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和 白色念珠菌）和化学（醋酸佛波肉豆蔻酸酯，HOCl）刺激诱导NET形成，NET的特征是DNA-DAPI染色，抗菌肽cathelicidin（LL37）的免疫染色以及酶活性（中性粒细胞弹性蛋白酶，组织蛋白酶G和髓过氧化物酶）的定量。通过荧光显微镜获取图像并使用ImageJ进行分析。

Introduction

中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞，在通过多种机制清除致病剂的过程中起着至关重要的作用，包括释放由DNA和几种核，细胞质和颗粒抗菌蛋白组成的大染色质结构^1，2。描述中性粒细胞这种抗菌作用的直接前因是由Takei等人于1996^年提出的。这些作者报告了一种不同于中性粒细胞凋亡和坏死性凋亡的新死亡形式，表现出表现出核破裂的形态变化，然后从核质溢出到细胞质中，并且膜通透性从与佛波肉豆蔻酸酯（PMA^）孵育3小时后增加2^，3。然而，直到2004年才使用术语“中性粒细胞细胞外陷阱（NET）”⁴。

在细菌、真菌⁵、病毒⁶ 和寄生虫感染等各种条件下观察到 NET 形成，用于中和、杀死和防止微生物传播⁷。其他研究表明，它也可以通过无菌刺激在非致病条件下发生，例如细胞因子、尿酸单钠或胆固醇晶体、自身抗体、免疫复合物和活化的血小板⁷.脂多糖（LPS），白细胞介素-8（IL-8）和PMA是最早被描述为NET诱导剂的 体外 刺激，并且在两种急性炎症模型中 证明了体内 NET参与致病过程：实验性痢疾和自发性人阑尾炎⁴。DNA是必不可少的NET成分。其适当的结构和组成对于通过向捕获的微生物提供高局部浓度的抗菌分子来隔离和杀死微生物是必要的，正如分解NET及其杀^{微生物特性的}简短脱氧核糖核酸酶（DNase）处理所证明的那样4。除 DNA 外，NET 还包括附着蛋白，例如组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶 （NE）、组织蛋白酶 G （CG）、蛋白酶 3、乳铁蛋白、明胶酶、髓过氧化物酶 （MPO） 和抗菌肽 （AMP），例如阳离子促炎肽 cathelicidin LL-37 等^8，9。这种聚集体可以形成直径达50nm的较大螺纹。这些因素可以破坏微生物毒力因子或病原体细胞膜的完整性;此外，AMPs可以稳定NET衍生的DNA，防止细菌核酸酶降解¹⁰。

调控NET形成的具体机制尚未完全明确。导致NET释放的最佳特征途径是通过ERK信号传导，这导致NADPH氧化酶活化和活性氧（ROS）产生，以及触发MPO途径激活的细胞内钙增加。这反过来将过氧化氢转化为次氯酸，通过氧化^{激活NE 11，12}。NE负责降解细胞骨架的肌动蛋白丝以阻断吞噬作用，并将它们转移到细胞核中，通过蛋白水解切割和PAD4脱氨进行处理，PAD4驱动染色质纤维脱敏，染色质纤维与颗粒和细胞质蛋白结合，然后细胞外释放^7。这些蛋白酶包括从藜红细胞颗粒的azurosome复合物释放的蛋白酶和其他蛋白酶（例如组织蛋白酶G¹³）。

根据中性粒细胞的形态变化，NET分为两种类型：导致^{细胞死亡的}自杀性或溶解性NET形成4，以及由核或线粒体DNA囊泡释放介导的活细胞产生的重要或非溶解NET形成，具有吞噬能力的无核细胞质体的残余^14，15。通常，由线粒体DNA组成的NETs呈现细长的纤维¹⁴ 形态，而由核DNA结构的NET具有云状外观³。然而，目前尚不清楚中性粒细胞如何选择其DNA起源。与先前将NET的规范途径描述为需要几个小时的研究相反，重要途径在5-60分钟内迅速激活¹⁵。

