Rickettsia spp.를 Tick 세포주에서 형광 단백질 발현 셔틀 벡터로 형질전환하기 위한 전기천공 방법
Summary
전기 천공은 Rickettsia 속에 외인성 DNA를 도입하기 위해 빠르고 광범위하게 채택 된 방법입니다. 이 프로토콜은 Rickettsia 속의 절대 세포 내 박테리아의 형질 전환에 유용한 전기 천공 방법을 제공합니다.
Abstract
리케차증은 감염된 절지 동물 벡터의 물기를 통해 척추 동물 숙주로 전염 될 수있는 Rickettsia 속에 속하는 광범위한 절대 세포 내 박테리아에 의해 발생합니다. 현재까지 신흥 또는 재출현 유행성 리케차증은 진단 방법이 제한적이고 표준화되거나 보편적으로 접근 할 수 없기 때문에 진단의 어려움으로 인해 공중 보건 위험으로 남아 있습니다. 징후와 증상에 대한 인식 부족으로 인한 오진은 항생제 치료가 지연되고 건강 결과가 좋지 않을 수 있습니다. 리케차 특성에 대한 포괄적 인 이해는 궁극적으로 질병의 통제 및 예방을 개선하여 임상 진단, 평가 및 치료를 향상시킬 것입니다.
리케차 유전자의 기능 연구는 병인에서의 역할을 이해하는 데 중요합니다. 이 논문은 셔틀 벡터 pRAM18dSFA를 사용하여 리케차 파케리 균주 테이트 헬의 전기천공법과 항생제(스펙티노마이신 및 스트렙토마이신)를 사용한 진드기 세포 배양에서 형질전환된 R. 파케리 의 선택을 위한 절차를 설명합니다 . 벡터 세포주에서 형질전환을 확인하는 데 유용한 기술인 공초점 면역형광 현미경을 사용하여 진드기 세포에서 형질전환된 R. parkeri 의 국소화에 대한 방법도 설명합니다. 유사한 접근법이 다른 리케차의 변형에도 적합합니다.
Introduction
리케차증은 리케차 (Rickettsiaceae 가족, 리케차 시알 레스 주문)에 속하는 광범위한 절대 세포 내 박테리아에 의해 발생합니다. Rickettsia 속은 계통 발생 특성1,2에 따라 4 개의 주요 그룹으로 분류됩니다 : 가장 심각하고 치명적인 진드기 매개 리케차증을 유발하는 리케차(예: Rickettsia rickettsii, 로키 산 홍반열의 원인균), 발진티푸스 그룹(TG, 예: Rickettsia prowazekii, 유행성 발진티푸스의 대리인), 과도기 그룹 (TRG, 예 : 리케차 펠리스, 벼룩 매개 홍 반열의 원인균) 및 조상 그룹 (AG, 예 : 리케차 벨리).
가장 오래된 알려진 벡터 매개 질병 중 리케차증은 주로 진드기, 벼룩, 이 및 진드기를 포함한 감염된 절지동물 벡터의 물기를 통해 병원체가 전염된 후 획득됩니다3,4. 효과적인 항생제의 발견으로 치료 결과가 개선되었지만 새롭게 등장하고 다시 등장하는 전염병 리케차증은 전통적인 예방 및 통제 전략에 계속 도전하고 있습니다. 따라서 리케차/숙주/벡터 상호 작용에 대한 포괄적인 이해는 궁극적으로 이러한 고대 질병을 예방하고 치료하기 위한 새로운 접근 방식을 개발하기 위한 강력한 기반을 구축할 것입니다.
자연에서 박테리아의 수평 유전자 전달 (HGT)은 접합, 형질 도입 및 형질 전환5을 통해 발생합니다. 시험관 내 박테리아 형질전환은 이러한 HGT 개념을 활용하지만 리케차의 세포 내 특성에는 몇 가지 문제가 있습니다. 리케차의 다른 종에서 제한된 성장 조건과 잘 이해되지 않은 접합 및 형질 도입 시스템은 리케차 6,7,8에서 접합 및 형질 도입 방법의 적용을 방해했습니다. 다른 절대 세포 내 박테리아 속 (예 : 클라미디아, 콕시 엘라, 아나 플라스마 및 에를리키아)과 비교하여 Rickettsia 속은 세포질 내의 성장 및 복제 전략과 관련하여 다르며, 이는 독특한 생활 방식으로 인해 리케차의 유전자 변형에 특정 문제를 부과합니다9.
리케차의 유전자 변형을 시도 할 때 극복해야 할 초기 장애물은 성공적인 형질 전환을 달성하는 것입니다. 따라서 높은 형질 전환 효율로 실현 가능한 접근법을 설계하는 것은 리케차에 대한 유전 도구를 개발하는 데 매우 중요합니다. 여기에서는 리케차 프로와제키, 리케차 티피, 리케차 코노리, 리케차 파케리, 리케차 몬타넨시스, 리케차 벨리, 리케차 공작, 리케차 부흐네리를 포함한 여러 종의 리케차에 외인성 DNA를 성공적으로 도입하는 데 사용된 널리 알려진 형질전환 방법인 전기천공에 중점을 둡니다. 10,11,12 ,13,14,15,16.
이 논문은 원적색 형광 단백질인 mKATE와 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신 내성13,15,20을 부여하도록 설계된 리케차 약시 균주 AaR/SC 플라스미드 pRAM18에서 파생된 셔틀 벡터 pRAM18dSFA를 사용하여 R. parkeri 균주 Tate’s Hell(기탁: GCA_000965145.1)의 전기천공 절차를 설명합니다. 형질전환된 R. 파케리는 진드기 세포주에서 항생제 선택 하에 생존 가능하고 안정적으로 유지된다. 또한 컨포칼 현미경을 통해 살아있는 진드기 세포에서 형질전환된 R. parkeri의 국소화를 사용하여 벡터 세포주의 형질전환 속도를 평가할 수 있음을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 전기 천공을 사용하여 셔틀 플라스미드 pRAM18dSFA에 암호화된 외인성 DNA를 리케차에 도입하는 방법을 시연합니다. 이 절차에서, 무세포 리케차는 숙주 세포로부터 정제되고, 리케차 셔틀 벡터로 형질전환되고, 감염을 위해 진드기 세포 상으로 방출되었다. 또한 진드기 세포에서 적색 형광 단백질 발현 R. parkeri 를 검출하기 위한 공초점 면역형광 절차가 설명되어 있습니다. 유사한…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
통찰력 있는 토론과 제안에 대해 Timothy J. Kurtti와 Benjamin Cull에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH (2R01AI049424)의 U.G.M.에 대한 보조금과 미네소타 농업 실험소 (MIN-17-078)의 U.G.M. 보조금으로 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
Referências
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