طريقة التثقيب الكهربائي لتحويل الريكتسيا spp. باستخدام ناقل مكوك يعبر عن البروتين الفلوري في خطوط خلايا القراد
Summary
التثقيب الكهربائي هو طريقة سريعة ومعتمدة على نطاق واسع لإدخال الحمض النووي الخارجي في جنس Rickettsia. يوفر هذا البروتوكول طريقة تثقيب كهربائي مفيدة لتحويل البكتيريا داخل الخلايا الملزمة في جنس Rickettsia.
Abstract
تحدث الريكتسيات بسبب مجموعة واسعة من البكتيريا داخل الخلايا الملزمة التي تنتمي إلى جنس الريكتسيا والتي يمكن أن تنتقل إلى مضيفات الفقاريات من خلال لدغة ناقلات المفصليات المصابة. حتى الآن ، لا تزال الريكتسيات الوبائية الناشئة أو التي تعاود الظهور تشكل خطرا على الصحة العامة بسبب صعوبة التشخيص ، حيث أن طرق التشخيص محدودة وغير موحدة أو متاحة عالميا. قد يؤدي التشخيص الخاطئ الناتج عن عدم التعرف على العلامات والأعراض إلى تأخر العلاج بالمضادات الحيوية ونتائج صحية سيئة. إن الفهم الشامل لخصائص الريكتسيا من شأنه أن يحسن في النهاية التشخيص السريري والتقييم والعلاج مع تحسين السيطرة على المرض والوقاية منه.
الدراسات الوظيفية لجينات الريكتسية ضرورية لفهم دورها في التسبب في المرض. تصف هذه الورقة إجراء للتثقيب الكهربائي لسلالة ريكتسيا باركيري Tate’s Hell باستخدام ناقل المكوك pRAM18dSFA واختيار R. parkeri المتحول في زراعة خلايا القراد بالمضادات الحيوية (spectinomycin و streptomycin). تم وصف طريقة أيضا لتوطين R. parkeri المحول في خلايا القراد باستخدام الفحص المجهري المناعي البؤري ، وهي تقنية مفيدة للتحقق من التحول في خطوط الخلايا المتجهة. مناهج مماثلة هي أيضا مناسبة لتحويل rickettsiae الأخرى.
Introduction
تحدث الريكتسيات بسبب مجموعة واسعة من البكتيريا داخل الخلايا الملزمة التي تنتمي إلى جنس الريكتسيا (عائلة Rickettsiaceae ، رتبة Rickettsiales). يصنف جنس الريكتسيا إلى أربع مجموعات رئيسية بناء على الخصائص التطورية 1,2: مجموعة الحمى المبقعة (SFG) ، والتي تحتوي على تلك الريكتسيا التي تسبب الريكتسيات الأكثر شدة وفتكا التي تنقلها القراد (على سبيل المثال ، Rickettsia rickettsii ، العامل المسبب لحمى الجبال الصخرية المبقعة) ، مجموعة التيفوس (TG ، على سبيل المثال ، Rickettsia prowazekii ، عامل التيفوس الوبائي) ، المجموعة الانتقالية (TRG ، على سبيل المثال ، Rickettsia felis ، العامل المسبب للحمى المبقعة التي تنقلها البراغيث) ، ومجموعة الأجداد (AG ، على سبيل المثال ، Rickettsia bellii).
من بين أقدم الأمراض المعروفة المنقولة بالنواقل ، يتم الحصول على الريكتسيات بشكل أساسي بعد انتقال مسببات الأمراض من خلال لدغات ناقلات المفصليات المصابة ، بما في ذلك القراد والبراغيث والقمل والعث 3,4. على الرغم من أن اكتشاف المضادات الحيوية الفعالة قد حسن نتائج العلاج ، إلا أن الريكتسيات الوبائية الناشئة والمعاودة الظهور لا تزال تشكل تحديا لاستراتيجيات الوقاية والمكافحة التقليدية. وبالتالي ، فإن الفهم الشامل لتفاعلات الريكتسيا / المضيف / الناقل من شأنه أن يضع في النهاية أساسا قويا لتطوير مناهج جديدة للوقاية من هذه الأمراض القديمة وعلاجها.
