אולטרסאונד ממוקד מונחה תהודה מגנטית בעוצמה גבוהה שנוצר היפרתרמיה: שיטת טיפול אפשרית במודל מורין רבדומיוסרקומה
Summary
מוצג כאן פרוטוקול לשימוש בהיפרתרמיה מבוקרת, הנוצרת על ידי אולטרסאונד ממוקד מונחה תהודה מגנטית בעוצמה גבוהה, כדי להפעיל שחרור תרופות מליפוזומים רגישים לטמפרטורה במודל עכבר rhabdomyoscoma.
Abstract
אולטרסאונד ממוקד מונחה תהודה מגנטית בעוצמה גבוהה (MRgHIFU) הוא שיטה מבוססת לייצור היפרתרמיה מקומית. בהינתן הדמיה בזמן אמת ואפנון אנרגיה אקוסטית, מודל זה מאפשר בקרת טמפרטורה מדויקת בתוך אזור מוגדר. יישומים תרמיים רבים נחקרים באמצעות טכנולוגיה לא פולשנית ובלתי מייננת זו, כגון יצירת היפרתרמיה, לשחרור תרופות מנשאים ליפוזומליים רגישים לחום. תרופות אלה יכולות לכלול כימותרפיות כגון דוקסורוביצין, שעבורן רצוי שחרור ממוקד בשל תופעות הלוואי המערכתיות המגבילות את המינון, כלומר רעילות לב. דוקסורוביצין הוא עמוד התווך לטיפול במגוון גידולים ממאירים והוא נפוץ ברבדומיוסרקומה חוזרת או חוזרת (RMS). RMS הוא הגידול החוץ-גולגולתי הנפוץ ביותר ברקמות רכות מוצקות בקרב ילדים ומבוגרים צעירים. למרות טיפול אגרסיבי ורב-מודאלי, שיעורי ההישרדות של RMS נותרו זהים במשך 30 השנים האחרונות. כדי לחקור פתרון לטיפול בצורך בלתי מסופק זה, פותח פרוטוקול ניסיוני להערכת שחרור דוקסורוביצין ליפוזומלי רגיש לחום (TLD) במודל עכבר RMS סינגני וחיסוני המשתמש ב- MRgHIFU כמקור להיפרתרמיה לשחרור תרופות.
Introduction
Rhabdomyosarcoma (RMS) הוא גידול שריר השלד הנפוץ ביותר אצל ילדים ומבוגרים צעירים1. מחלה מקומית מטופלת לעתים קרובות באמצעות טיפול רב-מודאלי, כולל כימותרפיה, קרינה מייננת וניתוח. השימוש במשטרי כימותרפיה רב-תרופתיים שכיח יותר בחולים ילדים, עם תוצאות משופרות בהשוואה לעמיתיהם הבוגרים2; עם זאת, למרות מאמצי מחקר מתמשכים, שיעור ההישרדות של 5 שנים נשאר סביב 30% בצורה האגרסיבית ביותר של המחלה 3,4. סטנדרט הטיפול הכימותרפי הוא משטר תרופות רב הכולל וינקריסטין, ציקלופוספמיד ואקטינומיצין D. במקרים של מחלה חוזרת או חוזרת, כימותרפיה חלופית משמשים, כולל סטנדרטי (חינם) doxorubicin (FD) ו ifosfamide1. בעוד שלכל הכימותרפיות הללו יש רעילות מערכתית, רעילות הלב של דוקסורוביצין מטילה מגבלת מינוןלכל החיים 5-7. כדי להגדיל את כמות התרופה המועברת לגידול ולמזער רעילות מערכתית, פותחו פורמולציות חלופיות, כולל אנקפסולציה ליפוזומלית. אלה יכולים להיות דוקסורוביצין שאינו רגיש לחום, שאושר לטיפול בסרטן השד וקרצינומה הפטוצלולרית, או דוקסורוביצין רגיש לחום, שעבורו נמשכיםניסויים קליניים 8,9,10,11,12,13. שיטות חלופיות למתן תרופות ליפוזומליות מוקפות כגון ליפוזומים רב-שלפוחיתיים וליפוזומים ממוקדי-ליגנד הוערכו ומראות הבטחה לטיפול בגידולים9. במחקר זה, לתוספת של חום יש השפעות רב-גורמיות, כולל שחרור תרופות14. השילוב של היפרתרמיה (HT) שנוצר עם אולטרסאונד ממוקד מונחה תהודה מגנטית בעוצמה גבוהה (MRgHIFU) ודוקסורוביצין ליפוזומלי רגיש לחום (TLD) הוא גישה טיפולית רב-מודאלית חדשנית לשימוש בתרופה רעילה אך יעילה זו לטיפול ב- RMS, תוך מזעור רעילות מגבילה מינון ופוטנציאל להגביר את התגובה החיסונית לגידול.
