Hipertermia generada por ultrasonido focalizado de alta intensidad guiada por resonancia magnética: un método de tratamiento factible en un modelo de rabdomiosarcoma murino

Summary

Aquí se presenta un protocolo para usar hipertermia controlada, generada por ultrasonido enfocado de alta intensidad guiado por resonancia magnética, para desencadenar la liberación de fármacos de liposomas sensibles a la temperatura en un modelo de ratón rabdomiosarcoma.

Abstract

El ultrasonido focalizado de alta intensidad guiado por resonancia magnética (MRgHIFU) es un método establecido para producir hipertermia localizada. Dada la modulación de imágenes en tiempo real y la energía acústica, esta modalidad permite un control preciso de la temperatura dentro de un área definida. Se están explorando muchas aplicaciones térmicas con esta tecnología no invasiva y no ionizante, como la generación de hipertermia, para liberar medicamentos de portadores liposomales termosensibles. Estos fármacos pueden incluir quimioterapias como la doxorrubicina, para la cual se desea una liberación dirigida debido a los efectos secundarios sistémicos limitantes de la dosis, a saber, la cardiotoxicidad. La doxorrubicina es un pilar para tratar una variedad de tumores malignos y se usa comúnmente en el rabdomiosarcoma recidivante o recurrente (RMS). El RMS es el tumor extracraneal de tejido blando sólido más común en niños y adultos jóvenes. A pesar de la terapia agresiva y multimodal, las tasas de supervivencia del RMS se han mantenido iguales durante los últimos 30 años. Para explorar una solución para abordar esta necesidad no satisfecha, se desarrolló un protocolo experimental para evaluar la liberación de doxorrubicina liposomal termosensible (TLD) en un modelo de ratón RMS inmunocompetente y singénico utilizando MRgHIFU como fuente de hipertermia para la liberación del fármaco.

Introduction

El rabdomiosarcoma (RMS) es un tumor del músculo esquelético que ocurre con mayor frecuencia en niños y adultos jóvenes¹. La enfermedad localizada a menudo se trata con tratamiento multimodal, que incluye quimioterapia, radiación ionizante y cirugía. El uso de regímenes de quimioterapia con múltiples fármacos es más prevalente en pacientes pediátricos, con mejores resultados en comparación con sus contrapartes adultas²; Sin embargo, a pesar de los esfuerzos de investigación en curso, la tasa de supervivencia a 5 años se mantiene en alrededor del 30% en la forma más agresiva de la enfermedad ^3,4. El estándar de atención de quimioterapia es un régimen de múltiples fármacos que incluye vincristina, ciclofosfamida y actinomicina D. En casos de enfermedad recidivante o recidivante, se utilizan quimioterapias alternativas, incluyendo doxorrubicina (DF) estándar (libre) e ifosfamida¹. Si bien todas estas quimioterapias tienen toxicidades sistémicas, la cardiotoxicidad de la doxorrubicina impone una limitación de dosis de por vida ^5-7. Para aumentar la cantidad del fármaco administrado al tumor y minimizar la toxicidad sistémica, se han desarrollado formulaciones alternativas, incluida la encapsulación liposomal. Estos pueden ser doxorrubicina no termosensible, que ha sido aprobada para el tratamiento del cáncer de mama y el carcinoma hepatocelular, o doxorrubicina termosensible, para la cual se están realizando ensayos clínicos 8,9,10,11,12,13. Se han evaluado métodos alternativos para administrar fármacos encapsulados liposomales, como liposomas multivesiculares y liposomas dirigidos a ligandos, que son prometedores para el tratamiento de tumores⁹. En este estudio, la adición de calor tiene impactos multifactoriales, incluyendo la liberación del fármaco¹⁴. La combinación de hipertermia (TH) generada con ultrasonido focalizado de alta intensidad guiado por resonancia magnética (MRgHIFU) y doxorrubicina liposomal termosensible (TLD) es un nuevo enfoque terapéutico multimodal para usar este fármaco tóxico pero efectivo para tratar el RMS, al tiempo que minimiza la toxicidad limitante de la dosis y aumenta potencialmente la respuesta inmune al tumor.

La doxorrubicina se libera rápidamente de TLD a temperaturas >39 °C, muy por encima de la temperatura promedio del cuerpo humano de 37 ° C, pero no lo suficientemente alta como para causar daño tisular o ablación; esto comienza a ocurrir a 43 ° C, pero ocurre más rápidamente a medida que las temperaturas se acercan a 60 ° C¹⁵. Se han utilizado varios métodos para generar HT in vivo, incluyendo láseres, microondas, ablación por radiofrecuencia y ultrasonido focalizado, muchos de los cuales son métodos de calentamiento invasivos¹⁶. MRgHIFU es un método de calentamiento no invasivo y no ionizante que facilita los ajustes precisos de temperatura dentro del tejido objetivo in situ. La resonancia magnética (RM) proporciona imágenes cruciales en tiempo real, donde se puede usar software de computadora, para calcular una medición de termometría del tejido durante todo el tratamiento; Posteriormente, estos datos se pueden utilizar para controlar la terapia de ultrasonido en tiempo real para alcanzar y mantener un punto de ajuste de temperatura deseado¹⁷. MRgHIFU ha sido probado en varios tipos de tejidos y puede ser utilizado para una amplia gama de tratamientos de temperatura, desde HTA leve hasta ablación, así como clínicamente para tratar con éxito metástasis óseas dolorosas¹⁸. Además, se ha demostrado que la TH causa citotoxicidad tumoral, modula la expresión de proteínas y altera la respuesta inmune en el microambiente tumoral 19,20,21,22. Un estudio combinó TH leve con TLD, seguida de ablación con MRgHIFU, en una rata sinérgica R1 modelo²³, lo que resultó en necrosis en el núcleo tumoral y administración del fármaco a la periferia. Tradicionalmente, la radioterapia se ha utilizado como terapia complementaria para dañar las células tumorales y disminuir la recurrencia local de la enfermedad. Sin embargo, su uso está limitado por la dosificación de por vida y el daño fuera del objetivo¹. Por lo tanto, la HTA es única en el sentido de que puede causar algunos de los mismos efectos sin las mismas toxicidades o limitaciones.