في الطبيعة ، يحدث نقل الجينات الأفقي (HGT) في البكتيريا من خلال الاقتران والنقل والتحول5. يستخدم التحول البكتيري في المختبر مفاهيم HGT هذه ، على الرغم من أن الطبيعة داخل الخلايا للريكتسيا تمثل بعض التحديات. حالت ظروف النمو المقيدة وأنظمة الاقتران والتحويل غير المفهومة بشكل جيد في أنواع مختلفة من الريكتسيا دون تطبيق طرق الاقتران والتحويل في الريكتسيا6،7،8. بالمقارنة مع الأجناس البكتيرية الأخرى داخل الخلايا (على سبيل المثال ، الكلاميديا ، Coxiella ، Anaplasma ، و Ehrlichia) ، يختلف جنس Rickettsia فيما يتعلق باستراتيجيات النمو والتكرار داخل سيتوبلازم الخلية ، مما يفرض تحديات محددة على التعديل الوراثي للريكتسيا بسبب ميزات نمط الحياة الفريدة9.
العقبة الأولية التي يجب التغلب عليها عند محاولة التعديل الوراثي للريكتسيا هي تحقيق تحول ناجح. وبالتالي ، فإن تصميم نهج عملي بكفاءة تحويل عالية سيكون ذا قيمة كبيرة لتطوير أدوات وراثية للريكتسيا. هنا ، نركز على التثقيب الكهربائي ، وهي طريقة تحويل معترف بها على نطاق واسع تم استخدامها لإدخال الحمض النووي الخارجي بنجاح في العديد من أنواع الريكتسيا ، بما في ذلك ريكتسيا برووازيكي ، ريكتسيا تيفي ، ريكتسيا كونوري ، ريكتسيا باركيري ، ريكتسيا مونتانينسيس ، ريكتسيا بيلي ، ريكتسيا بيكوكي ، وريكتسيا بوخنيري10، 11،12 ، 13،14،15،16.
تصف هذه الورقة إجراء للتثقيب الكهربائي لسلالة R. parkeri Tate’s Hell (الانضمام: GCA_000965145.1) باستخدام ناقل المكوك pRAM18dSFA المشتق من سلالة Rickettsia amblyommatis AaR / SC plasmid pRAM18 المصممة لتشفير mKATE ، وهو بروتين فلوري أحمر بعيد ، و aadA ، يمنح مقاومة سبكتينومايسين والستربتومايسين13،15،20. R. parkeri المحولة قابلة للحياة ويتم الحفاظ عليها بثبات تحت اختيار المضادات الحيوية في خطوط خلايا القراد. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر أنه يمكن استخدام توطين R. parkeri المحول في خلايا القراد الحية عبر الفحص المجهري متحد البؤر لتقييم جودة معدلات التحول في خطوط الخلايا المتجهة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، نوضح طريقة لإدخال الحمض النووي الخارجي المشفر على المكوك البلازميد pRAM18dSFA في الريكتسيا باستخدام التثقيب الكهربائي. في هذا الإجراء ، تم تنقية الريكتسيا الخالية من الخلايا من الخلايا المضيفة ، وتحويلها باستخدام ناقل مكوك ريكتسي ، وإطلاقها على خلايا القراد للعدوى. يوصف أيضا إجراء مضان…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر تيموثي ج. كورتي وبنيامين كول على مناقشاتهما واقتراحاتهما الثاقبة. تم دعم هذه الدراسة ماليا بمنحة إلى U.G.M. من المعاهد الوطنية للصحة (2R01AI049424) ومنحة إلى U.G.M. من محطة مينيسوتا للتجارب الزراعية (MIN-17-078).
Materials
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
Referências
- Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
- Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
- Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
- Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
- Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
- Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
- Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
- Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
- Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
- Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
- Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
- Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
- Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
- Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
- Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
- Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
- Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
- Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
- Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
- Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
- Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
- Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
- Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
- Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
- Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).