דוקסורוביצין משתחרר במהירות מ-TLD בטמפרטורות >39 מעלות צלזיוס, הרבה מעל טמפרטורת גוף האדם הממוצעת של 37 מעלות צלזיוס אך לא גבוהה מספיק כדי לגרום נזק לרקמות או אבלציה; זה מתחיל להתרחש ב 43 °C (75 °F), אבל מתרחשת מהר יותר כמו הטמפרטורות מתקרב 60 °C (60 °F)15. שיטות שונות שימשו ליצירת HT in vivo, כולל לייזרים, מיקרוגל, אבלציה בתדרי רדיו ואולטרסאונד ממוקד, שרבים מהם הם שיטות חימום פולשניות16. MRgHIFU היא שיטת חימום לא פולשנית ולא מייננת המאפשרת הגדרות טמפרטורה מדויקות ברקמת המטרה באתרה. דימות תהודה מגנטית (MR) מספק הדמיה בזמן אמת, שבה ניתן להשתמש בתוכנת מחשב, כדי לחשב מדידת תרמומטריה של הרקמה לאורך הטיפול; לאחר מכן, ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי לשלוט בטיפול האולטרסאונד בזמן אמת כדי להגיע ולשמור על נקודת טמפרטורה רצויה17. MRgHIFU נבדק בסוגי רקמות שונים וניתן להשתמש בו למגוון רחב של טיפולי טמפרטורה, החל מ- HT קל ועד אבלציה, כמו גם קלינית לטיפול מוצלח בגרורות כואבותבעצמות 18. בנוסף, הוכח כי HT גורם לציטוטוקסיות של הגידול, מווסת את ביטוי החלבונים ומשנה את התגובה החיסונית במיקרו-סביבה של הגידול 19,20,21,22. מחקר אחד שילב HT קל עם TLD, ואחריו אבלציה עם MRgHIFU, בחולדה סינרגטית R1 מודל23, וכתוצאה מכך נמק בליבת הגידול והעברת תרופות לפריפריה. באופן מסורתי, הקרנות שימשו כטיפול משלים כדי לפגוע בתאי הגידול ולהפחית את הישנות המחלה המקומית. עם זאת, השימוש בו מוגבל על ידי מינון לכל החיים ונזק מחוץ למטרה1. לכן, HT הוא ייחודי בכך שהוא יכול לגרום לחלק מאותן השפעות ללא אותן רעילות או מגבלות.
מודלים פרה-קליניים של בעלי חיים עבור RMS כוללים מודלים סינגניים של יכולת חיסונית וקסנוגרפטים שמקורם במטופלים (PDX) בפונדקאים מדוכאי חיסון. בעוד שהמודלים מדוכאי החיסון מאפשרים צמיחה של גידולים אנושיים, הם חסרים את המיקרו-סביבה המתאימה לגידול והם מוגבלים ביכולתם לחקור תגובה חיסונית24. מוטציה מפעילת FGFR4 היא סמן מבטיח לפרוגנוזה גרועה ויעד טיפולי פוטנציאלי במבוגרים ובילדים RMS 1,25. במודלים הסינגניים של RMS שפותחו במעבדת גלאדי, הגידולים מסוגלים לגדול בפונדקאי חיסוני, המפתח תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות לגידול26. מכיוון ש-HT משפיע על התגובה החיסונית, התבוננות בשינוי בתגובה החיסונית של מורין היא יתרון חשוב של מודל הגידול הזה. כדי לבחון הן את תגובת הגידול ל-TLD בהשוואה ל-FD, והן את השינוי בתגובה החיסונית של הגידול הן לכימותרפיה והן ל-HT, פותח פרוטוקול לטיפול בגידולי RMS סינגניים של מורין in vivo באמצעות MRgHIFU ו-TLD, שהוא מוקד מחקר זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שפותח כאן שימש לטיפול בגידולי גפיים אחוריות באמצעות MRgHIFU לטיפול קל ב-HT ולשחרור תרופות עטופות מליפוזומים in vivo. פרוטוקול זה נתקל במספר שלבים קריטיים במהלך מחקר הפיילוט, ואופטימיזציה של צעדים קריטיים אלה הסבירה את הצלחת הטיפול המשופרת בהשוואה למחקר הפיילוט. הראשון הוא הסרה מל…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להכיר במקורות המימון שלנו לפרויקט זה ובכוח האדם המעורב, כולל: מענק מחקר C17, מלגת בוגר קנדה, קרן הנאמנות להזדמנויות סטודנטים באונטריו וקרן ג’יימס ג’יי האמונד.