Los modelos animales preclínicos para RMS incluyen modelos inmunocompetentes singénicos y xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) en huéspedes inmunocomprometidos. Mientras que los modelos inmunocomprometidos permiten el crecimiento de los tumores humanos, carecen del microambiente tumoral apropiado y están limitados en su capacidad para estudiar la respuesta inmune²⁴. La mutación activadora de FGFR4 es un marcador prometedor de mal pronóstico y una posible diana terapéutica en RMS adultos y pediátricos ^1,25. En los modelos RMS singénicos desarrollados en el laboratorio de Gladdy, los tumores son capaces de crecer en un huésped inmunocompetente, que desarrolla respuestas inmunes innatas y adaptativas al tumor²⁶. Como la TH influye en la respuesta inmune, la observación del cambio en la respuesta inmune murina es una ventaja valiosa de este modelo tumoral. Para probar tanto la respuesta tumoral a TLD en comparación con FD, como el cambio en la respuesta inmune del tumor tanto a la quimioterapia como a la TH, se desarrolló y empleó un protocolo para tratar los tumores murinos singénicos de RMS in vivo utilizando MRgHIFU y TLD, que es el foco de este estudio.

Protocol

La investigación se realizó de acuerdo con los comités de cuidado de animales con protocolos aprobados de uso de animales bajo un veterinario supervisor en las instalaciones de investigación animal del Centro de Fenogenómica (TCP) y del Centro de Recursos Animales (ARC) de la Red de Salud Universitaria (UHN). Todos los procedimientos, excluyendo el MRgHIFU, que involucran a los animales se realizaron en un gabinete de seguridad biológica (BSC) para minimizar la exposición de los animales al aire externo o infecci?…

Representative Results

Usando el protocolo de hipertermia generada por MRgHIFU, los tumores en la extremidad posterior pudieron calentarse consistentemente a la temperatura establecida deseada durante la duración del tratamiento (la Figura 4 muestra un tratamiento representativo, 10 o 20 min, n = 65). Para considerar que un tratamiento era exitoso, el ROI debía mantenerse por encima de 39 °C durante todo el tratamiento, con una variación de <6 °C a lo largo del tratamiento y sin calentamiento del tejido fuera…

Discussion

El protocolo desarrollado en la presente invención se utilizó para atacar tumores de las extremidades posteriores utilizando MRgHIFU para el tratamiento leve de TH y liberar fármacos encapsulados de liposomas in vivo. Se encontraron varios pasos críticos en este protocolo durante el estudio piloto, y la optimización de estos pasos críticos representó el éxito mejorado del tratamiento durante el estudio piloto. La primera es la eliminación completa del vello en la zona a sonicar. Cualquier atrapamiento d…

Materials

1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22363204
1kb plus DNA Ladder	Froggabio	DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix)	Wisent	801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec	Bruker	T184931	70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler	Biorad	1851148
Clippers	Whal Peanut	8655
Compressed ultrasound gel	Aquaflex	HF54-004
Convection heating device	3M Bair Hugger	70200791401
Depiliatory cream	Nair	61700222611	Shopper's Drug Mart
DMEM	Wisent	219-065-LK
DNeasy extraction kit	Qiagen	69504
DPBS	Wisent	311-420-CL
Drug injection system	Harvard Apparatus	PY2 70-2131	PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant	Optixcare	50-218-8442
F10 Media	Wisent	318-050-CL
FBS	Wisent	081-105
Froggarose	FroggaBio	A87
Gel Molecular Imager	BioRad	GelDocXR
Glutamax	Wisent	609-065-EL
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100	Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G)	SAI infusion	PE-20-100
Isoflurane	Sigma	792632
M25FV24C Cell line	Gladdy Lab	N/A
Microliter Syringe	Hamilton	01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR	Biorad	170-8170
Mouse holder	The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine	N/A	Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm.
MyRun Machine	Cosmo Bio Co Ltd	CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000-GL
p53 primers	Eurofins	N/A	Custom Primers
PCR tubes	Diamed	SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin	Wisent	450-200-EL
Proteus software	Pichardo lab	N/A
Respiratory monitoring system	SAII	Model 1030	MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS	Image Guided Therapy	N/A	LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter  25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 – 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency  2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe	ThermoFisher Scientific	S33102
TAE	Wisent	811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" )	Terumo Medical Corp	15253
Thermal probes	Rugged Monitoring	L201-08
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin	Wisent	325-052-EL
Ultrasound Gel	Aquasonic	PLI 01-08