Um método de eletroporação para transformar Rickettsia spp. com um vetor shuttle fluorescente de expressão de proteínas em linhagens celulares de carrapatos
Summary
A eletroporação é um método rápido e amplamente adotado para a introdução de DNA exógeno no gênero Rickettsia. Este protocolo fornece um método de eletroporação útil para a transformação de bactérias intracelulares obrigatórias no gênero Rickettsia.
Abstract
As rickettsioses são causadas por uma ampla gama de bactérias intracelulares obrigatórias pertencentes ao gênero Rickettsia que podem ser transmitidas aos hospedeiros vertebrados através da picada de vetores artrópodes infectados. Até o momento, as rickettsioses epidêmicas emergentes ou reemergentes continuam sendo um risco para a saúde pública devido à dificuldade no diagnóstico, pois os métodos diagnósticos são limitados e não padronizados ou universalmente acessíveis. O diagnóstico errôneo resultante da falta de reconhecimento dos sinais e sintomas pode resultar em atraso no tratamento com antibióticos e maus resultados de saúde. Uma compreensão abrangente das características da Rickettsia acabaria por melhorar o diagnóstico clínico, a avaliação e o tratamento com melhor controle e prevenção da doença.
Estudos funcionais de genes rickettsianos são cruciais para a compreensão de seu papel na patogênese. Este trabalho descreve um procedimento para a eletroporação da cepa Tate’s Hell de Rickettsia parkeri com o vetor shuttle pRAM18dSFA e a seleção de R. parkeri transformado em cultura de células de carrapatos com antibióticos (espectromicina e estreptomicina). Um método também é descrito para a localização de R. parkeri transformado em células de carrapatos usando microscopia de imunofluorescência confocal, uma técnica útil para verificar a transformação em linhagens celulares vetoriais. Abordagens semelhantes também são adequadas para a transformação de outras rickettsiae.
Introduction
Rickettsioses são causadas por uma ampla gama de bactérias intracelulares obrigatórias que pertencem ao gênero Rickettsia (família Rickettsiaceae, ordem Rickettsiales). O gênero Rickettsia é classificado em quatro grupos principais com base em características filogenéticas1,2: o grupo da febre maculosa (SFG), que contém as rickettsias que causam as rickettsioses transmitidas por carrapatos mais graves e fatais (por exemplo, Rickettsia rickettsii, o agente causador da febre maculosa das Montanhas Rochosas), o grupo do tifo (TG, por exemplo, Rickettsia prowazekii, o agente do tifo epidêmico), o grupo de transição (TRG, por exemplo, Rickettsia felis, o agente causador da febre maculosa transmitida por pulgas) e o grupo ancestral (AG, por exemplo, Rickettsia bellii).
Entre as mais antigas doenças transmitidas por vetores conhecidas, as rickettsioses são adquiridas principalmente após a transmissão dos patógenos através das picadas de vetores artrópodes infectados, incluindo carrapatos, pulgas, piolhos e ácaros 3,4. Embora a descoberta de antibióticos eficazes tenha melhorado os resultados do tratamento, as rickettsioses epidêmicas emergentes e reemergentes continuam a desafiar as estratégias tradicionais de prevenção e controle. Assim, uma compreensão abrangente das interações rickettsia / hospedeiro / vetor acabaria por estabelecer uma base sólida para o desenvolvimento de novas abordagens para prevenir e curar essas doenças antigas.
Na natureza, a transferência horizontal de genes (HGT) em bactérias ocorre por meio de conjugação, transdução e transformação5. A transformação bacteriana in vitro utiliza esses conceitos de HGT, embora a natureza intracelular das rickettsias apresente alguns desafios. As condições restritas de crescimento e os sistemas de conjugação e transdução pouco compreendidos em diferentes espécies de rickettsiae têm impedido a aplicação de métodos de conjugação e transdução em rickettsiae 6,7,8. Comparado com outros gêneros bacterianos intracelulares obrigatórios (por exemplo, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma e Ehrlichia), o gênero Rickettsia difere no que diz respeito às estratégias de crescimento e replicação dentro do citoplasma celular, o que impõe desafios específicos à modificação genética das rickettsias devido às suas características únicas de estilo de vida9.
O obstáculo inicial a ser superado ao tentar a modificação genética das rickettsias é alcançar uma transformação bem-sucedida. Assim, projetar uma abordagem viável com alta eficiência de transformação seria extremamente valioso para o desenvolvimento de ferramentas genéticas para rickettsias. Aqui, nos concentramos na eletroporação, um método de transformação amplamente reconhecido que tem sido usado para introduzir DNA exógeno com sucesso em várias espécies de rickettsiae, incluindo Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii e Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Este trabalho descreve um procedimento para a eletroporação da cepa de R. parkeri Tate’s Hell (acesso: GCA_000965145.1) com o vetor shuttle pRAM18dSFA derivado do plasmídeo AaR/SC pRAM18 da cepa Rickettsia amblyommatis projetado para codificar mKATE, uma proteína fluorescente de vermelho distante, e aadA, conferindo resistência à espectromicina e estreptomicina13,15,20. R. parkeri transformados são viáveis e mantidos de forma estável sob seleção de antibióticos em linhagens celulares de carrapatos. Além disso, mostramos que a localização de R. parkeri transformado em células vivas de carrapatos via microscopia confocal pode ser usada para avaliar a qualidade das taxas de transformação em linhagens celulares vetoriais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, demonstramos um método para introduzir DNA exógeno codificado no plasmídeo pRAM18dSFA em rickettsias usando eletroporação. Neste procedimento, as rickettsias livres de células foram purificadas a partir de células hospedeiras, transformadas com um vetor de transporte de rickettsias e liberadas em células de carrapatos para infecção. Também é descrito um procedimento de imunofluorescência confocal para detectar R. parkeri que expressa proteína de fluorescência vermelha em células de carrapat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Timothy J. Kurtti e Benjamin Cull por suas discussões e sugestões perspicazes. Este estudo foi apoiado financeiramente por uma doação para a U.G.M. do NIH (2R01AI049424) e uma subvenção para a U.G.M. da Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).
Materials
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
Referências
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