Materials
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| 1kb plus DNA Ladder | Froggabio | DM015-R500 | |
| 2x HS-Red Taq (PCR mix) | Wisent | 801-200-MM | |
| 7 Tesla MRI BioSpec | Bruker | T184931 | 70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany |
| C1000 Thermal cycler | Biorad | 1851148 | |
| Clippers | Whal Peanut | 8655 | |
| Compressed ultrasound gel | Aquaflex | HF54-004 | |
| Convection heating device | 3M Bair Hugger | 70200791401 | |
| Depiliatory cream | Nair | 61700222611 | Shopper's Drug Mart |
| DMEM | Wisent | 219-065-LK | |
| DNeasy extraction kit | Qiagen | 69504 | |
| DPBS | Wisent | 311-420-CL | |
| Drug injection system | Harvard Apparatus | PY2 70-2131 | PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump |
| Eye lubricant | Optixcare | 50-218-8442 | |
| F10 Media | Wisent | 318-050-CL | |
| FBS | Wisent | 081-105 | |
| Froggarose | FroggaBio | A87 | |
| Gel Molecular Imager | BioRad | GelDocXR | |
| Glutamax | Wisent | 609-065-EL | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Similar to this product |
| Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G) | SAI infusion | PE-20-100 | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| M25FV24C Cell line | Gladdy Lab | N/A | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 01-01-7648 | |
| Molecular Imager Gel Doc XR | Biorad | 170-8170 | |
| Mouse holder | The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine | N/A | Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm. |
| MyRun Machine | Cosmo Bio Co Ltd | CBJ-IMR-001-EX | |
| Nanodrop 8000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000-GL | |
| p53 primers | Eurofins | N/A | Custom Primers |
| PCR tubes | Diamed | SSI3131-06 | |
| Penicillin/Streptomycin | Wisent | 450-200-EL | |
| Proteus software | Pichardo lab | N/A | |
| Respiratory monitoring system | SAII | Model 1030 | MR-compatible monitoring and gating system for small animals |
| Small Bore HIFU device, LabFUS | Image Guided Therapy | N/A | LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 – 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm |
| SYBR Safe | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| TAE | Wisent | 811-540-FL | |
| Tail vein catheter (27G 0.5" ) | Terumo Medical Corp | 15253 | |
| Thermal probes | Rugged Monitoring | L201-08 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin | Wisent | 325-052-EL | |
| Ultrasound Gel | Aquasonic | PLI 01-08 |
Referências
- Skapek, S. X., et al. Rhabdomyosarcoma. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), (2019).
- Ferrari, A., et al. Impact of rhabdomyosarcoma treatment modalities by age in a population-based setting. Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 10 (3), 309-315 (2021).
- . Pediatric rhabdomyosarcoma surgery: Background, anatomy, pathophysiology Available from: https://emedicine.medscape.com/article/939156-overview#a2 (2019)
- Ognjanovic, S., Linabery, A. M., Charbonneau, B., Ross, J. A. Trends in childhood rhabdomyosarcoma incidence and survival in the United States, 1975-2005. Cancer. 115 (18), 4218-4226 (2009).
- Mulrooney, D. A., et al. Cardiac outcomes in a cohort of adult survivors of childhood and adolescent cancer: retrospective analysis of the Childhood Cancer Survivor Study cohort. BMJ. 339, (2009).
- Lipshultz, S. E., Cochran, T. R., Franco, V. I., Miller, T. L. Treatment-related cardiotoxicity in survivors of childhood cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (12), 697-710 (2013).
