L’elettroporazione è un metodo rapido e ampiamente adottato per introdurre DNA esogeno nel genere Rickettsia. Questo protocollo fornisce un utile metodo di elettroporazione per la trasformazione di batteri intracellulari obbligati nel genere Rickettsia.
Le rickettsiosi sono causate da una vasta gamma di batteri intracellulari obbligati appartenenti al genere Rickettsia che possono essere trasmessi agli ospiti vertebrati attraverso il morso di vettori artropodi infetti. Ad oggi, le rickettsiosi epidemiche emergenti o riemergenti rimangono un rischio per la salute pubblica a causa della difficoltà nella diagnosi, poiché i metodi diagnostici sono limitati e non standardizzati o universalmente accessibili. Una diagnosi errata derivante dalla mancanza di riconoscimento dei segni e dei sintomi può causare un trattamento antibiotico ritardato e scarsi risultati di salute. Una comprensione completa delle caratteristiche della rickettsia migliorerebbe in definitiva la diagnosi clinica, la valutazione e il trattamento con un migliore controllo e prevenzione della malattia.
Gli studi funzionali dei geni rickettsiali sono cruciali per comprendere il loro ruolo nella patogenesi. Questo articolo descrive una procedura per l’elettroporazione del ceppo di Rickettsia parkeri Tate’s Hell con il vettore shuttle pRAM18dSFA e la selezione di R. parkeri trasformato in coltura di cellule di zecca con antibiotici (spectinomicina e streptomicina). Viene anche descritto un metodo per la localizzazione di R. parkeri trasformato in cellule di zecche utilizzando la microscopia a immunofluorescenza confocale, una tecnica utile per controllare la trasformazione in linee cellulari vettoriali. Approcci simili sono adatti anche per la trasformazione di altre rickettsiae.
Le rickettsiosi sono causate da una vasta gamma di batteri intracellulari obbligati che appartengono al genere Rickettsia (famiglia Rickettsiaceae, ordine Rickettsiales). Il genere Rickettsia è classificato in quattro gruppi principali basati sulle caratteristiche filogenetiche1,2: il gruppo della febbre maculata (SFG), che contiene quelle rickettsiae che causano le rickettsiosi trasmesse dalle zecche più gravi e fatali (ad esempio, Rickettsia rickettsii, l’agente eziologico della febbre maculata delle Montagne Rocciose), il gruppo tifo (TG, ad esempio, Rickettsia prowazekii, l’agente del tifo epidemico), il gruppo di transizione (TRG, ad esempio, Rickettsia felis, l’agente eziologico della febbre maculata trasmessa dalle pulci) e il gruppo ancestrale (AG, ad esempio, Rickettsia bellii).
Tra le più antiche malattie trasmesse da vettori conosciute, le rickettsiosi sono acquisite principalmente in seguito alla trasmissione dei patogeni attraverso i morsi di vettori di artropodi infetti, tra cui zecche, pulci, pidocchi e acari 3,4. Sebbene la scoperta di antibiotici efficaci abbia migliorato i risultati del trattamento, le rickettsiosi epidemiche emergenti e riemergenti continuano a sfidare le tradizionali strategie di prevenzione e controllo. Pertanto, una comprensione completa delle interazioni rickettsia / ospite / vettore stabilirebbe in definitiva una solida base per lo sviluppo di nuovi approcci per prevenire e curare queste antiche malattie.
In natura, il trasferimento genico orizzontale (HGT) nei batteri avviene attraverso la coniugazione, la trasduzione e la trasformazione5. La trasformazione batterica in vitro utilizza questi concetti di HGT, sebbene la natura intracellulare delle rickettsiae presenti alcune sfide. Le condizioni di crescita limitate e i sistemi di coniugazione e trasduzione poco conosciuti in diverse specie di rickettsiae hanno impedito l’applicazione di metodi di coniugazione e trasduzione nelle rickettsiae 6,7,8. Rispetto ad altri generi batterici intracellulari obbligati (ad esempio, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma ed Ehrlichia), il genere Rickettsia differisce per quanto riguarda le strategie di crescita e replicazione all’interno del citoplasma cellulare, che impone sfide specifiche alla modificazione genetica delle rickettsiae a causa delle loro caratteristiche uniche dello stile di vita9.
L’ostacolo iniziale da superare quando si tenta la modificazione genetica delle rickettsiae è quello di ottenere una trasformazione di successo. Pertanto, progettare un approccio fattibile con un’elevata efficienza di trasformazione sarebbe estremamente prezioso per lo sviluppo di strumenti genetici per le rickettsiae. Qui, ci concentriamo sull’elettroporazione, un metodo di trasformazione ampiamente riconosciuto che è stato utilizzato per introdurre con successo il DNA esogeno in diverse specie di rickettsiae, tra cui Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii e Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Questo articolo descrive una procedura per l’elettroporazione del ceppo di R. parkeri Tate’s Hell (accession: GCA_000965145.1) con il vettore shuttle pRAM18dSFA derivato dal plasmide Rickettsia amblyommatis AaR/SC pRAM18 progettato per codificare mKATE, una proteina fluorescente di colore rosso lontano, e aadA, conferendo resistenza alla spectinomicina e alla streptomicina13,15,20. R. parkeri trasformato sono vitali e stabilmente mantenuti sotto selezione antibiotica in linee cellulari di zecche. Inoltre, dimostriamo che la localizzazione di R. parkeri trasformato in cellule di zecche vive tramite microscopia confocale può essere utilizzata per valutare la qualità dei tassi di trasformazione in linee cellulari vettoriali.
Qui, dimostriamo un metodo per introdurre DNA esogeno codificato sul plasmide shuttle pRAM18dSFA nelle rickettsiae utilizzando l’elettroporazione. In questa procedura, le rickettsiae prive di cellule sono state purificate dalle cellule ospiti, trasformate con un vettore navetta rickettsial e rilasciate sulle cellule delle zecche per l’infezione. Viene inoltre descritta una procedura di immunofluorescenza confocale per rilevare R. parkeri che esprime proteine di fluorescenza rossa nelle cellule delle zecche. Meto…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Timothy J. Kurtti e Benjamin Cull per le loro discussioni e suggerimenti perspicaci. Questo studio è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione a U.G.M. dal NIH (2R01AI049424) e una sovvenzione a U.G.M. dalla Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |