Méthode d’électroporation pour transformer Rickettsia spp. avec un vecteur navette exprimant une protéine fluorescente dans des lignées cellulaires de tiques
Summary
L’électroporation est une méthode rapide et largement adoptée pour introduire de l’ADN exogène dans le genre Rickettsia. Ce protocole fournit une méthode d’électroporation utile pour la transformation des bactéries intracellulaires obligatoires dans le genre Rickettsia.
Abstract
Les rickettsioses sont causées par un large éventail de bactéries intracellulaires obligatoires appartenant au genre Rickettsia qui peuvent être transmises à des hôtes vertébrés par la piqûre d’arthropodes vecteurs infectés. À ce jour, les rickettsioses épidémiques émergentes ou réémergentes demeurent un risque pour la santé publique en raison de la difficulté du diagnostic, car les méthodes de diagnostic sont limitées et ne sont ni normalisées ni universellement accessibles. Un diagnostic erroné résultant d’un manque de reconnaissance des signes et symptômes peut entraîner un retard du traitement antibiotique et de mauvais résultats pour la santé. Une compréhension globale des caractéristiques de Rickettsia améliorerait finalement le diagnostic, l’évaluation et le traitement cliniques avec un meilleur contrôle et une meilleure prévention de la maladie.
Les études fonctionnelles des gènes rickettsiens sont cruciales pour comprendre leur rôle dans la pathogenèse. Cet article décrit une procédure d’électroporation de la souche Tate’s Hell de Rickettsia parkeri avec le vecteur navette pRAM18dSFA et la sélection de R. parkeri transformé en culture de cellules à tiques avec des antibiotiques (spectinomycine et streptomycine). Une méthode est également décrite pour la localisation de R. parkeri transformé dans les cellules de tiques en utilisant la microscopie confocale d’immunofluorescence, une technique utile pour vérifier la transformation dans les lignées cellulaires vectorielles. Des approches similaires conviennent également à la transformation d’autres rickettsies.
Introduction
Les rickettsioses sont causées par un large éventail de bactéries intracellulaires obligatoires appartenant au genre Rickettsia (famille des Rickettsiaceae, ordre des Rickettsiales). Le genre Rickettsia est classé en quatre grands groupes en fonction des caractéristiques phylogénétiques1,2 : le groupe de la fièvre pourprée (SFG), qui comprend les rickettsies qui causent les rickettsioses transmises par les tiques les plus graves et les plus mortelles (p. ex., Rickettsia rickettsii, l’agent causal de la fièvre pourprée des montagnes Rocheuses), le groupe typhus (TG, p. ex., Rickettsia prowazekii, l’agent du typhus épidémique), le groupe de transition (TRG, p. ex. Rickettsia felis, l’agent causal de la fièvre pourprée transmise par les puces) et le groupe ancestral (AG, p. ex. Rickettsia bellii).
Parmi les plus anciennes maladies à transmission vectorielle connues, les rickettsioses sont principalement acquises à la suite de la transmission des agents pathogènes par les piqûres d’arthropodes vecteurs infectés, notamment les tiques, les puces, les poux et les acariens 3,4. Bien que la découverte d’antibiotiques efficaces ait amélioré les résultats du traitement, les rickettsioses épidémiques émergentes et réémergentes continuent de remettre en question les stratégies traditionnelles de prévention et de contrôle. Ainsi, une compréhension globale des interactions rickettsie/hôte/vecteur établirait en fin de compte une base solide pour développer de nouvelles approches pour prévenir et guérir ces maladies anciennes.
Dans la nature, le transfert horizontal de gènes (HGT) chez les bactéries se produit par conjugaison, transduction et transformation5. La transformation bactérienne in vitro utilise ces concepts HGT, bien que la nature intracellulaire des rickettsies présente certains défis. Les conditions de croissance restreintes et les systèmes de conjugaison et de transduction mal compris chez différentes espèces de rickettsies ont empêché l’application de méthodes de conjugaison et de transduction chez les rickettsies 6,7,8. Comparé à d’autres genres bactériens intracellulaires obligatoires (par exemple, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma et Ehrlichia), le genre Rickettsia diffère en ce qui concerne les stratégies de croissance et de réplication dans le cytoplasme cellulaire, ce qui impose des défis spécifiques à la modification génétique des rickettsies en raison de leurs caractéristiques de style de vie uniques9.
Le premier obstacle à surmonter lors de la tentative de modification génétique des rickettsies est de réussir la transformation. Ainsi, la conception d’une approche réalisable avec une efficacité de transformation élevée serait extrêmement utile pour développer des outils génétiques pour les rickettsies. Ici, nous nous concentrons sur l’électroporation, une méthode de transformation largement reconnue qui a été utilisée pour introduire avec succès de l’ADN exogène dans plusieurs espèces de rickettsiae, y compris Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii et Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Cet article décrit une procédure d’électroporation de la souche Tate’s Hell de R. parkeri (accession: GCA_000965145.1) avec le vecteur navette pRAM18dSFA dérivé du plasmide AaR/SC de Rickettsia amblyommatis pRAM18 conçu pour coder mKATE, une protéine fluorescente rouge lointain, et aadA, conférant une résistance à la spectinomycine et à la streptomycine13,15,20. Les R. parkeri transformés sont viables et maintenus de manière stable dans le cadre de la sélection d’antibiotiques dans des lignées cellulaires de tiques. De plus, nous montrons que la localisation de R. parkeri transformé dans des cellules de tiques vivantes par microscopie confocale peut être utilisée pour évaluer la qualité des taux de transformation dans les lignées cellulaires vectorielles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous démontrons une méthode d’introduction d’ADN exogène codé sur le plasmide navette pRAM18dSFA dans les rickettsies par électroporation. Dans cette procédure, les rickettsies acellulaires ont été purifiées à partir de cellules hôtes, transformées avec un vecteur navette rickettsial et libérées sur les cellules de tiques pour l’infection. Une procédure d’immunofluorescence confocale pour détecter R. parkeri exprimant la protéine de fluorescence rouge dans les cellules de tiques est…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Timothy J. Kurtti et Benjamin Cull pour leurs discussions et suggestions perspicaces. Cette étude a été financée par une subvention à U.G.M. du NIH (2R01AI049424) et une subvention à U.G.M. de la Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).
Materials
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
Referências
- Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
- Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
- Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
- Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
- Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
- Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
- Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
- Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
- Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
- Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
- Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
- Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
- Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
- Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
- Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
- Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
- Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
- Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
- Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
- Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
- Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
- Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
- Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
- Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
- Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).
