Een elektroporatiemethode om Rickettsia spp. te transformeren met een fluorescerende eiwitexpressie shuttlevector in tekencellijnen
Summary
Elektroporatie is een snelle, breed toegepaste methode voor het introduceren van exogene DNA in het geslacht Rickettsia. Dit protocol biedt een bruikbare elektroporatiemethode voor de transformatie van obligate intracellulaire bacteriën in het geslacht Rickettsia.
Abstract
Rickettsioses worden veroorzaakt door een breed scala aan obligate intracellulaire bacteriën die behoren tot het geslacht Rickettsia en die kunnen worden overgedragen op gewervelde gastheren door de beet van geïnfecteerde geleedpotige vectoren. Tot op heden blijven opkomende of opnieuw opkomende epidemische rickettsioses een risico voor de volksgezondheid vanwege de moeilijkheid bij de diagnose, omdat diagnostische methoden beperkt en niet gestandaardiseerd of universeel toegankelijk zijn. Verkeerde diagnose als gevolg van een gebrek aan herkenning van de tekenen en symptomen kan leiden tot vertraagde antibioticabehandeling en slechte gezondheidsresultaten. Een uitgebreid begrip van Rickettsia-kenmerken zou uiteindelijk de klinische diagnose, beoordeling en behandeling verbeteren met verbeterde controle en preventie van de ziekte.
Functionele studies van rickettsiale genen zijn cruciaal voor het begrijpen van hun rol in pathogenese. Dit artikel beschrijft een procedure voor de elektroporatie van de Rickettsia parkeri stam Tate’s Hell met de shuttle vector pRAM18dSFA en de selectie van getransformeerde R. parkeri in tekencelkweek met antibiotica (spectinomycine en streptomycine). Er wordt ook een methode beschreven voor de lokalisatie van getransformeerde R. parkeri in tekencellen met behulp van confocale immunofluorescentiemicroscopie, een nuttige techniek voor het controleren van transformatie in vectorcellijnen. Soortgelijke benaderingen zijn ook geschikt voor de transformatie van andere rickettsiae.
Introduction
Rickettsioses worden veroorzaakt door een breed scala aan obligate intracellulaire bacteriën die behoren tot het geslacht Rickettsia (familie Rickettsiaceae, orde Rickettsiales). Het geslacht Rickettsia wordt ingedeeld in vier grote groepen op basis van fylogenetische kenmerken 1,2: de spotted fever-groep (SFG), die die rickettsiae bevat die de meest ernstige en fatale door teken overgedragen rickettsiosen veroorzaken (bijv. Rickettsia rickettsii, de veroorzaker van Rocky Mountain Spotted Fever), de tyfusgroep (TG, bijvoorbeeld Rickettsia prowazekii, de verwekker van epidemische tyfus), de overgangsgroep (TRG, bijv. Rickettsia felis, de veroorzaker van door vlooien overgedragen gevlekte koorts) en de voorouderlijke groep (AG, bijv. Rickettsia bellii).
Onder de oudste bekende door vectoren overgedragen ziekten worden rickettsioses voornamelijk verkregen na overdracht van de pathogenen door de beten van geïnfecteerde geleedpotige vectoren, waaronder teken, vlooien, luizen en mijten 3,4. Hoewel de ontdekking van effectieve antibiotica de behandelingsresultaten verbeterde, blijven opkomende en opnieuw opkomende epidemische rickettsioses traditionele preventie- en controlestrategieën uitdagen. Een uitgebreid begrip van rickettsia / gastheer / vectorinteracties zou uiteindelijk een sterke basis leggen voor het ontwikkelen van nieuwe benaderingen om deze oude ziekten te voorkomen en te genezen.
In de natuur vindt horizontale genoverdracht (HGT) in bacteriën plaats door conjugatie, transductie en transformatie5. In vitro bacteriële transformatie maakt gebruik van deze HGT-concepten, hoewel de intracellulaire aard van rickettsiae enkele uitdagingen met zich meebrengt. De beperkte groeiomstandigheden en slecht begrepen conjugatie- en transductiesystemen bij verschillende soorten rickettsiae hebben de toepassing van conjugatie- en transductiemethoden in rickettsiae 6,7,8 verhinderd. In vergelijking met andere obligate intracellulaire bacteriële geslachten (bijv. Chlamydia, Coxiella, Anaplasma pt Ehrlichia), verschilt het geslacht Rickettsia met betrekking tot de groei- en replicatiestrategieën binnen het celcytoplasma, wat specifieke uitdagingen oplegt aan de genetische modificatie van rickettsiae vanwege hun unieke levensstijlkenmerken9.
De eerste hindernis die moet worden overwonnen bij het proberen van de genetische modificatie van rickettsiae is het bereiken van een succesvolle transformatie. Het ontwerpen van een haalbare aanpak met een hoge transformatie-efficiëntie zou dus uiterst waardevol zijn voor het ontwikkelen van genetische hulpmiddelen voor rickettsiae. Hier richten we ons op elektroporatie, een algemeen erkende transformatiemethode die is gebruikt om exogene DNA met succes te introduceren in verschillende soorten rickettsiae, waaronder Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii pt Rickettsia buchneri 10,11,12 ,13,14,15,16.
Dit artikel beschrijft een procedure voor de elektroporatie van de R. parkeri-stam Tate’s Hell (toetreding: GCA_000965145.1) met de shuttlevector pRAM18dSFA afgeleid van de Rickettsia amblyommatis-stam AaR / SC plasmid pRAM18 ontworpen om mKATE, een verrood fluorescerend eiwit, en aadA te coderen, waardoor spectinomycine en streptomycineresistentie 13,15,20 krijgen. Getransformeerde R. parkeri zijn levensvatbaar en stabiel onderhouden onder antibioticaselectie in tekencellijnen. Daarnaast laten we zien dat de lokalisatie van getransformeerde R. parkeri in levende tekencellen via confocale microscopie kan worden gebruikt om de kwaliteit van transformatiesnelheden in vectorcellijnen te beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier demonstreren we een methode voor het introduceren van exogene DNA gecodeerd op de shuttle plasmid pRAM18dSFA in rickettsiae met behulp van elektroporatie. In deze procedure werden celvrije rickettsiae gezuiverd uit gastheercellen, getransformeerd met een rickettsial shuttle vector en vrijgegeven op tekencellen voor infectie. Ook beschreven is een confocale immunofluorescentieprocedure om rode fluorescentie-eiwit-expresserende R. parkeri in tekencellen te detecteren. Vergelijkbare methoden zijn van toepassin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Timothy J. Kurtti en Benjamin Cull voor hun inzichtelijke discussies en suggesties. Deze studie werd financieel ondersteund door een subsidie aan U.G.M. van de NIH (2R01AI049424) en een subsidie aan U.G.M. van het Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).
Materials
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
Referências
- Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
- Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
- Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
- Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
- Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
- Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
- Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
- Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
- Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
- Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
- Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
- Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
- Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
- Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
- Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
- Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
- Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
- Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
- Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
- Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
- Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
- Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
- Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
- Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
- Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).