尽管取得了这些进展，但NET的组成因刺激措施而异;例如，铜绿假单胞菌的不同粘液和非粘液菌株诱导含有33种常见蛋白质和多达50种^{可变蛋白质的}NETs的形成7。因此，有必要使允许在研究小组中产生客观结论的技术同质化。本文描述了一种具有各种技术的协议，可以比较和评估由不同微生物诱导的NET的组成，结构和形态：金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌），铜绿假单胞菌（革兰氏阴性细菌）和白色念珠菌（真菌），以及来自健康个体的人中性粒细胞中的化学刺激（PMA，HOCl）。代表性结果表明，NETs的异质性取决于其在可比体外条件下的诱导刺激，其特征在于DNA-DAPI染色，LL37免疫染色和酶活性定量（NE，CG和MPO）。

Protocol

血液样本是在知情同意后从临床健康受试者那里作为捐赠获得的。所有实验均在瓦哈卡自治大学“贝尼托·华雷斯”生物化学科学学院人类研究伦理委员会的许可下进行。 注意：研究中的纳入标准是性别和年龄模糊不清，根据参与者在采集血液样本前对问卷的回答，临床健康。进行血液学分析以确定细胞计数并排除感染或贫血，以及C反应蛋白测试以排除供体中的炎症。 <p …

Representative Results

中性粒细胞的纯度和活力动态细胞相在试管中通过双密度梯度纯化可视化。在这些层中，对应于粒细胞的层高于1.079 g/mL密度层，与外周血单核细胞（PBMC）和红细胞的阶段不同（图1A）。通过观察与成熟中性粒细胞对应的线状细丝连接的分段细胞核的细胞，通过Wright染色验证纯化细胞的形态（图2A）。由于中性粒细胞的半衰期缩短，活力?…

Discussion

必须获得高纯度的活中性粒细胞群以诱导NET的释放，因为这些细胞的 离体 寿命有限，平均为8小时，必须在这段时间内进行所有实验。为此，理想的方法是双密度梯度，通过分离对外源性刺激更敏感的非活化细胞来优化纯化时间，与Ficoll-Histopaque梯度或葡聚糖沉降技术相比¹⁷。双密度梯度法的另一个优点是，与依赖于细胞表面抗原（例如中性粒细胞中的CD16^hi ）的高…

Materials

24 Well plate for cell culture	Corning	3526
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Pharmingen	51-668981E
96 Well plate for cell culture	Costar	3596	Flat bottom
Agitator	CRM Globe	CRM-OS1
Antibody LL37	Santa Cruz Biotechnology	sc-166770
Blood collection tubes	BD VACUTAINER	368171	K2 EDTA 7.2 mg
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Sigma-Aldrich	21878
Centrifuge	Hettich	1406-01
Coverslip	Madesa	M03-CUB-22X22	22 mm x 22 mm
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS)	Caisson	1201022
Falcon tubes 50 mL	CORNING	430829
Flow Cytometry Tubes	Miltenyi Biotec		5 mL – Without caps
FlowJo Software	BD Biosciences		Analyze flow cytometry data
Fluorescence microscope	DM 2000	LEICA
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Incubator	NUAIRE	UN-4750
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec		Flow cytometer
Microplate reader photometer	Clarkson Laboratory – CL
Microtubes 1.5 mL	Zhejiang Runlab Tech	35200N	wire snap
Minitab Software	Minitab		Statistical analysis
Needles	BD VACUTAINER	301746	Diameter 1.34 mm
Optical microscope	VELAB	VE-B50
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	Solution for density gradient
Phosphate Buffered Saline (10x)	Caisson	PBL07-500ML
Pyrex culture tubes	CORNING	CLS982025	N°9820
RPMI 1640 1x	Corning	10-104-CV	contains Glutagro
Slides	Madesa	PDI257550	22 mm x 75 mm
Trypan Blue solution 0.4%	SIGMA	T8154-100ML