- Winter, S., Fasola, S., Brisse, H., Mosseri, V., Orbach, D. Relapse after localized rhabdomyosarcoma: Evaluation of the efficacy of second-line chemotherapy. Pediatric Blood & Cancer. 62 (11), 1935-1941 (2015).
- Wood, B. J., et al. Phase I study of heat-deployed liposomal doxorubicin during radiofrequency ablation for hepatic malignancies. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23 (2), 248-255 (2012).
- Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal formulations in clinical use: an updated review. Pharmaceutics. 9 (2), 12 (2017).
- Zagar, T. M., et al. Two phase I dose-escalation/pharmacokinetics studies of low temperature liposomal doxorubicin (LTLD) and mild local hyperthermia in heavily pretreated patients with local regionally recurrent breast cancer. International Journal of Hyperthermia. 30 (5), 285-294 (2014).
- . A phase I study of lyso-thermosensitive liposomal doxorubicin and MR-HIFU for pediatric refractory solid tumors Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02536183 (2019)
- PanDox: targeted doxorubicin in pancreatic tumours (PanDox). University of Oxford Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04852367 (2021)
- . Image-guided targeted doxorubicin delivery with hyperthermia to optimize loco-regional control in breast cancer (i-GO) Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03749850 (2018)
- De Vita, A., et al. Lysyl oxidase engineered lipid nanovesicles for the treatment of triple negative breast cancer. Scientific Reports. 11 (1), 5107 (2021).
- Sapareto, S. A., Dewey, W. C. Thermal dose determination in cancer therapy. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 10 (6), 787-800 (1984).
- Kok, H. P., et al. Heating technology for malignant tumors: a review. International Journal of Hyperthermia. 37 (1), 711-741 (2020).
- Kokuryo, D., Kumamoto, E., Kuroda, K. Recent technological advancements in thermometry. Advanced Drug Delivery Reviews. 163, 19-39 (2020).
- Bongiovanni, A., et al. 3-T magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound (3 T-MR-HIFU) for the treatment of pain from bone metastases of solid tumors. Support Care Cancer. 30 (7), 5737-5745 (2022).
- Seifert, G., et al. Regional hyperthermia combined with chemotherapy in paediatric, adolescent and young adult patients: current and future perspectives. Radiation Oncology. 11, 65 (2016).
- Dewhirst, M. W., Lee, C. -. T., Ashcraft, K. A. The future of biology in driving the field of hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 32 (1), 4-13 (2016).
- Dewhirst, M. W., Vujaskovic, Z., Jones, E., Thrall, D. Re-setting the biologic rationale for thermal therapy. International Journal of Hyperthermia. 21 (8), 779-790 (2005).
- Repasky, E. A., Evans, S. S., Dewhirst, M. W. Temperature matters! And why it should matter to tumor immunologists. Cancer Immunology Research. 1 (4), 210-216 (2013).
- Hijnen, N., et al. Thermal combination therapies for local drug delivery by magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), E4802-E4811 (2017).
- Shultz, L. D., et al. Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (7), 694-708 (2014).
- De Vita, A., et al. Deciphering the genomic landscape and pharmacological profile of uncommon entities of adult rhabdomyosarcomas. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11564 (2021).
- McKinnon, T., et al. Functional screening of FGFR4-driven tumorigenesis identifies PI3K/mTOR inhibition as a therapeutic strategy in rhabdomyosarcoma. Oncogene. 37 (20), 2630-2644 (2018).
- Zaporzan, B., et al. MatMRI and MatHIFU: software toolboxes for real-time monitoring and control of MR-guided HIFU. Journal of Therapeutic Ultrasound. 1, (2013).
- Dunne, M., et al. Heat-activated drug delivery increases tumor accumulation of synergistic chemotherapies. Journal of Controlled Release. 308, 197-208 (2019).
- Zhao, Y. X., Hu, X. Y., Zhong, X., Shen, H., Yuan, Y. High-intensity focused ultrasound treatment as an alternative regimen for myxofibrosarcoma. Dermatologic Therapy. 34 (2), 14816 (2021).
- Vanni, S., et al. Myxofibrosarcoma landscape: diagnostic pitfalls, clinical management and future perspectives. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 14, 17588359221093973 (2022).
